Tài liệu Nghiên cứu chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá phòng bệnh newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm ở gà

  • Số trang: 71 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 263 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 27125 tài liệu

Mô tả:

i LỜI CẢM ƠN Được sự phân công của Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, cùng với sự chấp thuận của ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, tôi được phép thực tập tại Phân viện từ ngày 20/02/2012 đến ngày 02/06/2012. Trong quá trình thực tập, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ tận tình và hết lòng vì khoa học của Tiến sĩ Nguyễn Văn Duy và Thạc sĩ Đỗ Văn Khiên, cùng các cán bộ Bộ môn Siêu vi trùng. Tôi cũng xin cảm ơn ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường, cùng toàn thể cán bộ công nhân viên đang công tác tại Phân viện đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đợt thực tập này. Tôi cũng gởi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Mặc dù có nhiều cố gắng nhưng do kiến thức, năng lực, cũng như kinh nghiệm nghiên cứu của bản thân còn nhiều hạn chế nên không thể không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp của các thầy cô giáo cùng bạn bè đồng nghiệp. Nha Trang, tháng 06 năm 2012 Sinh viên Phạm Văn Vị ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i MỤC LỤC ..............................................................................................................ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................................................vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................viii MỞ ĐẦU ................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU...................................3 1.1. Virus Newcastle ........................................................................................... 3 1.1.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa........................................................3 1.1.2. Cấu trúc hệ gen ....................................................................................3 1.1.3. Protein .................................................................................................4 1.1.4. Sức đề kháng .......................................................................................4 1.1.5. Đặc tính nuôi cấy .................................................................................5 1.1.6. Độc lực ................................................................................................5 1.1.7. Sự nhân lên ..........................................................................................6 1.1.8. Tính gây bệnh ......................................................................................7 1.1.9. Cơ chế sinh bệnh..................................................................................8 1.2. Virus viêm phế quản truyền nhiễm gà (IBV) ............................................. 8 1.2.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa........................................................8 1.2.2. Cấu trúc hệ gen ....................................................................................9 1.2.3. Protein .................................................................................................9 1.2.4. Sức đề kháng ..................................................................................... 10 1.2.5. Đặc tính nuôi cấy ............................................................................... 11 iii 1.2.6. Độc lực .............................................................................................. 12 1.2.7. Sự nhân lên ........................................................................................ 13 1.2.8. Tính gây bệnh .................................................................................... 13 1.2.9. Cơ chế sinh bệnh................................................................................ 13 1.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất vacxin...................................................... 14 1.3.1. Trên thế giới.......................................................................................... 14 1.3.2. Ở Việt Nam........................................................................................... 15 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 17 2.1. Vật liệu....................................................................................................... 17 2.1.1. Giống Virus .......................................................................................... 17 2.1.2. Động vật thí nghiệm.............................................................................. 17 2.1.3. Môi trường và hóa chất ......................................................................... 17 2.1.4. Thiết bị chuyên dụng............................................................................. 18 2.2. Phương pháp ............................................................................................. 18 2.2.1. Thử nghiệm HA (Haemagglutination Test) ........................................... 18 2.2.2. Tiêm vào xoang niệu mô ....................................................................... 19 2.2.3. Giám định đặc tính sinh học của virus Newcastle .................................. 19 2.2.3.1. Tiêm truyền giống virus Newcastle trên gà mẫn cảm ...................... 19 2.2.3.2. Xác định chỉ số EID50, MDT........................................................... 19 2.2.3.3. Xác định chỉ số LD50 ....................................................................... 21 2.2.3.4. Xác định chỉ số ICPI ....................................................................... 22 2.2.3.5. Xác định chỉ số IVPI....................................................................... 22 2.2.4. Giám định đặc tính sinh học của IBV .................................................... 23 iv 2.2.4.1. Tiêm truyền giống virus viêm phế quản truyền nhiễm trên gà mẫn cảm.............................................................................................................. 23 2.2.4.2. Xác định chỉ số EID50 ..................................................................... 23 2.2.5. Nhân giống và thu hoạch virus Newcastle và IBV trên trứng gà có phôi24 2.2.6. Xác định virus và chuẩn độ virus Newcastle và IBV trong nước trứng thu được................................................................................................................ 25 2.2.7. Xác định hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle và IBV trong huyết thanh gà được tiêm vacxin nhũ dầu ................................................................. 25 2.2.8. Vô hoạt virus......................................................................................... 26 2.2.9. Kiểm tra vô hoạt................................................................................... 26 2.2.10. Sản xuất vacxin .................................................................................. 26 2.2.11. Kiểm tra chất lượng vacxin ................................................................. 28 2.2.11.1. Vô trùng........................................................................................ 28 2.2.11.2. Tiêu chuẩn về vật lý ...................................................................... 28 2.2.11.3. Chỉ tiêu an toàn của vacxin trên gà................................................ 28 2.2.11.4. Hiệu lực ........................................................................................ 28 2.2.12. Xử lý số liệu........................................................................................ 29 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 30 3.1. Giám định đặc tính sinh học của virus Newcastle ................................... 30 3.1.1. Ổn định giống virus PV1 trên phôi gà ................................................... 30 3.1.2. Tiêm truyền giống virus PV1 trên gà mẫn cảm...................................... 31 3.1.3. Chuẩn độ giống virus PV1 trên phôi gà ................................................. 32 3.1.4. Chuẩn độ giống virus PV1 trên gà ......................................................... 34 3.1.4.1. Xác định chỉ số LD50 ....................................................................... 34 v 3.1.4.2. Tiêm não gà con 1 ngày tuổi ........................................................... 35 3.2. Giám định đặc tính sinh học của IBV....................................................... 37 3.2.1. Ổn định giống virus MV trên phôi gà .................................................... 37 3.2.2. Tiêm truyền giống virus MV trên gà mẫn cảm ...................................... 38 3.2.3. Chuẩn độ giống virus MV trên phôi gà.................................................. 39 3.3. Nhân giống và kiểm tra tiêu chuẩn giống................................................. 41 3.3.1. Với giống virus Newcastle cường độc ................................................... 41 3.3.2. Với giống virus IB cường độc ............................................................... 41 3.4. Chuẩn độ virus trên phôi gà ..................................................................... 43 3.5. Kiểm tra 2 giống virus (PV1 và MV) sau vô hoạt .................................. 43 3.6. Sản xuất vacxin.......................................................................................... 45 3.7. Kiểm tra vô trùng vacxin .......................................................................... 45 3.8. Kiểm tra chỉ tiêu vật lý, an toàn của vacxin ............................................. 45 3.9. Kiểm tra hiệu lực vacxin trên gà 2 tháng tuổi.......................................... 47 3.9.1. Theo dõi sự biến động hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle và IB trên gà 2 tháng tuổi chưa được miễn dịch cơ sở............................................... 47 3.9.2. Theo dõi sự biến động hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle và IB trên gà 2 tháng tuổi đã được miễn dịch cơ sở .................................................. 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 61 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BPL Betapropiolactone CEK Chick Embryo Kidney CEL Chick Embryo Liver CK Chick Kidney CPE Cytopathic Effect CRD Chronic Respiratory Disease EID50 Embryo Infective Dose 50% FAO Food and Agriculture Organization HA Haemagglutination Test HI Haemagglutination Inhibition Test HN Haemagglutinin - Neuraminidaza IB Infectious Bronchitis IBV Infectinous Bronchitis Virus ICPI Intracerebral Pathogenicity Index IVPI Intravenous Pathogenicity Index LD50 Lethalis Dose 50% MDa Megadalton MDT Mean Dead Time NP Nucleoprotein vii ORF Open Reading Frame PBS Phosphate Buffered Saline PMV-1 Paramyxovirus-1 RNP Ribonucleoprotein viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Chỉ số độc lực của một số chủng virus Newcastle................................ 6 Bảng 2.1. Xác định chỉ số EID50 ........................................................................ 20 Bảng 2.2. Xác định chỉ số LD50 ......................................................................... 21 Bảng 2.3. Xác định chỉ số ICPI.......................................................................... 22 Bảng 2.4. Xác định chỉ số IVPI ......................................................................... 23 Bảng 2.5. Xác định chỉ số EID50 ........................................................................ 24 Bảng 3.1. Kết quả tiêm truyền giống PV1 trên phôi gà ...................................... 30 Bảng 3.2. Kết quả tiêm truyền giống PV1 trên gà mẫn cảm ............................... 31 Bảng 3.3. Kết quả xác định chỉ số EID50 (log10) của giống PV1 lần 1............... 33 Bảng 3.4. Kết quả xác định chỉ số LD50 (log10) của giống PV1 lần 1 ................ 34 Bảng 3.5. Kết quả xác định chỉ số ICPI bằng giống virus PV1........................... 36 Bảng 3.6. Kết quả xác định chỉ số IVPI bằng chủng virus PV1.......................... 37 Bảng 3.7. Kết quả tiêm truyền giống MV trên phôi gà....................................... 37 Bảng 3.8. Kết quả tiêm truyền giống MV trên gà mẫn cảm................................ 39 Bảng 3.9. Kết quả xác định chỉ số EID50 (log10) của giống MV lần 1 ............... 40 Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra virus sau vô hoạt trên phôi gà ............................... 44 Bảng 3.11. Kết quả sản xuất vacxin ................................................................... 45 Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin ..................................................... 45 Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra tính ổn định của vacxin ......................................... 46 Bảng 3.14. Kết quả kiểm tra an toàn của các lô vacxin nhũ dầu trên gà ............. 46 Bảng 3.15. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà 2 tháng tuổi chưa được miễn dịch cơ sở newcastle................................................................ 48 Bảng 3.16. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà 2 tháng tuổi chưa được miễn dịch cơ sở IB.................................................................................... 50 Bảng 3.17. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà 2 tháng tuổi đã được miễn dịch cơ sở newcastle.................................................................... 52 Bảng 3.18. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà 2 tháng tuổi đã được miễn dịch cơ sở IB............................................................................................. 54 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh của NDV được chụp dưới kính hiển vi điện tử. ..............................3 Hình 1.2. Hình ảnh của IBV được chụp dưới kính hiển vi điện tử.................................8 Hình 2.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin nhị giá ND & IB nhũ dầu .......................27 Hình 3.1. Bệnh tích do virus cường độc Newcastle gây ra ở phôi gà...........................42 Hình 3.2. Bệnh tích do virus cường độc IB gây ra ở phôi gà .......................................42 Hình 3.3. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà chưa được miễn dịch cơ sở ..........................................................................................................49 Hình 3.4. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà chưa được miễn dịch cơ sở...........................................................................................................................51 Hình 3.5. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus newcastle ở gà đã được miễn dịch cơ sở ...................................................................................................................53 Hình 3.6. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà đã được miễn dịch cơ sở ...............................................................................................................................55 Hình 3.7. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà chưa có miễn dịch cơ sở và gà đã được miễn dịch cơ sở được tiêm vacxin lô 1 ................................56 Hình 3.8. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà chưa có miễn dịch cơ sở và gà đã được miễn dịch cơ sở được tiêm vacxin lô 1 ............................................56 1 MỞ ĐẦU Ở Việt Nam hiện nay, chăn nuôi theo phương thức công nghiệp đang từng bước dần thay thế phương thức chăn nuôi nhỏ lẻ theo quy mô hộ gia đình. Nuôi gia cầm trong đó nuôi gà là một trong những nghề được quan tâm hàng đầu, vì thời gian nuôi ngắn thu được sản phẩm nhanh. Một trong những khâu quan trọng để đảm bảo chăn nuôi gà phát triển mạnh và có lãi là bảo vệ cho đàn gà tránh khỏi dịch bệnh. Đồng thời với việc phát triển nghề chăn nuôi gà theo phương thức công nghiệp, các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gà cũng nảy sinh, gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi, như các bệnh: Bệnh Newcastle, bệnh Gumboro, bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm, bệnh hô hấp mãn tính (CRD), bệnh tụ huyết trùng…đặc biệt là bệnh Newcastle và bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm đã được người chăn nuôi quan tâm rất nhiều. Bệnh Newcastle hay còn gọi là bệnh gà rù là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cấp tính, lây lan rộng của loài gà do một loại virus thuộc nhóm Paramyxovirus gây ra (Bear & Hanson, 1980). Đặc điểm là gà ủ rũ, kém hoạt động, bỏ ăn, lông xù như khoát áo tơi, nền chuồng có nhiều bãi phân trắng; gà sốt cao 42 - 430C, chảy nước mũi, khó thở, rối loạn tiêu hóa; có triệu chứng thần kinh. Ngoài ra, bệnh tích điển hình là niêm mạc dạ dày tuyến xuất huyết lấm tấm chấm màu đỏ, niêm mạc ruột xuất huyết; niêm mạc miệng hầu, khí quản xuất huyết[2]. Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm gà do virus thuộc nhóm Coronavirus gây ra, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, dễ lây lan tiếp xúc với những triệu chứng đặc trưng ở đường hô hấp như ho, chảy nước mũi, viêm hầu họng và dịch thẩm xuất tích tụ nhiều ở niêm mạc khí phế quản làm con vật khó thở, hắt hơi và có tiếng ran khí quản. Bệnh tích điển hình là niêm mạc mũi, khí quản, phế quản và lòng phế nang xung huyết, chứa dịch. Ngoài ra, bệnh có thể ảnh hưởng lớn đến sản lượng và chất lượng trứng ở đàn gà đẻ[1],[2]. 2 Các bệnh trên có tỷ lệ nhiễm cao và là một trong những nhân tố chính gây giảm hiệu quả kinh tế đối với ngành chăn nuôi gà. Cho đến nay, bệnh chưa có thuốc trị. Biện pháp tốt nhất để kiểm soát dịch bệnh là thực hiện an toàn sinh học trong chăn nuôi và sử dụng vacxin phòng bệnh[1],[2]. Tiêm phòng cho gà bằng vacxin nhược độc, đơn giá có ưu điểm là tạo miễn dịch nhanh, hiệu lực miễn dịch cao. Tuy nhiên, khi sử dụng vacxin đơn giá để tiêm phòng cần phải bắt gà nhiều lần, tạo phản ứng stress gây bất lợi cho gà, ảnh hưởng tới năng suất sản xuất. Vacxin đa giá là giải pháp hữu hiệu trong việc phòng bệnh cho gia cầm. Trong công tác phòng bệnh cho gia cầm thì việc chế tạo vacxin đa giá vô hoạt phòng bệnh cho gia cầm là xu thế hiện nay của các nhà sản xuất vacxin trên thế giới hiện nay và lâu dài. Để giảm bớt những nhược điểm khi tiêm phòng bằng vacxin nhược độc, vacxin đơn giá, đại bộ phận các nhà sản xuất vacxin lớn trên thế đã tập trung nghiên cứu và đưa vào sản xuất các loại vacxin đa giá vô hoạt dùng trong phòng bệnh cho gà. Để đáp ứng yêu cầu của đợt thực tập tốt nghiệp cuối khóa tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá phòng bệnh Newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm ở gà”. Đề tài được thực hiện tại Bộ môn nghiên cứu Siêu vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung - Km 4, Đường 2/4 - Vĩnh Hòa - Nha Trang - Khánh Hòa. Với những nội dung nghiên cứu sau: - Giám định một số đặc tính sinh học của hai giống virus cường độc NDV và viêm phế quản truyền nhiễm IBV. - Kiểm tra tiêu chuẩn giống cường độc Newcastle và IBV đưa vào sản xuất vacxin. Nhân giống và chuẩn độ 02 giống virus trên phôi gà. - Vô hoạt và kiểm tra chỉ tiêu vô hoạt hai giống virus NDV và IBV. - Chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá phòng bệnh Newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm gà với chất bổ trợ nhũ dầu. - Kiểm tra tiêu chuẩn về vật lý, vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin. 3 Chương 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Virus Newcastle 1.1.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa Virus Newcastle là PV-1 (Paramyxovirus-1), thuộc chi Rubulavirus, tộc Paramyxovirinae, họ Paramyxoviridae[3]. Đây là virus ARN 1 sợi âm có vỏ bọc. Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy virion có đường kính 120 - 300 nm, thường có dạng hình cầu hoặc hình que, hình sợi. Vỏ bọc có độ dày khoảng 10 nm. Trên bề [12] mặt có hai loại gai (Spike) glycoprotein sắp xếp chặt chẽ. Do không bền vững, khi bị làm đông giá và tan giá hay khi được tinh vỏ bọc ngoài thường bị phá hủy dễ dàng, nên dưới kính hiển vi điện tử thường thấy nucleocapsid trần. Nucleocapsid đối xứng xoắn dạng sợi thừng có chiều rộng 14 18 nm, chiều dài khoảng 1 µm[1]. Virus có thể qua được màng lọc Berkerfeld, Chamberland và màng lọc Seiz. Virus gây ngưng kết hồng cầu gà, bò, vịt, chuột bạch, chuột lang và nhóm máu O của người nhưng không gây ngưng kết ở ngựa, lừa, la, thỏ[2]. 1.1.2. Cấu trúc hệ gen Genom virus là RNA 1 sợi âm đơn nhất. Phân tử lượng khoảng 5 - 7 MDa, kích thước khoảng 15 kb và hệ gen chiếm 0,5% trọng lượng virion. Hằng số sa lắng khoảng 50S - 57 S[3]. Hầu hết virus gây bệnh Newcastle cho gia cầm có trình tự 112R/K-R-Q-K/RR116 ở phần cuối C của F2 protein và F (phenylalanine) ở phần còn lại 117, N - phần 4 cuối của protein F1, trong khi virus có độc lực thấp hơn có trình tự ở phần tương ứng là 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 và L (Leucine) ở phần còn lại 117[13]. 1.1.3. Protein Virus có 7 - 8 khung phiên mã ( ORF: Open Reading Frame - khung đọc mở: là đoạn DNA đủ dài, không bị chặn bởi bộ ba mã dừng để mã hóa một polypeptide có chức năng protein), trên đó miền P được sao mã trùng lặp hay có sự trùng lặp gen cho nên có thể phiên dịch được 10 - 12 loại protein. Có 7 loại protein cấu trúc:  Nucleoprotein (NP): là một protein kiềm kết hợp với RNA tạo thành nucleocapsid, có tác dụng bảo vệ RNA virus.  Haemagglutinin - neuraminidaza (HN): có đặc tính ngưng kết hồng cầu gà và có hoạt tính của men neuraminidaza có tác dụng cắt đứt các thụ thể hồng cầu.  Fusion protein (F, glycoprotein F, protein dung hợp): có hoạt tính dung hợp màng tế bào và hoạt tính dung huyết. Protein F được tổng hợp ở dạng tiền thể (protein FO), dưới tác động của enzyme phân giải protein của tế bào ký chủ mà phân cắt thành hai phần là F1 và F2. Nó biểu hiện hoạt tính dung hợp màng và có hoạt động quan trọng trong việc xâm nhập của virus và hình thành các tế bào khổng lồ đa nhân[4].  Protein SH (Protein kỵ thủy ngắn): chưa rõ chức năng[3].  Large protein (L): chưa rõ chức năng.  Matrice protein (M, protein màng): tồn tại mặt trong áo ngoài, có tác dụng gắn RNA của virus với vỏ bọc  Phospho nucleoprotein: hình ống dài và xoắn ốc nhiều vòng, chưa rõ chức năng[4]. 1.1.4. Sức đề kháng Do virus có màng bọc ngoài là lipid nên rất dễ mẫn cảm với các chất hóa học như ether, chloroform, cồn, formol, phenol và làm mất khả năng gây nhiễm nhưng không ảnh hưởng đến tính miễn dịch của virus. Ở nhiệt độ 560C virus bị tiêu diệt 5 trong 3 giờ, ở 600C là trong 3 phút, ở 1000C là 1 phút; từ 4 - 200C virus có thể tồn tại trong 1 tháng, ở nhiệt độ âm virus tồn tại hằng năm. Khả năng chịu nhiệt của từng chủng virus là đặc tính di truyền. Các chủng virus khác nhau có khả năng chịu nhiệt khác nhau, ở nhiệt độ 56oC có chủng virus chịu được đến 6 giờ mà còn khả năng gây nhiễm ví dụ như chủng virus Newcastle chịu nhiệt V4. Ở pH < 2 hoặc pH > 10 virus mất khả năng gây nhiễm. Virus dễ bị diệt bởi tia tử ngoại. Dung dịch Glyxerin 50% có thể giữ virus trong bệnh phẩm được 7 ngày ở 370C[4]. 1.1.5. Đặc tính nuôi cấy Trên phôi gà: Cấy virus vào xoang niệu mô phôi thai gà ấp 10 - 12 ngày, tùy theo độc lực từng chủng virus mà phôi thai có thể chết 48 - 96 giờ. Nói chung các chủng có độc lực cao và vừa gây chết phôi trong vòng 60 giờ, còn các chủng có độc lực thấp phải trên 100 giờ mới gây chết phôi, bệnh tích trên phôi chủ yếu là gây xuất huyết điểm ở đầu và cánh, có khi tụ máu và gây xuất huyết khắp phôi thai. Phôi càng non thì khả năng gây nhiễm và thời gian gây chết phôi nhanh hơn, tỷ lệ gây chết phôi cũng cao hơn. Đặc điểm quan trọng là sau khi cấy truyền đời qua phôi thai gà nhiều lần, người ta thu được giống virus Newcastle nhược độc dùng để chế tạo vacxin phòng bệnh. Trên tế bào nuôi cấy: có thể nuôi cấy virus Newcastle vào môi trường tế bào thận khỉ, thận lợn, hoặc tế bào xơ phôi thai gà 1 lớp. sau 24 giờ gây nhiễm, virus làm hủy hoại tế bào, làm cho tế bào bị biến đổi hình thái, tế bào co tròn lại hay vỡ ra hoặc tạo thành các tế bào khổng lồ. Trên động vật: có thể dùng gà giò để tiêm truyền nuôi cấy, virus sẽ phát triển và gây bệnh cho gà giống như gà mắc bệnh tự nhiên[4]. 1.1.6. Độc lực Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng trình tự nucleotide trên gen mã hóa trình tự acid amin tại thời điểm cắt protein F liên quan chặt chẽ với độc lực của virus[7]. Virus Newcastle có nhiều chủng, các chủng này có độc lực khác nhau, căn cứ vào tính độc và khả năng gây bệnh người ta chia làm 3 nhóm: 6  Nhóm Velogen: gồm các chủng có độc lực cao, đó chính là virus cường độc tự nhiên.  Nhóm Mesogen: gồm các chủng có độc lực vừa, là những virus chỉ gây bệnh nhẹ cho gà trên 6 tuần tuổi như chủng H (Herfoshine), chủng M (Mukteswar), chủng này khi tiêm cho phôi gà 10 - 11 ngày, làm chết phôi thai và gây xuất huyết toàn phôi thai.  Nhóm Lentogen: là các chủng có độc lực thấp gồm những virus không có khả năng gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ cho gà con mới nở như chủng B1, chủng Lasota, chủng F[2]. Bảng 1.1. Chỉ số độc lực của một số chủng virus Newcastle Chủng virus Nhóm ICPI IVPI MDT Ulster 2C Lentogenic 0.0 0.0 >150 Queenlands V4 Lentogenic 0.0 0.0 >150 Hitchner B1 Lentogenic 0.2 0.0 120 F Lentogenic 0.25 0.0 119 Lasota Lentogenic 0.4 0.0 103 H Mesogenic 1.2 0.0 48 Mukteswar Mesogenic 1.4 0.0 46 Roakin Mesogenic 1.45 0.0 68 Beaudett C Mesogenic 1.6 1.45 62 GB Texas Velogenic 1.75 2.7 55 NY Parrot 70181 1972 Velogenic 1.8 2.8 51 Italien Velogenic 1.85 2.8 50 Milano Velogenic 1.9 2.8 50 Herts ‘33/56 Velogenic 2.0 2.7 48 Pigeon/ England/561/83 1.5 0.0 120 Chicken/England/702/84 1.9 2.1 60 1.1.7. Sự nhân lên 7 Paramyxovirus nếu kết hợp với thụ thể có chứa axit sialic thì nhờ hoạt tính dung hợp màng của protein F mà gây dung hợp áo ngoài với màng tế bào, đưa nucleocapsid vào bên trong màng tế bào. Trong nucleocapsid đã có sẵn enzyme RNA-polymerase phụ thuộc RNA, dưới tác động của enzyme này trên khuôn RNA virus diễn ra sự tổng hợp các mRNA đơn cistron (mRNA phiên chỉ 1 gen cấu trúc) dài ngắn khác nhau. Trên ribosom, các mRNA đó tham gia tổng hợp hoàn toàn hình thành chuỗi RNA dương. Trên khuôn chuỗi dương này RNA virus (chuỗi âm) được tổng hợp và kết hợp ngay với protein cấu trúc vừa được tổng hợp mà hình thành nucleocapsid. Một mặt, các glycoprotein vừa được tổng hợp được chuyển từ màng lưới nội chất hạt sang màng lưới nội chất nhẵn, rồi bộ máy golgi rồi đến màng tế bào chất và tổ hợp vào trong màng tế bào. Protein M được tổng hợp tương tự cũng chuyển động ra dưới màng tế bào chất và cố định với các glycoprotein ở màng. Nucleocapsid di động đến dưới protein M, nhận áo ngoài nhờ nảy chồi qua màng đã biến đổi sẵn nêu trên mà thành thục. Tuy nhiên, thông thường hầu hết các nucleocapsid ở lại bên trong tế bào chất ký chủ và được quan sát thấy dưới dạng các thể ẩn nhập trong tế bào chất. Trong cảm nhiễm Paramyxovirus, ngoài sự khuếch tán cảm nhiễm theo cách nảy chồi qua màng còn đồng thời diễn ra hình thức lan truyền từ tế bào qua tế bào (cell to cell infection). Khi đó, nhờ cơ năng dung hợp màng của protein F, xuất hiện sự dung hợp ở bề mặt tế bào, qua đó từ tế bào đã nhiễm RNA virus lưu nhập sang các tế bào lân cận. Vì vậy, cảm nhiễm kéo dài cũng là đặc trưng khác của các virus thuộc họ này[3]. 1.1.8. Tính gây bệnh Trong tự nhiên: Virus Newcastle gây bệnh cho các loài gà, gà tây, bồ câu, chim sẻ. Còn Vịt, vịt trời, ngan, ngỗng cũng có thể mắc nhưng ở mức độ nhẹ hơn. Gà mắc bệnh ở các lứa tuổi khác nhau, song thường tập trung ở lứa tuổi từ 2 - 5 tháng tuổi. Người cũng có thể bị nhiễm virus Newcastle, thời gian nung bệnh từ 1 4 ngày, biểu hiện viêm kết mạc mắt, đôi khi có sốt và nhức đầu[4]. Một số động vật có vú như chó, chuột…cũng mắc bệnh này[2]. 8 Trong phòng thí nghiệm: bào thai gà 9 - 12 thích nghi nhất với việc nuôi cấy virus. Sau khi tiêm 36 - 48 giờ toàn bộ bào thai và nước trứng chứa virus[2]. Dùng gà giò để gây bệnh, sau khi tiêm truyền virus gà sẽ có triệu chứng và bệnh tích giống như gà mắc bệnh tự nhiên. Có thể dùng chim bồ câu để gây bệnh bằng cách tiêm virus vào bắp thịt, sau 6 - 8 ngày bồ câu bị tê liệt và chết sau 15 - 16 ngày. Ngoài ra cũng có thể tiêm vào óc hay xoang phúc mạc chuột bạch, chuột sẽ chết sau 3 - 6 ngày[4]. 1.1.9. Cơ chế sinh bệnh Thông thường căn bệnh theo đường tiêu hóa xâm nhập vào cơ thể. Virus thường thâm nhiễm qua niêm mạc hầu - họng rồi vào máu. Virus gây nhiễm trùng máu. Cũng trong thời gian đó căn bệnh đi vào hầu hết cơ quan và tổ chức của cơ thể và gây viêm hoại tử. Nội mô thành huyết quản bị phá hoại gây xuất huyết và thâm nhiễm dịch xuất vào các xoang trong cơ thể. Virus không trực tiếp gây viêm phổi song bệnh thường gây ra khó thở nghiêm trọng. Nguyên nhân là do virus tác động gây rối loạn hệ tuần hoàn và trung khu hô hấp của hệ thần kinh trung ương. Phần lớn gà nhiễm bệnh thường chết ở thời kỳ nhiễm trùng huyết. Đó là thể cấp tính. Trường hợp bệnh kéo dài hơn, thường ở giai đoạn cuối dịch hay bệnh ở những loài ít cảm thụ như thủy cầm, virus sẽ biến mất khỏi máu rồi đi đến các cơ quan phủ tạng để vào ký sinh trong tổ chức thần kinh trung ương. Kết quả dẫn đến thể bệnh mạn tính. Phản ứng thuốc khi tiêm vacxin cũng là một trạng thái của bệnh này[2]. 1.2. Virus viêm phế quản truyền nhiễm gà (IBV) 1.2.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa IBV thuộc chi Coronavirus, họ Coronaviridae[3]. IBV có nhiều hình thái khác nhau nhưng chủ yếu là hình cầu. Nó có lớp vỏ bọc, virion có đường kính 120 nm với các gai (spikes) hình dùi trên bề mặt với độ dài khoảng 20 nm. Những gai này không xếp gần nhau như gai hình que của paramyxovirus. Cấu trúc của ribonucleoprotein (RNP, core) được giải phóng một cách ngẫu nhiên từ những tiểu phần đã bị phân hủy có thể nhận ra từ 9 những tàn tích mà không phải bằng cách nhuộm tiêu bản. Hầu hết các đoạn RNP có dạng sợi với đường kính chỉ 1 - 2 nm. Cấu trúc vòng xoắn với đường kính 10 - 15 nm đôi lúc cũng được thấy[12]. Các chủng IBV khác nhau về mật độ của chúng trong dung dịch đường, mật độ lớn nhất thường trong khoảng 1,15 1,18 g/ml, nhưng các tiểu phần thấp hơn (không có hoặc thiếu hụt RNP) và mật độ [15] cao hơn cũng có thể đạt được. Tốc độ ly tâm lớn hơn 100.000 g thì cần phải tránh vì như thế sẽ làm mất những gai đó. IBV chủng Beaudette dường như không ổn định đặc biệt; ấp trứng ở 37oC đôi khi làm mất một trong những thành phần của gai[12]. 1.2.2. Cấu trúc hệ gen RNA hệ gen có tính cảm nhiễm, là chuỗi một sợi phân bố thẳng, có cấu trúc 7 Me Gppp ở đầu 5’ và đoạn poly - A ở đầu 3’. Phân tử lượng của RNA hệ gen khoảng 9 - 11 MDa, kích thước 27 - 33 kb[3]. 1.2.3. Protein Virion có 4 protein cấu trúc là S, M, E và N.  Spike glycoprotein (S): yếu tố quy định đặc tính gây ngưng kết hồng cầu và đặc tính trung hòa của virus.  Protein màng (M).  Protein vỏ (E): quan trọng đối với sự lắp ráp của virus.  Nucleoprotein (N): bao quanh và bảo vệ bộ gen RNA của virus[14]. Glycoprotein S bao gồm hai tiểu đơn vị là S1 và S2, trình bày một loạt các yếu tố quyết định kháng nguyên có thể gây ra việc sản xuất kháng thể trung hòa cụ thể và cũng kích hoạt hệ miễn dịch tế bào. Hầu hết các phương pháp phân loại huyết thanh được dựa trên các tiểu đơn vị S1. Cấu trúc protein này phụ thuộc vào các tiểu đơn vị bổ sung cho S2 mà yếu tố này quy định hành vi neo đậu các protein S vào vỏ lipid. 10 Ngoài protein S, protein nucleocapsid (N) là một protein cấu trúc quan trọng có thể góp phần gây bệnh của virus. Các protein N nằm bên trong các virion, gắn liền với hệ gen của nó và tương tác với protein nhân của virus và tế bào vật chủ. Chức năng sinh học quan trọng được quy định cho N - phosphoprotein, trong đó sự nhân lên của virus, sự tương tác nhóm rRNA và bắt đầu nảy nở của các hạt virus trong tế bào vật chủ bị nhiễm bệnh. Các gen mã hóa protein N được bảo toàn theo các chủng IBV khác nhau, cho phép tái tổ hợp giữa các chủng khác nhau[7]. 1.2.4. Sức đề kháng Đối với nhiệt độ: Hầu hết các chủng IBV đều bị bất hoạt sau 15 phút ở 560C và sau 90 phút ở 450C. Bảo quản IBV ở -200C sẽ tránh được điều đó. Dịch niệu chứa virus không thay đổi sau khi bảo quản ở -300C trong nhiều năm. Mô bào nhiễm virus bảo quản tốt trong glyxerol 50% và mô ở trong môi trường này có thể được đem đi chẩn đoán trong phòng thí nghiệm mà không cần làm lạnh. Ở ngoài môi trường, vào mùa xuân nó có thể tồn tại được khoảng 12 ngày, còn vào mùa đông thì khoảng 56 ngày[12]. Đối với sự đông khô: Dịch niệu chứa virus được đông khô, bao gói trong chân không và bảo quản trong phòng lạnh nó có thể sống được tối thiểu là 30 năm. Hàm lượng glucose 10% đem lại cho IBV tính ổn định hiệu quả trong giai đoạn đông khô, cũng như đông lạnh[12]. Đối với pH: Các chủng virus khác nhau thì có tính bền vững khác nhau ở pH = 3. Trong một nghiên cứu, sự giảm đi của hiệu giá virus ở nhiệt độ thường trong thời gian 4 giờ thay đổi từ 1 - 2 log10 cho hầu hết các phân lập, 5 log10 đối với những phân lập khác. IBV khi nuôi cấy trong tế bào thì bền vững trong môi trường ở pH = 6 và pH = 6,5 hơn ở pH = 7,0 - 8,0[12]. Đối với hóa chất: Thông thường các chủng IBV dễ mẫn cảm với ether, nhưng một số chủng khác có thể tồn tại được ở nồng độ ether 20%, tất cả những virus đều bị tiêu diệt bởi chloroform 50% và sodium deoxycholate 0,1%. IBV được xem là nhạy cảm đối với các chất sát trùng thông thường. Khi xử lý bằng betapropiolactone (BPL) với nồng độ 0,05% hoặc 0,1% cũng như formalin 0,1% thì 11 sẽ tiêu diệt được IBV. Khi chỉ xử lý bằng BPL sẽ không gây ảnh hưởng bất lợi đến khả năng gây ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên IBV[12]. 1.2.5. Đặc tính nuôi cấy Nuôi cấy trên phôi gà: IBV phát triển tốt trên phôi gà đang phát triển. Đặc điểm nuôi cấy khởi đầu trên phôi gà 10 - 11 ngày tuổi là một số phôi bị còi cọc với tỷ lệ sống là 90% ở ngày thứ 19 của quá trình ấp trứng. Số phôi chết và còi cọc tăng lên theo quá trình cấy truyền. Vì vậy ở lần cấy truyền thứ 10 hầu hết các phôi bị còi cọc và trên 80% số phôi chết ở ngày thứ 20 của quá trình ấp trứng[12]. Sự thay đổi của phôi được thấy rõ sau khi gây nhiễm một vài ngày. Chỉ những thay đổi nhỏ của phôi cũng có thể được thấy khi soi trứng. Từ phía trên buồng hơi đến cuối trứng, phôi dường như bị xoắn vặn ở trong khối trứng với đôi chân bị biến dạng và bị ép phía trên đầu với màng ối dày dính chặt lên nó[12]. Nuôi cấy tế bào: Nuôi cấy tế bào một lớp rất được chú ý trong nghiên cứu virus IBV, tế bào thận phôi gà (CEK) và tế bào thận gà (CK) đã được sử dụng và hầu hết rất thành công. Sự thích nghi của IBV đối với tế bào CEK đã được kiểm chứng và đánh giá bởi Gillette năm 1973. Đòi hỏi cần phải có nhiều lần cấy truyền để tạo ra những tác động bệnh học tế bào một cách bao quát (CPE); biểu hiện rõ rệt trong nuôi cấy không nhuộm màu, hiệu giá lớn nhất của virus thay đổi theo từng chủng. Mặc dù có những đốm hủy hoại tế bào nhưng sự biểu hiện qua sự nhuộm màu có thể được nhìn thấy sau lần cấy truyền đầu tiên. Sự thích nghi của một số chủng đối với CEK được dễ dàng khi có sự cấy truyền phôi. Kích thước của những đốm hủy hoại tế bào và hình dạng của nó thay đổi theo ảnh hưởng của từng chủng virus khác nhau. Kích thước của những phần bệnh tích khi ảnh hưởng bởi hầu hết các chủng ở 400C lớn hơn ở 370C[12]. Giai đoạn tìm ẩn của virus IBV trong tế bào CEK hoặc CK là 3 - 4 giờ, với hiệu giá cực đại đạt được trong môi trường nuôi cấy đạt sau 13 - 14 giờ, phụ thuộc vào mức độ sinh sôi nảy nở của virus. Tế bào gan phôi gà (CEL) cũng đã được chế để xác định hiệu giá của IBV giống như từ tế bào CEK. Việc chuẩn độ IB trong phôi gà thường cho hiệu quả cao hơn trong tế bào CEK hoặc CK từ 10 - 100 lần,
- Xem thêm -