i
LỜI CẢM ƠN
Được sự phân công của Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại
học Nha Trang, cùng với sự chấp thuận của ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền
Trung, tôi được phép thực tập tại Phân viện từ ngày 20/02/2012 đến ngày
02/06/2012.
Trong quá trình thực tập, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được
sự giúp đỡ tận tình và hết lòng vì khoa học của Tiến sĩ Nguyễn Văn Duy và Thạc sĩ
Đỗ Văn Khiên, cùng các cán bộ Bộ môn Siêu vi trùng. Tôi cũng xin cảm ơn ban
lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học & Môi
trường, cùng toàn thể cán bộ công nhân viên đang công tác tại Phân viện đã tạo điều
kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đợt thực tập này. Tôi cũng gởi lời cảm ơn đến gia đình
đã luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Mặc dù có nhiều cố gắng nhưng do kiến thức, năng lực, cũng như kinh
nghiệm nghiên cứu của bản thân còn nhiều hạn chế nên không thể không tránh khỏi
những thiếu sót. Kính mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp của các thầy cô giáo
cùng bạn bè đồng nghiệp.
Nha Trang, tháng 06 năm 2012
Sinh viên
Phạm Văn Vị
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i
MỤC LỤC ..............................................................................................................ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................................................vi
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................viii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU...................................3
1.1. Virus Newcastle ........................................................................................... 3
1.1.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa........................................................3
1.1.2. Cấu trúc hệ gen ....................................................................................3
1.1.3. Protein .................................................................................................4
1.1.4. Sức đề kháng .......................................................................................4
1.1.5. Đặc tính nuôi cấy .................................................................................5
1.1.6. Độc lực ................................................................................................5
1.1.7. Sự nhân lên ..........................................................................................6
1.1.8. Tính gây bệnh ......................................................................................7
1.1.9. Cơ chế sinh bệnh..................................................................................8
1.2. Virus viêm phế quản truyền nhiễm gà (IBV) ............................................. 8
1.2.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa........................................................8
1.2.2. Cấu trúc hệ gen ....................................................................................9
1.2.3. Protein .................................................................................................9
1.2.4. Sức đề kháng ..................................................................................... 10
1.2.5. Đặc tính nuôi cấy ............................................................................... 11
iii
1.2.6. Độc lực .............................................................................................. 12
1.2.7. Sự nhân lên ........................................................................................ 13
1.2.8. Tính gây bệnh .................................................................................... 13
1.2.9. Cơ chế sinh bệnh................................................................................ 13
1.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất vacxin...................................................... 14
1.3.1. Trên thế giới.......................................................................................... 14
1.3.2. Ở Việt Nam........................................................................................... 15
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 17
2.1. Vật liệu....................................................................................................... 17
2.1.1. Giống Virus .......................................................................................... 17
2.1.2. Động vật thí nghiệm.............................................................................. 17
2.1.3. Môi trường và hóa chất ......................................................................... 17
2.1.4. Thiết bị chuyên dụng............................................................................. 18
2.2. Phương pháp ............................................................................................. 18
2.2.1. Thử nghiệm HA (Haemagglutination Test) ........................................... 18
2.2.2. Tiêm vào xoang niệu mô ....................................................................... 19
2.2.3. Giám định đặc tính sinh học của virus Newcastle .................................. 19
2.2.3.1. Tiêm truyền giống virus Newcastle trên gà mẫn cảm ...................... 19
2.2.3.2. Xác định chỉ số EID50, MDT........................................................... 19
2.2.3.3. Xác định chỉ số LD50 ....................................................................... 21
2.2.3.4. Xác định chỉ số ICPI ....................................................................... 22
2.2.3.5. Xác định chỉ số IVPI....................................................................... 22
2.2.4. Giám định đặc tính sinh học của IBV .................................................... 23
iv
2.2.4.1. Tiêm truyền giống virus viêm phế quản truyền nhiễm trên gà mẫn
cảm.............................................................................................................. 23
2.2.4.2. Xác định chỉ số EID50 ..................................................................... 23
2.2.5. Nhân giống và thu hoạch virus Newcastle và IBV trên trứng gà có phôi24
2.2.6. Xác định virus và chuẩn độ virus Newcastle và IBV trong nước trứng thu
được................................................................................................................ 25
2.2.7. Xác định hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle và IBV trong huyết
thanh gà được tiêm vacxin nhũ dầu ................................................................. 25
2.2.8. Vô hoạt virus......................................................................................... 26
2.2.9. Kiểm tra vô hoạt................................................................................... 26
2.2.10. Sản xuất vacxin .................................................................................. 26
2.2.11. Kiểm tra chất lượng vacxin ................................................................. 28
2.2.11.1. Vô trùng........................................................................................ 28
2.2.11.2. Tiêu chuẩn về vật lý ...................................................................... 28
2.2.11.3. Chỉ tiêu an toàn của vacxin trên gà................................................ 28
2.2.11.4. Hiệu lực ........................................................................................ 28
2.2.12. Xử lý số liệu........................................................................................ 29
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 30
3.1. Giám định đặc tính sinh học của virus Newcastle ................................... 30
3.1.1. Ổn định giống virus PV1 trên phôi gà ................................................... 30
3.1.2. Tiêm truyền giống virus PV1 trên gà mẫn cảm...................................... 31
3.1.3. Chuẩn độ giống virus PV1 trên phôi gà ................................................. 32
3.1.4. Chuẩn độ giống virus PV1 trên gà ......................................................... 34
3.1.4.1. Xác định chỉ số LD50 ....................................................................... 34
v
3.1.4.2. Tiêm não gà con 1 ngày tuổi ........................................................... 35
3.2. Giám định đặc tính sinh học của IBV....................................................... 37
3.2.1. Ổn định giống virus MV trên phôi gà .................................................... 37
3.2.2. Tiêm truyền giống virus MV trên gà mẫn cảm ...................................... 38
3.2.3. Chuẩn độ giống virus MV trên phôi gà.................................................. 39
3.3. Nhân giống và kiểm tra tiêu chuẩn giống................................................. 41
3.3.1. Với giống virus Newcastle cường độc ................................................... 41
3.3.2. Với giống virus IB cường độc ............................................................... 41
3.4. Chuẩn độ virus trên phôi gà ..................................................................... 43
3.5. Kiểm tra 2 giống virus (PV1 và MV) sau vô hoạt .................................. 43
3.6. Sản xuất vacxin.......................................................................................... 45
3.7. Kiểm tra vô trùng vacxin .......................................................................... 45
3.8. Kiểm tra chỉ tiêu vật lý, an toàn của vacxin ............................................. 45
3.9. Kiểm tra hiệu lực vacxin trên gà 2 tháng tuổi.......................................... 47
3.9.1. Theo dõi sự biến động hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle và IB
trên gà 2 tháng tuổi chưa được miễn dịch cơ sở............................................... 47
3.9.2. Theo dõi sự biến động hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle và IB
trên gà 2 tháng tuổi đã được miễn dịch cơ sở .................................................. 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 61
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BPL
Betapropiolactone
CEK
Chick Embryo Kidney
CEL
Chick Embryo Liver
CK
Chick Kidney
CPE
Cytopathic Effect
CRD
Chronic Respiratory Disease
EID50
Embryo Infective Dose 50%
FAO
Food and Agriculture Organization
HA
Haemagglutination Test
HI
Haemagglutination Inhibition Test
HN
Haemagglutinin - Neuraminidaza
IB
Infectious Bronchitis
IBV
Infectinous Bronchitis Virus
ICPI
Intracerebral Pathogenicity Index
IVPI
Intravenous Pathogenicity Index
LD50
Lethalis Dose 50%
MDa
Megadalton
MDT
Mean Dead Time
NP
Nucleoprotein
vii
ORF
Open Reading Frame
PBS
Phosphate Buffered Saline
PMV-1
Paramyxovirus-1
RNP
Ribonucleoprotein
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Chỉ số độc lực của một số chủng virus Newcastle................................ 6
Bảng 2.1. Xác định chỉ số EID50 ........................................................................ 20
Bảng 2.2. Xác định chỉ số LD50 ......................................................................... 21
Bảng 2.3. Xác định chỉ số ICPI.......................................................................... 22
Bảng 2.4. Xác định chỉ số IVPI ......................................................................... 23
Bảng 2.5. Xác định chỉ số EID50 ........................................................................ 24
Bảng 3.1. Kết quả tiêm truyền giống PV1 trên phôi gà ...................................... 30
Bảng 3.2. Kết quả tiêm truyền giống PV1 trên gà mẫn cảm ............................... 31
Bảng 3.3. Kết quả xác định chỉ số EID50 (log10) của giống PV1 lần 1............... 33
Bảng 3.4. Kết quả xác định chỉ số LD50 (log10) của giống PV1 lần 1 ................ 34
Bảng 3.5. Kết quả xác định chỉ số ICPI bằng giống virus PV1........................... 36
Bảng 3.6. Kết quả xác định chỉ số IVPI bằng chủng virus PV1.......................... 37
Bảng 3.7. Kết quả tiêm truyền giống MV trên phôi gà....................................... 37
Bảng 3.8. Kết quả tiêm truyền giống MV trên gà mẫn cảm................................ 39
Bảng 3.9. Kết quả xác định chỉ số EID50 (log10) của giống MV lần 1 ............... 40
Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra virus sau vô hoạt trên phôi gà ............................... 44
Bảng 3.11. Kết quả sản xuất vacxin ................................................................... 45
Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin ..................................................... 45
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra tính ổn định của vacxin ......................................... 46
Bảng 3.14. Kết quả kiểm tra an toàn của các lô vacxin nhũ dầu trên gà ............. 46
Bảng 3.15. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà 2 tháng tuổi
chưa được miễn dịch cơ sở newcastle................................................................ 48
Bảng 3.16. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà 2 tháng tuổi chưa
được miễn dịch cơ sở IB.................................................................................... 50
Bảng 3.17. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà 2 tháng tuổi
đã được miễn dịch cơ sở newcastle.................................................................... 52
Bảng 3.18. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà 2 tháng tuổi đã được
miễn dịch cơ sở IB............................................................................................. 54
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh của NDV được chụp dưới kính hiển vi điện tử. ..............................3
Hình 1.2. Hình ảnh của IBV được chụp dưới kính hiển vi điện tử.................................8
Hình 2.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin nhị giá ND & IB nhũ dầu .......................27
Hình 3.1. Bệnh tích do virus cường độc Newcastle gây ra ở phôi gà...........................42
Hình 3.2. Bệnh tích do virus cường độc IB gây ra ở phôi gà .......................................42
Hình 3.3. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà chưa được
miễn dịch cơ sở ..........................................................................................................49
Hình 3.4. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà chưa được miễn dịch
cơ sở...........................................................................................................................51
Hình 3.5. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus newcastle ở gà đã được miễn
dịch cơ sở ...................................................................................................................53
Hình 3.6. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà đã được miễn dịch cơ
sở ...............................................................................................................................55
Hình 3.7. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle ở gà chưa có miễn
dịch cơ sở và gà đã được miễn dịch cơ sở được tiêm vacxin lô 1 ................................56
Hình 3.8. Biến động hiệu giá kháng thể kháng virus IB ở gà chưa có miễn dịch cơ
sở và gà đã được miễn dịch cơ sở được tiêm vacxin lô 1 ............................................56
1
MỞ ĐẦU
Ở Việt Nam hiện nay, chăn nuôi theo phương thức công nghiệp đang từng
bước dần thay thế phương thức chăn nuôi nhỏ lẻ theo quy mô hộ gia đình. Nuôi gia
cầm trong đó nuôi gà là một trong những nghề được quan tâm hàng đầu, vì thời
gian nuôi ngắn thu được sản phẩm nhanh. Một trong những khâu quan trọng để đảm
bảo chăn nuôi gà phát triển mạnh và có lãi là bảo vệ cho đàn gà tránh khỏi dịch
bệnh.
Đồng thời với việc phát triển nghề chăn nuôi gà theo phương thức công
nghiệp, các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gà cũng nảy sinh, gây thiệt hại cho
ngành chăn nuôi, như các bệnh: Bệnh Newcastle, bệnh Gumboro, bệnh Viêm phế
quản truyền nhiễm, bệnh hô hấp mãn tính (CRD), bệnh tụ huyết trùng…đặc biệt là
bệnh Newcastle và bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm đã được người chăn nuôi
quan tâm rất nhiều.
Bệnh Newcastle hay còn gọi là bệnh gà rù là một bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm cấp tính, lây lan rộng của loài gà do một loại virus thuộc nhóm Paramyxovirus
gây ra (Bear & Hanson, 1980). Đặc điểm là gà ủ rũ, kém hoạt động, bỏ ăn, lông xù
như khoát áo tơi, nền chuồng có nhiều bãi phân trắng; gà sốt cao 42 - 430C, chảy
nước mũi, khó thở, rối loạn tiêu hóa; có triệu chứng thần kinh. Ngoài ra, bệnh tích
điển hình là niêm mạc dạ dày tuyến xuất huyết lấm tấm chấm màu đỏ, niêm mạc
ruột xuất huyết; niêm mạc miệng hầu, khí quản xuất huyết[2]. Bệnh viêm phế quản
truyền nhiễm gà do virus thuộc nhóm Coronavirus gây ra, là một bệnh truyền nhiễm
cấp tính, dễ lây lan tiếp xúc với những triệu chứng đặc trưng ở đường hô hấp như
ho, chảy nước mũi, viêm hầu họng và dịch thẩm xuất tích tụ nhiều ở niêm mạc khí
phế quản làm con vật khó thở, hắt hơi và có tiếng ran khí quản. Bệnh tích điển hình
là niêm mạc mũi, khí quản, phế quản và lòng phế nang xung huyết, chứa dịch.
Ngoài ra, bệnh có thể ảnh hưởng lớn đến sản lượng và chất lượng trứng ở đàn gà
đẻ[1],[2].
2
Các bệnh trên có tỷ lệ nhiễm cao và là một trong những nhân tố chính gây
giảm hiệu quả kinh tế đối với ngành chăn nuôi gà. Cho đến nay, bệnh chưa có thuốc
trị. Biện pháp tốt nhất để kiểm soát dịch bệnh là thực hiện an toàn sinh học trong
chăn nuôi và sử dụng vacxin phòng bệnh[1],[2].
Tiêm phòng cho gà bằng vacxin nhược độc, đơn giá có ưu điểm là tạo miễn
dịch nhanh, hiệu lực miễn dịch cao. Tuy nhiên, khi sử dụng vacxin đơn giá để tiêm
phòng cần phải bắt gà nhiều lần, tạo phản ứng stress gây bất lợi cho gà, ảnh hưởng
tới năng suất sản xuất. Vacxin đa giá là giải pháp hữu hiệu trong việc phòng bệnh
cho gia cầm.
Trong công tác phòng bệnh cho gia cầm thì việc chế tạo vacxin đa giá vô
hoạt phòng bệnh cho gia cầm là xu thế hiện nay của các nhà sản xuất vacxin trên thế
giới hiện nay và lâu dài. Để giảm bớt những nhược điểm khi tiêm phòng bằng
vacxin nhược độc, vacxin đơn giá, đại bộ phận các nhà sản xuất vacxin lớn trên thế
đã tập trung nghiên cứu và đưa vào sản xuất các loại vacxin đa giá vô hoạt dùng
trong phòng bệnh cho gà. Để đáp ứng yêu cầu của đợt thực tập tốt nghiệp cuối khóa
tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị
giá phòng bệnh Newcastle và viêm phế quản truyền nhiễm ở gà”. Đề tài được
thực hiện tại Bộ môn nghiên cứu Siêu vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung - Km
4, Đường 2/4 - Vĩnh Hòa - Nha Trang - Khánh Hòa. Với những nội dung nghiên
cứu sau:
- Giám định một số đặc tính sinh học của hai giống virus cường độc NDV và
viêm phế quản truyền nhiễm IBV.
- Kiểm tra tiêu chuẩn giống cường độc Newcastle và IBV đưa vào sản xuất
vacxin. Nhân giống và chuẩn độ 02 giống virus trên phôi gà.
- Vô hoạt và kiểm tra chỉ tiêu vô hoạt hai giống virus NDV và IBV.
- Chế tạo vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá phòng bệnh Newcastle và viêm phế
quản truyền nhiễm gà với chất bổ trợ nhũ dầu.
- Kiểm tra tiêu chuẩn về vật lý, vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin.
3
Chương 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Virus Newcastle
1.1.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa
Virus
Newcastle
là
PV-1
(Paramyxovirus-1), thuộc chi Rubulavirus,
tộc
Paramyxovirinae,
họ
Paramyxoviridae[3].
Đây là virus ARN 1 sợi âm có vỏ
bọc.
Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử thấy
virion có đường kính 120 - 300 nm, thường
có dạng hình cầu hoặc hình que, hình sợi.
Vỏ bọc có độ dày khoảng 10 nm. Trên bề
[12]
mặt có hai loại gai (Spike) glycoprotein sắp xếp chặt chẽ.
Do không bền vững, khi bị làm đông giá và tan giá hay khi được tinh vỏ bọc
ngoài thường bị phá hủy dễ dàng, nên dưới kính hiển vi điện tử thường thấy
nucleocapsid trần. Nucleocapsid đối xứng xoắn dạng sợi thừng có chiều rộng 14 18 nm, chiều dài khoảng 1 µm[1]. Virus có thể qua được màng lọc Berkerfeld,
Chamberland và màng lọc Seiz. Virus gây ngưng kết hồng cầu gà, bò, vịt, chuột
bạch, chuột lang và nhóm máu O của người nhưng không gây ngưng kết ở ngựa,
lừa, la, thỏ[2].
1.1.2. Cấu trúc hệ gen
Genom virus là RNA 1 sợi âm đơn nhất. Phân tử lượng khoảng 5 - 7 MDa,
kích thước khoảng 15 kb và hệ gen chiếm 0,5% trọng lượng virion. Hằng số sa lắng
khoảng 50S - 57 S[3].
Hầu hết virus gây bệnh Newcastle cho gia cầm có trình tự 112R/K-R-Q-K/RR116 ở phần cuối C của F2 protein và F (phenylalanine) ở phần còn lại 117, N - phần
4
cuối của protein F1, trong khi virus có độc lực thấp hơn có trình tự ở phần tương
ứng là 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 và L (Leucine) ở phần còn lại 117[13].
1.1.3. Protein
Virus có 7 - 8 khung phiên mã ( ORF: Open Reading Frame - khung đọc mở:
là đoạn DNA đủ dài, không bị chặn bởi bộ ba mã dừng để mã hóa một polypeptide
có chức năng protein), trên đó miền P được sao mã trùng lặp hay có sự trùng lặp
gen cho nên có thể phiên dịch được 10 - 12 loại protein.
Có 7 loại protein cấu trúc:
Nucleoprotein (NP): là một protein kiềm kết hợp với RNA tạo thành
nucleocapsid, có tác dụng bảo vệ RNA virus.
Haemagglutinin - neuraminidaza (HN): có đặc tính ngưng kết hồng
cầu gà và có hoạt tính của men neuraminidaza có tác dụng cắt đứt các thụ thể hồng
cầu.
Fusion protein (F, glycoprotein F, protein dung hợp): có hoạt tính
dung hợp màng tế bào và hoạt tính dung huyết. Protein F được tổng hợp ở dạng tiền
thể (protein FO), dưới tác động của enzyme phân giải protein của tế bào ký chủ mà
phân cắt thành hai phần là F1 và F2. Nó biểu hiện hoạt tính dung hợp màng và có
hoạt động quan trọng trong việc xâm nhập của virus và hình thành các tế bào khổng
lồ đa nhân[4].
Protein SH (Protein kỵ thủy ngắn): chưa rõ chức năng[3].
Large protein (L): chưa rõ chức năng.
Matrice protein (M, protein màng): tồn tại mặt trong áo ngoài, có tác
dụng gắn RNA của virus với vỏ bọc
Phospho nucleoprotein: hình ống dài và xoắn ốc nhiều vòng, chưa rõ
chức năng[4].
1.1.4. Sức đề kháng
Do virus có màng bọc ngoài là lipid nên rất dễ mẫn cảm với các chất hóa học
như ether, chloroform, cồn, formol, phenol và làm mất khả năng gây nhiễm nhưng
không ảnh hưởng đến tính miễn dịch của virus. Ở nhiệt độ 560C virus bị tiêu diệt
5
trong 3 giờ, ở 600C là trong 3 phút, ở 1000C là 1 phút; từ 4 - 200C virus có thể tồn
tại trong 1 tháng, ở nhiệt độ âm virus tồn tại hằng năm. Khả năng chịu nhiệt của
từng chủng virus là đặc tính di truyền. Các chủng virus khác nhau có khả năng chịu
nhiệt khác nhau, ở nhiệt độ 56oC có chủng virus chịu được đến 6 giờ mà còn khả
năng gây nhiễm ví dụ như chủng virus Newcastle chịu nhiệt V4. Ở pH < 2 hoặc pH
> 10 virus mất khả năng gây nhiễm. Virus dễ bị diệt bởi tia tử ngoại. Dung dịch
Glyxerin 50% có thể giữ virus trong bệnh phẩm được 7 ngày ở 370C[4].
1.1.5. Đặc tính nuôi cấy
Trên phôi gà: Cấy virus vào xoang niệu mô phôi thai gà ấp 10 - 12 ngày, tùy
theo độc lực từng chủng virus mà phôi thai có thể chết 48 - 96 giờ. Nói chung các
chủng có độc lực cao và vừa gây chết phôi trong vòng 60 giờ, còn các chủng có độc
lực thấp phải trên 100 giờ mới gây chết phôi, bệnh tích trên phôi chủ yếu là gây
xuất huyết điểm ở đầu và cánh, có khi tụ máu và gây xuất huyết khắp phôi thai.
Phôi càng non thì khả năng gây nhiễm và thời gian gây chết phôi nhanh hơn, tỷ lệ
gây chết phôi cũng cao hơn. Đặc điểm quan trọng là sau khi cấy truyền đời qua phôi
thai gà nhiều lần, người ta thu được giống virus Newcastle nhược độc dùng để chế
tạo vacxin phòng bệnh.
Trên tế bào nuôi cấy: có thể nuôi cấy virus Newcastle vào môi trường tế bào
thận khỉ, thận lợn, hoặc tế bào xơ phôi thai gà 1 lớp. sau 24 giờ gây nhiễm, virus
làm hủy hoại tế bào, làm cho tế bào bị biến đổi hình thái, tế bào co tròn lại hay vỡ ra
hoặc tạo thành các tế bào khổng lồ.
Trên động vật: có thể dùng gà giò để tiêm truyền nuôi cấy, virus sẽ phát triển
và gây bệnh cho gà giống như gà mắc bệnh tự nhiên[4].
1.1.6. Độc lực
Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng trình tự nucleotide trên gen mã hóa
trình tự acid amin tại thời điểm cắt protein F liên quan chặt chẽ với độc lực của
virus[7].
Virus Newcastle có nhiều chủng, các chủng này có độc lực khác nhau, căn
cứ vào tính độc và khả năng gây bệnh người ta chia làm 3 nhóm:
6
Nhóm Velogen: gồm các chủng có độc lực cao, đó chính là virus
cường độc tự nhiên.
Nhóm Mesogen: gồm các chủng có độc lực vừa, là những virus chỉ
gây bệnh nhẹ cho gà trên 6 tuần tuổi như chủng H (Herfoshine), chủng M
(Mukteswar), chủng này khi tiêm cho phôi gà 10 - 11 ngày, làm chết phôi thai và
gây xuất huyết toàn phôi thai.
Nhóm Lentogen: là các chủng có độc lực thấp gồm những virus không
có khả năng gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ cho gà con mới nở như chủng B1,
chủng Lasota, chủng F[2].
Bảng 1.1. Chỉ số độc lực của một số chủng virus Newcastle
Chủng virus
Nhóm
ICPI
IVPI
MDT
Ulster 2C
Lentogenic
0.0
0.0
>150
Queenlands V4
Lentogenic
0.0
0.0
>150
Hitchner B1
Lentogenic
0.2
0.0
120
F
Lentogenic
0.25
0.0
119
Lasota
Lentogenic
0.4
0.0
103
H
Mesogenic
1.2
0.0
48
Mukteswar
Mesogenic
1.4
0.0
46
Roakin
Mesogenic
1.45
0.0
68
Beaudett C
Mesogenic
1.6
1.45
62
GB Texas
Velogenic
1.75
2.7
55
NY Parrot 70181 1972
Velogenic
1.8
2.8
51
Italien
Velogenic
1.85
2.8
50
Milano
Velogenic
1.9
2.8
50
Herts ‘33/56
Velogenic
2.0
2.7
48
Pigeon/ England/561/83
1.5
0.0
120
Chicken/England/702/84
1.9
2.1
60
1.1.7. Sự nhân lên
7
Paramyxovirus nếu kết hợp với thụ thể có chứa axit sialic thì nhờ hoạt tính
dung hợp màng của protein F mà gây dung hợp áo ngoài với màng tế bào, đưa
nucleocapsid vào bên trong màng tế bào. Trong nucleocapsid đã có sẵn enzyme
RNA-polymerase phụ thuộc RNA, dưới tác động của enzyme này trên khuôn RNA
virus diễn ra sự tổng hợp các mRNA đơn cistron (mRNA phiên chỉ 1 gen cấu trúc)
dài ngắn khác nhau. Trên ribosom, các mRNA đó tham gia tổng hợp hoàn toàn hình
thành chuỗi RNA dương. Trên khuôn chuỗi dương này RNA virus (chuỗi âm) được
tổng hợp và kết hợp ngay với protein cấu trúc vừa được tổng hợp mà hình thành
nucleocapsid. Một mặt, các glycoprotein vừa được tổng hợp được chuyển từ màng
lưới nội chất hạt sang màng lưới nội chất nhẵn, rồi bộ máy golgi rồi đến màng tế
bào chất và tổ hợp vào trong màng tế bào. Protein M được tổng hợp tương tự cũng
chuyển động ra dưới màng tế bào chất và cố định với các glycoprotein ở màng.
Nucleocapsid di động đến dưới protein M, nhận áo ngoài nhờ nảy chồi qua màng đã
biến đổi sẵn nêu trên mà thành thục. Tuy nhiên, thông thường hầu hết các
nucleocapsid ở lại bên trong tế bào chất ký chủ và được quan sát thấy dưới dạng các
thể ẩn nhập trong tế bào chất. Trong cảm nhiễm Paramyxovirus, ngoài sự khuếch
tán cảm nhiễm theo cách nảy chồi qua màng còn đồng thời diễn ra hình thức lan
truyền từ tế bào qua tế bào (cell to cell infection). Khi đó, nhờ cơ năng dung hợp
màng của protein F, xuất hiện sự dung hợp ở bề mặt tế bào, qua đó từ tế bào đã
nhiễm RNA virus lưu nhập sang các tế bào lân cận. Vì vậy, cảm nhiễm kéo dài cũng
là đặc trưng khác của các virus thuộc họ này[3].
1.1.8. Tính gây bệnh
Trong tự nhiên: Virus Newcastle gây bệnh cho các loài gà, gà tây, bồ câu,
chim sẻ. Còn Vịt, vịt trời, ngan, ngỗng cũng có thể mắc nhưng ở mức độ nhẹ hơn.
Gà mắc bệnh ở các lứa tuổi khác nhau, song thường tập trung ở lứa tuổi từ 2 - 5
tháng tuổi. Người cũng có thể bị nhiễm virus Newcastle, thời gian nung bệnh từ 1 4 ngày, biểu hiện viêm kết mạc mắt, đôi khi có sốt và nhức đầu[4]. Một số động vật
có vú như chó, chuột…cũng mắc bệnh này[2].
8
Trong phòng thí nghiệm: bào thai gà 9 - 12 thích nghi nhất với việc nuôi cấy
virus. Sau khi tiêm 36 - 48 giờ toàn bộ bào thai và nước trứng chứa virus[2]. Dùng
gà giò để gây bệnh, sau khi tiêm truyền virus gà sẽ có triệu chứng và bệnh tích
giống như gà mắc bệnh tự nhiên. Có thể dùng chim bồ câu để gây bệnh bằng cách
tiêm virus vào bắp thịt, sau 6 - 8 ngày bồ câu bị tê liệt và chết sau 15 - 16 ngày.
Ngoài ra cũng có thể tiêm vào óc hay xoang phúc mạc chuột bạch, chuột sẽ chết sau
3 - 6 ngày[4].
1.1.9. Cơ chế sinh bệnh
Thông thường căn bệnh theo đường tiêu hóa xâm nhập vào cơ thể. Virus
thường thâm nhiễm qua niêm mạc hầu - họng rồi vào máu. Virus gây nhiễm trùng
máu. Cũng trong thời gian đó căn bệnh đi vào hầu hết cơ quan và tổ chức của cơ thể
và gây viêm hoại tử. Nội mô thành huyết quản bị phá hoại gây xuất huyết và thâm
nhiễm dịch xuất vào các xoang trong cơ thể. Virus không trực tiếp gây viêm phổi
song bệnh thường gây ra khó thở nghiêm trọng. Nguyên nhân là do virus tác động
gây rối loạn hệ tuần hoàn và trung khu hô hấp của hệ thần kinh trung ương.
Phần lớn gà nhiễm bệnh thường chết ở thời kỳ nhiễm trùng huyết. Đó là thể
cấp tính. Trường hợp bệnh kéo dài hơn, thường ở giai đoạn cuối dịch hay bệnh ở
những loài ít cảm thụ như thủy cầm, virus sẽ biến mất khỏi máu rồi đi đến các cơ
quan phủ tạng để vào ký sinh trong tổ chức thần kinh trung ương. Kết quả dẫn đến
thể bệnh mạn tính. Phản ứng thuốc khi tiêm vacxin cũng là một trạng thái của bệnh
này[2].
1.2. Virus viêm phế quản truyền nhiễm gà (IBV)
1.2.1. Hình thái và các tính trạng lý, hóa
IBV thuộc chi Coronavirus, họ Coronaviridae[3].
IBV có nhiều hình thái khác nhau nhưng chủ yếu là hình cầu. Nó có lớp vỏ
bọc, virion có đường kính 120 nm với các gai (spikes) hình dùi trên bề mặt với độ
dài khoảng 20 nm. Những gai này không xếp gần nhau như gai hình que của
paramyxovirus. Cấu trúc của ribonucleoprotein (RNP, core) được giải
phóng một cách ngẫu nhiên từ những tiểu phần đã bị phân hủy có thể nhận ra từ
9
những tàn tích mà không phải bằng cách
nhuộm tiêu bản. Hầu hết các đoạn RNP có
dạng sợi với đường kính chỉ 1 - 2 nm. Cấu
trúc vòng xoắn với đường kính 10 - 15 nm
đôi lúc cũng được thấy[12].
Các chủng IBV khác nhau về mật
độ của chúng trong dung dịch đường, mật
độ lớn nhất thường trong khoảng 1,15 1,18 g/ml, nhưng các tiểu phần thấp hơn
(không có hoặc thiếu hụt RNP) và mật độ
[15]
cao hơn cũng có thể đạt được. Tốc độ ly tâm lớn hơn 100.000 g thì cần phải tránh vì
như thế sẽ làm mất những gai đó. IBV chủng Beaudette dường như không ổn định
đặc biệt; ấp trứng ở 37oC đôi khi làm mất một trong những thành phần của gai[12].
1.2.2. Cấu trúc hệ gen
RNA hệ gen có tính cảm nhiễm, là chuỗi một sợi phân bố thẳng, có cấu trúc
7 Me Gppp ở đầu 5’ và đoạn poly - A ở đầu 3’. Phân tử lượng của RNA hệ gen
khoảng 9 - 11 MDa, kích thước 27 - 33 kb[3].
1.2.3. Protein
Virion có 4 protein cấu trúc là S, M, E và N.
Spike glycoprotein (S): yếu tố quy định đặc tính gây ngưng kết hồng cầu và
đặc tính trung hòa của virus.
Protein màng (M).
Protein vỏ (E): quan trọng đối với sự lắp ráp của virus.
Nucleoprotein (N): bao quanh và bảo vệ bộ gen RNA của virus[14].
Glycoprotein S bao gồm hai tiểu đơn vị là S1 và S2, trình bày một loạt các yếu tố
quyết định kháng nguyên có thể gây ra việc sản xuất kháng thể trung hòa cụ thể và
cũng kích hoạt hệ miễn dịch tế bào. Hầu hết các phương pháp phân loại huyết thanh
được dựa trên các tiểu đơn vị S1. Cấu trúc protein này phụ thuộc vào các tiểu đơn vị
bổ sung cho S2 mà yếu tố này quy định hành vi neo đậu các protein S vào vỏ lipid.
10
Ngoài protein S, protein nucleocapsid (N) là một protein cấu trúc quan trọng có thể
góp phần gây bệnh của virus. Các protein N nằm bên trong các virion, gắn liền với
hệ gen của nó và tương tác với protein nhân của virus và tế bào vật chủ. Chức năng
sinh học quan trọng được quy định cho N - phosphoprotein, trong đó sự nhân lên
của virus, sự tương tác nhóm rRNA và bắt đầu nảy nở của các hạt virus trong tế bào
vật chủ bị nhiễm bệnh. Các gen mã hóa protein N được bảo toàn theo các chủng
IBV khác nhau, cho phép tái tổ hợp giữa các chủng khác nhau[7].
1.2.4. Sức đề kháng
Đối với nhiệt độ: Hầu hết các chủng IBV đều bị bất hoạt sau 15 phút ở 560C
và sau 90 phút ở 450C. Bảo quản IBV ở -200C sẽ tránh được điều đó. Dịch niệu
chứa virus không thay đổi sau khi bảo quản ở -300C trong nhiều năm. Mô bào
nhiễm virus bảo quản tốt trong glyxerol 50% và mô ở trong môi trường này có thể
được đem đi chẩn đoán trong phòng thí nghiệm mà không cần làm lạnh. Ở ngoài
môi trường, vào mùa xuân nó có thể tồn tại được khoảng 12 ngày, còn vào mùa
đông thì khoảng 56 ngày[12].
Đối với sự đông khô: Dịch niệu chứa virus được đông khô, bao gói trong
chân không và bảo quản trong phòng lạnh nó có thể sống được tối thiểu là 30 năm.
Hàm lượng glucose 10% đem lại cho IBV tính ổn định hiệu quả trong giai đoạn
đông khô, cũng như đông lạnh[12].
Đối với pH: Các chủng virus khác nhau thì có tính bền vững khác nhau ở pH
= 3. Trong một nghiên cứu, sự giảm đi của hiệu giá virus ở nhiệt độ thường trong
thời gian 4 giờ thay đổi từ 1 - 2 log10 cho hầu hết các phân lập, 5 log10 đối với
những phân lập khác. IBV khi nuôi cấy trong tế bào thì bền vững trong môi trường
ở pH = 6 và pH = 6,5 hơn ở pH = 7,0 - 8,0[12].
Đối với hóa chất: Thông thường các chủng IBV dễ mẫn cảm với ether,
nhưng một số chủng khác có thể tồn tại được ở nồng độ ether 20%, tất cả những
virus đều bị tiêu diệt bởi chloroform 50% và sodium deoxycholate 0,1%. IBV được
xem là nhạy cảm đối với các chất sát trùng thông thường. Khi xử lý bằng
betapropiolactone (BPL) với nồng độ 0,05% hoặc 0,1% cũng như formalin 0,1% thì
11
sẽ tiêu diệt được IBV. Khi chỉ xử lý bằng BPL sẽ không gây ảnh hưởng bất lợi đến
khả năng gây ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên IBV[12].
1.2.5. Đặc tính nuôi cấy
Nuôi cấy trên phôi gà: IBV phát triển tốt trên phôi gà đang phát triển. Đặc
điểm nuôi cấy khởi đầu trên phôi gà 10 - 11 ngày tuổi là một số phôi bị còi cọc với
tỷ lệ sống là 90% ở ngày thứ 19 của quá trình ấp trứng. Số phôi chết và còi cọc tăng
lên theo quá trình cấy truyền. Vì vậy ở lần cấy truyền thứ 10 hầu hết các phôi bị còi
cọc và trên 80% số phôi chết ở ngày thứ 20 của quá trình ấp trứng[12].
Sự thay đổi của phôi được thấy rõ sau khi gây nhiễm một vài ngày. Chỉ
những thay đổi nhỏ của phôi cũng có thể được thấy khi soi trứng. Từ phía trên
buồng hơi đến cuối trứng, phôi dường như bị xoắn vặn ở trong khối trứng với đôi
chân bị biến dạng và bị ép phía trên đầu với màng ối dày dính chặt lên nó[12].
Nuôi cấy tế bào: Nuôi cấy tế bào một lớp rất được chú ý trong nghiên cứu
virus IBV, tế bào thận phôi gà (CEK) và tế bào thận gà (CK) đã được sử dụng và
hầu hết rất thành công. Sự thích nghi của IBV đối với tế bào CEK đã được kiểm
chứng và đánh giá bởi Gillette năm 1973. Đòi hỏi cần phải có nhiều lần cấy truyền
để tạo ra những tác động bệnh học tế bào một cách bao quát (CPE); biểu hiện rõ rệt
trong nuôi cấy không nhuộm màu, hiệu giá lớn nhất của virus thay đổi theo từng
chủng. Mặc dù có những đốm hủy hoại tế bào nhưng sự biểu hiện qua sự nhuộm
màu có thể được nhìn thấy sau lần cấy truyền đầu tiên. Sự thích nghi của một số
chủng đối với CEK được dễ dàng khi có sự cấy truyền phôi. Kích thước của những
đốm hủy hoại tế bào và hình dạng của nó thay đổi theo ảnh hưởng của từng chủng
virus khác nhau. Kích thước của những phần bệnh tích khi ảnh hưởng bởi hầu hết
các chủng ở 400C lớn hơn ở 370C[12].
Giai đoạn tìm ẩn của virus IBV trong tế bào CEK hoặc CK là 3 - 4 giờ, với
hiệu giá cực đại đạt được trong môi trường nuôi cấy đạt sau 13 - 14 giờ, phụ thuộc
vào mức độ sinh sôi nảy nở của virus. Tế bào gan phôi gà (CEL) cũng đã được chế
để xác định hiệu giá của IBV giống như từ tế bào CEK. Việc chuẩn độ IB trong
phôi gà thường cho hiệu quả cao hơn trong tế bào CEK hoặc CK từ 10 - 100 lần,
- Xem thêm -