Tài liệu Nghiên cứu chiết tách và chuyển hóa một số dẫn xuất của Axit Asiatic từ cây rau má [Centella Asiatica (L.) Urban]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG UNG THỊ NHƯ TRUYỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ CHUYỂN HOÁ MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA AXIT ASIATIC TỪ CÂY RAU MÁ [Centella asiatica (L.) Urban] Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60 44 27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - 2012 Công trình ñược hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH. TRẦN VĂN SUNG Phản biện 1 : PGS.TS. LÊ THỊ LIÊN THANH Phản biện 2 : PGS.TS. LÊ TỰ HẢI Luận văn ñã ñược bảo vệ trước hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 14 tháng 11 năm 2012. Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin – Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại Học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trong thế giới hiện ñại, công nghiệp phát triển kéo theo nhiều vấn ñề về môi trường, sinh thái và sức khoẻ con người. Mô hình bệnh tật vì thế cũng ngày càng phức tạp hơn. Gần ñây thế giới luôn phải ñối mặt với những dịch bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành ñại dịch ở quy mô toàn cầu. Có thể lấy một số ví dụ ñiển hình như HIV/AIDS, ung thư, viêm ñường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, tim mạch v.v.... Thực tế ñó ñã thúc ñẩy chúng ta luôn luôn phải tìm ra các thuốc chữa bệnh mới, có hiệu quả cao hơn, tác dụng chọn lọc hơn và giá thành rẻ hơn. Một trong những con ñường hữu hiệu ñể phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm năng, có thể phát triển thành thuốc chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng là ñi từ các hợp chất thiên nhiên. Các hợp chất thiên nhiên ñã trải qua hàng triệu năm tiến hóa, nó tương ñối phù hợp với cơ thể sống, ít ñộc hơn và thân thiện với môi trường. Người ta có thể sử dụng các hợp chất thiên nhiên một cách trực tiếp ñể làm thuốc, hoặc sử dụng làm các mô hình ñể nghiên cứu tổng hợp các thuốc mới. Cây rau má là một trong những cây thuốc ñược sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở các nước trong khu vực ñông Á như: Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Sri lanka, Việt Nam…, do ñó ñã thu hút ñược rất nhiều sự chú ý của các nhà hóa học. Các nghiên cứu thử nghiệm trong ống nghiệm về các dịch chiết của cây rau má trong CHCl3 và etanol 95%, ñã cho thấy các dịch chiết này ñều có các hoạt tính sinh học ñáng chú ý như: hoạt tính kháng viêm, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính chống u và có tác dụng bảo vệ gan. Nguồn rau má mọc tự nhiên ở Việt Nam khá dồi dào. Tuy vậy, cây chỉ ñược khai thác và sử dụng tại chỗ, chưa trở thành mặt hàng thương mại hóa [1]. Thành phần hóa học chính của cây rau má gồm các hợp chất triterpen và triterpen glucosid như axitasiatic, asiaticosid, axitmadecassic, madecassoid, irahmosid, brahminosid. Ngoài 2 ra cây rau má còn chứa tinh dầu với mùi thơm ñặc trưng, các hợp chất polyacetylen, flavonoid, vitaminC, ancaloid và oligosacharid [1, 17]. Từ những lí do trên trong bản luận văn này chúng tôi ñặt nhiệm vụ “nghiên cứu chiết tách và chuyển hoá một số dẫn xuất của axit asiatic từ cây rau má [Centella asiatica (L.) urban] “ 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Chiết tách và tinh chế axit asiatic từ cây rau má Việt Nam - Chuyển hoá một số dẫn xuất - Thăm dò hoạt tính sinh học + Hoạt tính gây ñộc tế bào + Thăm dò hoạt tính sinh học. 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Tách, tinh chế axit asiatic từ dịch chiết EtOH của cây rau má. - Tổng hợp các dẫn xuất của axit asiatic. - Thử hoạt tính sinh học của các dẫn xuất sạch thu ñược. 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4.1. Chiết tách axit asiatic trong cây rau má - Chiết tách và tinh chế axit asiatic. - Định lượng axit asiatic. 4.2. Phương pháp tổng hợp hữu cơ Các phản ứng ñược thực hiện bằng các phương pháp tổng hợp hữu cơ cơ bản như phương pháp khử, phương pháp oxi hóa, phương pháp ankyl hóa, phương pháp axyl hóa, phương pháp thế,... 4.3. Phương pháp sắc ký bản mỏng theo dõi quá trình phản ứng Phương pháp sắc ký lớp mỏng ñược sử dụng ñể giám sát tiến trình xảy ra của các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng. 3 4.4. Phương pháp phân lập và tinh chế Các hợp chất sau phản ứng ñược phân lập và tinh chế bằng các phương pháp chiết, phương pháp sắc ký cột silicagel, phương pháp kết tinh,... 4.5. Phương pháp xác ñịnh cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ Các chất tinh khiết sau khi ñược phân lập và tinh chế sẽ ñược xác ñịnh các hằng số lý hóa ñặc trưng như: màu sắc, nhiệt ñộ nóng chảy... Sau ñó tiến hành ghi các phổ như: - Phổ hồng ngoại (FT-IR) ñối với chất rắn ñược ño dưới dạng viên nén KBr, ñối với chất lỏng ñược ño ở dạng màng mỏng (film). - Phổ khối (ESI-MS) ñược ghi trong dung môi CHCl3 hoặc CH3OH. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều và 2 chiều sử dụng chất nội chuẩn là TMS (δ = 0 ppm), dung môi CDCl3 hoặc DMSO-d6 ñược ghi ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và ở tần số 125 MHz cho phổ 13C-NMR. Cấu trúc của các hợp chất ñược xác ñịnh bằng sự kết hợp các phương pháp phổ và so sánh tài liệu. 4.6. Phương pháp sinh học Thăm dò hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp ñược tại phòng thử hoạt tính của Viện Hoá học. 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Từ các kết quả nghiên cứu, luận văn ñã thu ñược một số kết quả với những ñóng góp thiết thực sau: - Đã xác ñịnh ñược các ñiều kiện tối ưu ñể thực hiện qui trình chiết, tách axit asiatic và axit madecassic từ cây rau má. - Từ dịch chiết EtOH của rau má ñã phân lập ñược 3 chất sạch - Đã tổng hợp ñược 4 dẫn xuất của axit asiatic trong ñó dẫn 41 (RMDV25mE) là chất mới. - Cấu trúc của các chất trên ñã ñược xác ñịnh bằng việc kết hợp các 4 phương pháp phổ hiện ñại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phân giải (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H -NMR, 13C-NMR,DEPT và phổ NMR hai chiều (H-H-COSY, HSQC và HMBC). - Kết quả cho thấy hầu hết các chất ñều có hoạt tính ức chế sự phát triển của 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm là KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan) và Lu (ung thư phổi). Các chất 40, 42 và 43 có hoạt tính mạnh hơn axit asiatic ban ñầu. 6. BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN Nội dung luận văn chia làm 4 chương Chương 1: Tổng quan Chương 2: Nguyên liệu hoá chất và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Thực nghiệm Chương 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY RAU MÁ VIỆT NAM Cây rau má có tên khoa học là Centella asiatica (Linn) Urban. Thuộc họ hoa tán (Apiaceae), tên thường gọi là rau má, có tên khác là Tích huyết thảo, Cây thảo mọc bò, phân nhánh nhiều trên mặt ñất. Rễ mọc từ các mấu của thân. Lá có cuống dài mọc ra từ gốc hoặc từ các mấu. Lá hơi tròn, có mép khía tai bèo, trông giống như những ñồng tiền tròn ñược xếp nối tiếp nhau nên còn gọi là Liên tiền. Cụm hoa hình tán ñơn mọc ở nách lá gồm 1-5 hoa nhỏ, cuống màu trắng hoặc phớt ñỏ. Quả dẹt, có sống hơi rõ. Là một thứ rau dại ăn ñược thường mọc ở những nơi ẩm ướt như thung lủng, bờ mương thuộc những vùng nhiệt ñới như Việt nam, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Srilanka, Ấnñộ, Pakistan, Madagascar [1]. 5 Dân gian thường dùng rau má trị cảm mạo, phong nhiệt, thuỷ ñậu, sởi, sốt da vàng mặt, viêm họng, viêm khí quản, ho, viêm ñường tiết niệu, ñái dắt ñái buốt, còn dùng trị thổ huyết, chảy máu cam, tả lỵ, khí hư, bạch ñới, giải ñộc lá ngón và nhân ngôn. Dùng ngoài trị rắn cắn, mụn nhọt, lở ngứa và vết thương chảy máu. Ở Trung Quốc, rau má ñược dùng trị cảm mạo, phong nhiệt, viêm phần trên ñường hô hấp, viêm gan, lỵ, cúm, ăn phải vật có ñộc, viêm màng phổi, rắn cắn, gai ñâm vào thịt, trúng ñộc nấm dại, ngộ ñộc sắn, trúng ñộc thuốc nông dược, ngộ ñộc thức ăn và ñòn ngã tổn thương. Từ những năm 1940, y học hiện ñại bắt ñầu nghiên cứu những tác dụng của rau má. Rau má có những hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn ñược gọi là tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic acid và asiatic acid. Hoạt chất asiaticoside ñã ñược ứng dụng trong ñiều trị bệnh phong và bệnh lao. Người ta cho rằng trong những bệnh này, vi khuẩn ñược bao phủ bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiễm của cơ thể không thể tiếp cận. Chất asiaticoside trong dịch chiết rau má có thể làm tan lớp màng bao nầy ñể hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng. Tuy nhiên, ở nước ta các công trình nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào mặt thực vật học. Trong số các loại rau má thì cây rau má có tên khoa hoc: Centella asiatica (Linn) Urban, ñược sử dụng rộng rã trong các bài thuốc ñông y, ñặc biệt rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới ñã nhiều năm nghiên cứu thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của chúng. 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC 1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC 6 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU Axit asiatic ñược phân lập từ cây rau má ñược thu hái tại Sơn Tây, Hà Nội vào tháng 10 năm 2011. 2.2. DUNG MÔI VÀ HOÁ CHẤT NGHIÊN CỨU Các dung môi ñược sử dụng ñể chiết tách và tinh chế là: Ethanol, methanol, n-hexan, etyl axetat, chloroform.... Các tác nhân và hóa chất tinh khiết dùng cho các quá trình tổng hợp dẫn xuất và phân tích ñược mua từ hãng Sigma-aldrich, Merck hoặc Trung Quốc. 2.3. CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC TRONG CÂY RAU MÁ Nguyên liệu rau má tươi ñược sấy khô, xay nhỏ và chiết với các dung môi và các phương pháp khác nhau. Cặn chiết ñược loại tinh dầu và các chất béo bằng n-hexan. Cặn ñược thủy phân trong dung dịch NaOH, trung hòa với HCl sau ñó ñược kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) ñể xác ñịnh hàm lượng axit asiatic và các tritecpen khác. 2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN HOÁ HOÁ HỌC Các phản ứng hóa học ñược thực hiện theo các phương pháp thông dụng trong các phòng thí nghiệm tổng hợp hữu cơ. Các phản ứng của các chất nhạy cảm với hơi ẩm và không khí ñược tiến hành trong môi trường có khí trơ. Các dung môi phản ứng ñược làm khan trong thiết bị chuyên dụng. 2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CỦA CÁC CHẤT Việc xác ñịnh cấu trúc hóa học của các chất sạch ñược thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện ñại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (MS), sắc kí lỏng cao áp gắn với khối phổ (LC/MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1 H, DEPT, COSY, HSQC và HMBC. Trong trường hợp cần thiết sẽ ñiều 7 chế dẫn xuất acetyl của những chất chứa nhóm hydroxyl ñể khẳng ñịnh thêm cấu trúc của chúng. 2.6. PHƯƠNG PHÁP THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.6.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh 2.6.2.Phương pháp thử ñộ ñộc tế bào CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1. KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC VÀ CÁC TRITERPEN KHÁC 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ chiết tới hàm lượng axit asiatic và axit madecassic. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ dung môi chiết tới hàm lượng axit asiatic 3.1.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết Kết luận Bằng các phương pháp phân tích với 9 mẫu thí nghiệm khảo sát, chúng tôi ñã xác ñịnh ñược các ñiều kiện tối ưu ñể thực hiện qui trình chiết, tách axit asiatic và axit madecassic từ cây rau má. Các ñiều kiện ñó như sau: + Nồng ñộ dung môi chiết là etanol (80%) + Thời gian chiết là 2 giờ cho một lần (chiết 2 lần). + Nhiệt ñộ chiết là 80OC Từ kết quả khảo sát này, chúng tôi áp dụng ñể nghiên cứu qui trình chiết, qui mô phòng thí nghiệm. 3.2. QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC VÀ CÁC TRITERPEN KHÁC 3.2.1. Quy trình chiết tách (theo sơ ñồ 1) 8 kg rau má tươi ñược sấy ở 450C, thu ñược 900 gam khô, xay nhỏ và ngâm chiết lần một với 3,6 lít EtOH ở nhiệt ñộ 800C trong 2 giờ, lọc 8 qua phễu lọc thu ñược 2,5 lít dịch chiết. Bã ñược chiết thêm 1 lần nữa với EtOH (2,5 lít). Thời gian rút dịch chiết là 2 tiếng/lần. Gộp dịch lại, quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt ñộ 500C, thu ñược 165 gam cặn EtOH. Cặn chiết thu ñược ñược chế thêm nước cất. Sau ñó chiết lần lượt với n-hexan và chloroform. Các dịch chiết ñược cất loại dung môi cho ñến khi khô sẽ thu ñược 20 gam cặn n-hexan, 25 gam cặn chloroform và 120 gam cặn dịch nước. Các chất phân lập từ dịch chiết EtOH của cây rau má Tên chất Axit asiatic (RM1) Cấu trúc Hiệu suất (so với mẫu khô) 0,37% Axit Madecassic (RM2) Stigmasterol glucoside + β-sitosterol 0,43% 0,096% glucoside (RM3) 3.3. TỎNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT ASIATIC Sau khi chiết tách và tinh chế ñược axit asiatic là có ñộ sạch > 98%, tiến hành tổng hợp các dẫn xuất của axit asiatic theo sơ ñồ 2. 9 30 29 19 12 13 11 25 26 1 HO 2 9 24 8 5 3 HO 10 6 4 23 7 27 15 21 22 18 H 14 20 17 16 28 HOOC anhydric succinic 2,2-dimethoxypropane O TsOH.H2O COOH O Et3N 40 O H O O COOH HO COOH O 41 9. Axit siatic OH (CH3CO)2O/Py COOH AcO HCl COOH AcO HO O HO O 42 43 Sơ ñồ 2: Sơ ñồ tổng hợp một số dẫn xuất của axit asiatic Các chất tổng hợp từ axit asiatic STT Ký hiệu 40 RM-1,2DMSBV 1 41 RMDV25mE 2 (Chất mới) 3 42 RM2AcV 4 43 RM2Ac Cấu trúc 10 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. CÁC THÔNG SỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC VÀ CÁC TRITERPEN KHÁC 4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ chiết tới hàm lượng axit asiatic và axit madecassic Chiết mẫu bằng EtOH 80% ở ba nhiệt ñộ khác nhau là 60, 70 và 800C. Kết quả ñược ñưa ở bảng 4.1. Kết quả cho thấy chiết ở 800C cho hiệu quả tốt hơn cả với hàm lượng axit asiatic và axit madecassic là 0,52% và 0,77% tương ứng. Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ chiêt ñến hàm lượng axit asiatic và axit madecassic Lượng Nhiệt ñộ Nồng ñộ Axit asiatic Axit mẫu (0C) EtOH (%) (g) madecassic (g) 80 60 80 0,297 (0,37%) 0,448 (0,56%) 80 70 80 0,298 (0,37%) 0,449 (0,56%) 80 80 80 0,412 (0,52%) 0,618 (0,77%) 4.1.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ dung môi chiết tới hàm lượng axit asiatic Nghiên cứu chiết mẫu rau má với ba nồng ñộ cồn là 70, 80 và 90% ở nhiệt ñộ 800C. Kết qủa ñược ñưa ở Bảng 4.2. Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng ñộ dung môi chiết ñến hàm lượng axit asiatic và axit madecassic Lượng mẫu (g) Nồng ñộ EtOH (%) Axit asiatic trong mẫu (g) Axit madecassic (g) 80 70 0,310 (0,39%) 0,465 (0,58%) 80 80 0,412 (0,52%) 0,618 (0,77%) 80 90 0,262 (0,32%) 0,390 (0,48%) 11 Từ kết quả ở bảng 4.2: quá trình chiết với etanol (80%) ở nhiệt ñộ 800C cho hiệu suất chiết axit asiatic và axit madecassic là cao nhất. Khi chiết với etanol nồng ñộ 70% thu ñược lượng cặn nhiều hơn (13,95gam) so với việc sử dụng etanol 80% (13,21gam). Tuy nhiên, lượng axit asiatic và axit madecassic thu ñược lại ít hơn. Điều này ñược lý giải là do tăng hàm lượng nước, trong quá trình chiết các hợp chất ñường, muối vô cơ ..., sẽ tan vào nhiều hơn, do ñó làm tăng lượng cặn và gây khó khăn trong việc tinh chế, và không thu ñược triệt ñể lượng axit asiatic và axit madecassic có trong cặn chiết. 4.1.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết Sau khi chọn ñược nồng ñộ dung môi chiết tốt nhất là 80%, chúng tôi khảo sát thời gian (1, 2 và 3 giờ). Chọn nhiệt ñộ 800C. Lọc dịch chiết, cất loại trên bộ quay cất chân không dưới áp suất giảm thu ñược cặn tương ứng (Bảng 4.3 ). Bảng 4.3: Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô Lượng mẫu (g) Thời gian chiết (giờ) Tổng cặn chiết (g) 80 1 10,36 80 2 13,21 80 3 13,24 Từ kết quả bảng 4.3: thời gian là 2 giờ và 3 giờ cho mỗi lần chiết có hiệu suất chiết tốt hơn so với chiết 1 giờ và lần chiết thứ ba còn rất ít, do ñó chúng tôi chọn thời gian chiết là 2 giờ cho mỗi lần chiết và chiết lần. 4.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY RAU MÁ (Centella asiatica (L.) Urban.) 4.2.1. Chất (9) (RM1): Axit asiatic 12 - Chất 9 (RM1): 3,4 gam, 0,37% tính theo trọng lượng mẫu rau má thô, ñược phân lập từ cặn của chiết EtOH dưới dạng tinh thể màu trắng (CHCl3/MeOH), ñiểm nóng chảy 324-3260C. Phổ hồng ngoại: cho ñỉnh hấp thụ ñặc trưng của nhóm hydroxyl (3411,96 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930,19 và 2866,43 cm-1). Phổ 1H-NMR cho thấy có 6 nhóm metyl trong ñó có 4 nhóm metyl gắn với cacbon bậc 4 với các tín hiệu singlet tại: 0,717, 0,871; 0,992; 1,067; 1,158 và hai nhóm metyl gắn với CH với tín hiệu doublet tại δH = 0,919 (J = 6,5 Hz) và δH = 0,929 (J = 6,5Hz). Ngoài ra, trên phổ có tín hiệu một nhóm CH2 gắn với OH ở δH = 3,297 (d, J = 11,0 Hz, H-23a); δH = 3,535 (d, J = 11,0 Hz, H23b), 2 nhóm hydroxy gắn với CH ở δ = 3,387 (J = 9.5 Hz; H-3) và 3,718 (m, H-2) và 1 tín hiệu của nối ñôi ở δ = 5,260 (br.s, H-12). Phổ 13C-NMR và DEPT của chất 9 có mặt của 30 cacbon trong ñó có 6 nhóm metyl; 9 nhóm cacbon bậc 2; 8 nhóm cacbon bậc 3 và 7 nhóm cacbon bậc 4, nhóm carboxylic với δ = 181,6 ppm và tín hiệu nối ñôi C-12 = C-13; δ = 139,8, 126,6 ppm. Phổ H-H-COSY cho thấy có sự tương tác giữa hai proton ở δH: 3,297 (d, J = 11Hz); 3,535 (d; J = 11Hz) gắn trực tiếp với carbon ở vị trí C-23, proton ở δ = 3,387 (J = 9.5 Hz; H-3) tương tác với proton ở δ = 3,718 (m, H-2). Phổ HSQC cho thấy rõ giữa H-2 (3,72 ppm) và C-2 (69,7 ppm), giữa C-3 (72,2 ppm) và H-3 (3,38 ppm), tương tác giữa C-12 (126,6 ppm) và H-12 (5,26 ppm). Phổ khối (ESI-MS) cho pic ion giả phân tử tại m/z = 487.4 [M-H]+. Kết hợp với phổ 1H- và phổ 13C NMR dự ñoán chất 9 có công thức phân tử là C30H48O5. So sánh các số liệu phổ MS, 1H- và 13C-NMR của chất 9 với số liệu của axit asiatic trong tài liệu [24, 25], thấy hoàn toàn trùng khớp. Do vậy có thể kết luận chất 9 chính là axit asiatic, một trong các thành phần triterpenoid chính của cây rau má. 13 Hình 4.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 9 4.2.2. Chất (10) (RM2): Axit madecassic - Phổ hồng ngoại của chất (10) cho ñỉnh hấp thụ ñặc trưng của nhóm hydroxyl (3416,16 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930,19 và 2867,91 cm-1). Phổ 1H-NMR cho thấy có 4 metyl singlet, hai metyl doublet tại 0,92 và 1,10 ppm. Ngoài ra trên phổ có các tín hiệu của nhóm hydroxymetin (CHOH) tại δH: 3,31 (d, J = 9,5 Hz, H-3); 4,4 (m, H-6); tín hiệu ở δH = 5,31 ppm ñặc trưng cho nhóm metin olephinic (= CH) và 2 tín hiệu doublet ñặc trưng cho nhóm CH2 gắn với OH tại δH: 3,46 và 3,61ppm. - Sự có mặt của các nhóm này ñược củng cố bởi các tín hiệu trên phổ 13 C-NMR ở δC: 69,6 ppm (C-2), 78,2 (C-3), 68,4 (C-6), 126,9 và 139,0 ppm (C1-2 và C-13). Phổ 1H và 13C- NMR của chất 10 gợi ý rằng chất 10 14 có cùng khung cacbon với chất 9. Phổ khối cho pic ion phân tử tại m/z = 505,35 [M+1]+ , kết hợp với phổ 1H- và 13C - NMR suy ra chất 10 phù hợp với công thức phân tử là C30H48O6 . - Các số liệu phổ MS, 1H- và 13C-NMR của chất 10 hoàn toàn phù hợp với số liệu của axit madecassic trong tài liệu [7] Bảng 4.4. Do ñó chất 10 chính là axit madecassic, một trong các triterpen chính có trong cây rau má. Hình 4.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 10 4.2.3. Chất 39: RM3 (Hỗn hợp stigmasterol glucoside + β sitosterol glucoside) So sánh các dữ kiện phổ ESI-MS, phổ 1H, 13CNMR và DEPT với tài liệu của hỗn hợp stigmasterol glucoside + β-sitosterol glucoside [26], cho phép xác ñịnh ñây chính là hỗn hợp stigmasterol glucoside + β - sitosterol glucoside. 15 1 Bảng 4.4: Số liệu phổ H- và 13C-NMR của chất 9 và 10 TT 1 Chất 9 (RM1) δC δH (Hz) 48,0 2 69,7 3,71(1H,m) 69,4 3,64(1H, m) 3 78,2 3,38 (d, J = 9,5Hz) 78,2 3,30 (d, J = 9,6Hz) 4 44,1 43,8 3,6 (1H, d, 78,5 J = 11,0Hz) 44,7 44,5 5 48,2 48,2 48,5 6 7 8 19,1 33,6 40,7 18,5 32,9 40,2 68,4 4,4 (1H, m) 67,7 4,8 (1H,m) 41,2 41,1 39,7 39,7 9 10 48,5 38,9 47,9 38,3 48,7 38,1 48,8 38,1 11 24,5 23,8 24,2 24,0 12 126,6 5,26 (1H, br.s) 125,9 13 139,8 139,2 126,9 5,3 (1H, m) 126,5 5,5(dd, J=3,4; 3,7Hz) 139,0 138,4 14 43,4 42,8 43,8 43,2 15 29,1 28,6 28,8 28,8 16 25,3 24,8 24,5 24,8 17 48,7 48,4 48,6 48,6 18 54,3 53,7 54,3 53,4 19 40,4 39,8 40,4 39,5 20 21 40,4 31,6 39,7 30,9 40,4 31,6 39,6 30,9 22 38,1 37,4 38,5 37,4 23 66,3 24 13,9 14,2 15,3 66,2 3,29(d,J=11,0 Hz) 3,54(d,J=11,0 Hz) 15,9 25 17,6 17,4 19,2 19,4 26 17,7 17,4 19,1 19,3 27 28 29 24,1 181,5 17,8 23,8 180,8 17,3 23,9 181,6 17,6 23,8 180,8 17,3 30 21,5 21,3 21,5 21,2 3,29 (d, J =11,0Hz) 3,53(d, J=11,0Hz) Axit asiatic [ 24, 25 ] δC δH (Hz) 47,8 66,4 5,16 (1H, br.s) 3,23 (d, J= 11,2Hz) 3,30 (d, J=11,2Hz) Chất 10 (RM2) δC δH (Hz) 50,3 Axit madecassic [ 7 ] δC δH ( Hz) 50,5 69,6 3,7 (1H, m) 69,1 78,2 65,9 4,2 (1H, m) 3,4 (d, J = 10,4Hz) 48,7 3,30 (d, J = 11,0Hz) 3,54 (d, J=11,0Hz) 16 4.3. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT AMIT CỦA AXIT ASIATIC Sau khi chiết tách và tinh chế ñược axit asiatic là có ñộ sạch > 98%, tiến hành tổng hợp các dẫn xuất của axit asiatic theo sơ ñồ 2. 4.3.1. Chất: 3, 23-O-isopropyliden asiatic acid (40) Phổ 1H-NMR (Hình 4.2, 4.3 và 4.4) cho thấy có 6 nhóm metyl trong ñó có 4 nhóm metyl gắn với cacbon bậc 4 với các tín hiệu singlet tại δH = 0,694 (3H, s, CH3); 0,806 (3H, s, CH3); 1,004 (3H, s, CH3); 1,033 (3H, s, CH3) và xuất hiện 3 nhóm acetyl với các tín hiệu singlet tại δH = 1,915 (3H, s, OCOCH3); 1,958 (3H, s, OCOCH3); 2,020 (3H, s, OCOCH3). Phổ 13 C-NMR và các phổ DEPT-90, DEPT-135 của chất (40) (Hình 4-10, Hình 4-11) có mặt của 33 carbon trong ñó có 8 nhóm CH3 cacbon bậc 1 (CH3); 9 nhóm cacbon bậc 2 (CH2); 8 nhóm cacbon bậc 3 (CH) và 8 nhóm cacbon bậc 4. Đặc biệt phổ 13C-NMR có tín hiệu cacbon bậc 4 ở δ = 100,7 ppm. Từ các số liệu phổ hồng ngoại, phổ khối, 1H -NMR và 13C-NMR của chất (40) hoàn toàn phù hợp với dữ liệu phổ trong tài liệu [ 23] (xem bảng 4.4). 17 Hình 4.7. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 40 Hình 4.11. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 40 18 4.3.2. Chất: 2-[(3-carboxypropanoyl)oxy] 3,23-O-isopropyliden asiatic acid (41) 41 Khi cho chất (40) phản ứng với succinic anhydrit trong CH2Cl2 và trietylamin, thu ñược hợp chất este (41). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (Hình 4.12 và 4.13) xuất hiện hai tín hiệu ở δ (ppm) : 2,57- 2,71 (4H, m, 2 x CH2) của mạch nhánh ñược gắn vào và tín hiệu H-2 dịch chuyển từ trường cao δH = 3,6 ppm về phía trường thấp ở δH = 5,03 ppm. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 41 cho tín hiệu của 37 nguyên tử cacbon, trong ñó có 11 nguyên tử cacbon bậc 2, 10 cacbon bậc 4, 8 nguyên tử cacbon bậc 1 và 8 cacbon bậc 3 (xem hình 4.14 và 4.15). Đặc biệt trên phổ 13C-NMR xuất hiện thêm 2 tín hiệu của nhóm CH2: δ/ppm = 23,7 ( C-2’); 23,1 (C-3’) , một nhóm este ở δ/ppm = 171,8 (C-1’) và một nhóm cacboxylic tại δ/ppm = 178,0 (C-4’) xem (Hình 4.14 và 4.15). Kết hợp phổ hồng ngoại, phổ 13C-NMR và phổ DEPT như vậy nhóm hydroxy ở vị trí C-2 tham gia phản ứng este với succinic anhydric ñể tạo thành chất 41, phù hợp với cấu trúc trên.