Tài liệu Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (igy) kháng trực khuẩn mủ xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TIM SUNNARY NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ TRỨNG GÀ (IgY) KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TIM SUNNARY NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ TRỨNG GÀ (IgY) KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH Chuyên ngành: Dị ứng và Miễn dịch Mã số: 62.72.01.09 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS LÊ VĂN ĐÔNG TS. LÊ THU HỒNG HÀ NỘI NĂM 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi cùng các thầy cô ở Bộ môn Miễn dịch, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học, Bộ môn – Khoa Vi sinh y học, Bộ môn – Khoa Giải phẫu bệnh, Học viện Quân y. Các số liệu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một luận án, luận văn nào khác. TÁC GIẢ LUẬN ÁN Tim Sunnary LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô: TS Lê Văn Đông, TS Lê Thu Hồng, TS Nguyễn Đặng Dũng đã hết lòng động viên, tận tình giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám đốc Học Viện Quân Y, Ban giám đốc Bệnh viện 103, Phòng đào tạo Sau đại học, Phòng quản lý nghiên cứu khoa học Học viện Quân y; Đại Sự Quán đặc mệnh toàn quyền và Tuỳ Viên Quân Sự Vương quốc Căm-Pu-Chia tại Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nhân viên các đơn vị: Hệ Quốc Tế, Bộ môn Miễn Dịch, Phòng Protein-Độc chất-Tế bào, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học, Bộ môn – Khoa Vi sinh y học, Bộ môn – Khoa Giải phẫu bệnh, Học viện Quân y đã tận tình hướng dẫn và hỗ trợ kỹ thuật cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài nghiên cứu của luận án. Cảm ơn các anh các chị và các bạn đồng nghiệp đã thân ái giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập; Cảm ơn mọi người thân và gia đình đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. NGHIÊN CỨU SINH Tim Sunnary DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN BCTT Bạch cầu trung tính ĐVDT Đơn vị diện tích ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay (thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzym) HGKT Hiệu giá kháng thể HT Huyết thanh HTKTKMX Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh IgY Yolk Immunoglobin (globulin miễn dịch IgY hay kháng thể IgY) KDa Kilo Dalton NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện NKH Nhiễm khuẩn huyết NMSL Nước muối sinh lý SLVK Số lượng vi khuẩn TKMX Trực khuẩn mủ xanh TN Thí nghiệm WB Western blot MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các từ viết tắt sử dụng trong luận án Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.................................................................................................. 3 1.1. TRỰC KHUẨN MỦ XANH .......................................................................... 3 1.1.1 Đặc điểm hình thể ............................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm nuôi cấy............................................................................ 3 1.1.3. Khả năng gây bệnh........................................................................... 5 1.1.4. Sức đề kháng và khả năng kháng kháng sinh .................................. 6 1.1.5. Phân loại trực khuẩn mủ xanh theo type huyết thanh ...................... 6 1.2. NHIỄM KHUẨN VẾT BỎNG DO TRỰC KHUẨN MỦ XANH .............. 7 1.2.1. Tình hình nhiễm khuẩn vết bỏng do trực khuẩn mủ xanh ............... 7 1.2.2. Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trực khuẩn mủ xanh ở bệnh nhân bỏng ................................................................................ 8 1.2.3. Một số đặc điểm của nhiễm khuẩn tại vết bỏng do ......................... 9 1.3. CÁC BIỆN PHÁP MIỄN DỊCH TRONG PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH ......................................................... 10 1.3.1. Vắc-xin trực khuẩn mủ xanh........................................................... 10 1.3.2. Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh ......................................... 12 1.3.3. Kết hợp vắc-xin, huyết thanh và kháng sinh trong phòng và điều trị nhiễm khuẩn trực khuẩn mủ xanh ...................................... 15 1.4. CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ MÁI THU KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU TỪ TRỨNG GÀ ............................................ 16 1.4.1. Hệ thống miễn dịch của gà.............................................................. 16 1.4.2. Kháng thể IgY ................................................................................. 18 1.4.3. Tính ưu việt của công nghệ sản xuất IgY ....................................... 19 1.5. ỨNG DỤNG CỦA IgY .................................................................................. 22 1.5.1. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán ................................................ 22 1.5.2. Ứng dụng của IgY trong dự phòng và điều trị bệnh ....................... 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 25 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ....................................................................... 25 2.1.2. Động vật để gây bỏng thực nghiệm và lây nhiễm trực khuẩn mủ xanh ................................................................................................. 26 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 26 2.2.1. Trực khuẩn mủ xanh ....................................................................... 26 2.2.2. Hoá chất sinh phẩm ......................................................................... 26 2.2.3. Thiết bị máy móc ............................................................................ 27 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 27 2.3.2. Gây miễn dịch ................................................................................. 28 2.3.3. Tách chiết, tinh sạch IgY từ trứng gà ............................................. 29 2.3.4.Điện di SDS-PAGE phân tích thành phần protein kháng nguyên của trực khuẩn mủ xanh và độ tinh sạch của chế phẩm IgY .......... 31 2.3.5. Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh trong máu gà và sản phẩm tách chiết từ trứng gà..... 32 2.3.6. Phân tích kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot ...................................................................... 33 2.3.7. Thử nghiệm ngưng kết vi khuẩn ..................................................... 33 2.3.8. Thử nghiệm tạo vòng kháng khuẩn in vitro trên môi trường đặc ................................................................................................... 34 2.3.9. Đánh giá độ ổn định của kháng thể IgY trong quá trình bảo quản ................................................................................................. 34 2.3.10. Gây bỏng thỏ thực nghiệm ............................................................ 35 2.3.11. Gây nhiễm khuẩn vết bỏng ........................................................... 36 2.3.12. Điều trị vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh ............................... 37 2.3.13. Xác định số lượng vi khuẩn tại vết thương ................................... 37 2.3.14. Xét nghiệm mô bệnh học .............................................................. 39 2.3.15. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 41 2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ........................................................................... 41 2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU ........................................................................... 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ....................................................................................................... 42 3.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH ....................................................... 42 3.1.1. Kết quả gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh ................................................................................ 42 3.1.2. Tách chiết, tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà ................................ 48 3.1.3. Độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY trong các điều kiện bảo quản khác nhau......................................................................... 56 3.2. HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC................................ 58 3.2.1. Hiệu quả ức chế trực khuẩn mủ xanh trên in vitro ........................ 58 3.2.2. Kết quả điều trị vết bỏng thực nghiệm trên thỏ nhiễm bằng chế trực khuẩn mủ xanh phẩm IgY kháng trực khuẩn mủ xanh .......... 61 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ..................................................................................................... 69 4.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH ....................................................... 69 4.1.1. Về gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu ở gà mái đẻ trứng ................................................................................................ 69 4.1.2. Về tách chiết, tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà ........... 74 4.1.3. Về độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY ................................... 75 4.2. HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC................................ 77 4.2.1. Về hoạt tính in vitro của chế phẩm kháng thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh ................................................................................ 77 4.2.2. Về kết quả điều trị vết bỏng nhiễm bằng trực khuẩn mủ xanh chế phẩm kháng thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh .................... 79 KẾT LUẬN .............................................................................................................................. 83 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................................. 84 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Một số kết quả lâm sàng của huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh ......... 14 1.2. Tính ưu việt của IgY so với IgG ............................................................. 20 3.1. Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng. .............................................. 55 3.2. Hoạt tính ngưng kết từng chủng của trực khuẩn mủ xanh IgY kháng trực khuẩn mủ xanh................................................................................. 59 3.3. Tỷ lệ % các loài vi khuẩn phân lập trên vết bỏng thỏ nhiễm trực khuẩn mủ xanh chủng 6P11 ............................................................................... 64 3.4. Tổn thương mô học vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh sau 10 ngày được điều trị .............................................. 66 4.1. Khuyến cáo cách gây miễn dịch ............................................................. 71 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1. Trực khuẩn mủ xanh. ................................................................................ 5 1.2. Hệ thống kháng thể của gà mái ............................................................... 17 1.3. Cấu trúc phân tử IgY của gà so với IgG của động vật có vú. ................. 19 2.1. Gà mái gây miễn dịch chế tạo IgY kháng trực khuẩn mủ xanh.............. 25 2.2. Gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên trực khuẩn mủ xanh ............. 29 2.3. Hệ thống sắc ký trao đổi ion (BioRad, Mỹ). ........................................... 31 2.4. Gây bỏng thực nghiệm và vết bỏng mới sau gây bỏng........................... 35 2.5. Gây nhiễm khuẩn vết bỏng với trực khuẩn mủ xanh. ............................. 36 2.6. Lấy mẫu xác định số lượng vi khuẩn tại vết thương............................... 38 2.7. Sơ đồ nghiên cứu..................................................................................... 40 3.1. Biến động hiệu giá IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong máu gà trước và sau khi gây miễn dịch ở các lô gà thí nghiệm. ......................... 42 3.2. Hoạt tính IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong lòng đỏ trứng gà được đẻ ra sau lần gây miễn dịch thứ 5 ở các lô gà thí nghiệm. ............. 44 3.3. Hoạt tính IgY trong lòng đỏ trứng gà kháng từng chủng trực khuẩn mủ xanh riêng rẽ........................................................................................... 45 3.4. Kết quả phân tích hoạt tính kháng thể IgY đặc hiệu với các kháng nguyên của từng chủng trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot............... 47 3.5. Ảnh hưởng các tỉ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả tách chiết IgY. ................................................................................................. 49 3.6. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY. .................................... 50 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách chiết IgY. ............................................................................................... 51 Hình Tên hình Trang 3.8. Sắc ký đồ trao đổi ion sản phẩm sau tủa bằng sulphat amoni. ............... 52 3.9. Kết quả phân tích bằng ELISA kiểm tra hoạt tính kháng thể ở các phân đoạn sắc ký. Mỗi phân đoạn được pha loãng ở một hàng theo chiều từ trên xuống dưới ....................................................................... 53 3.10. Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính các sản phẩm sau mỗi bước tách chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà. ................. 54 3.11. Hoạt tính IgY kháng trực khuẩn mủ xanh sau bảo quản ở nhiệt độ phòng. .................................................................................................... 56 3.12. Hoạt tính IgY kháng trực khuẩn mủ xanh sau bảo quản ở 4°C. ......... 57 3.13. Hoạt tính IgY kháng trực khuẩn mủ xanh sau bảo quản ở -20°C. ...... 57 3.14. Ngưng kết vi khuẩn trên lam kính. ....................................................... 59 3.15. Kháng thể IgY ức chế trực khuẩn mủ xanh trên môi trường đặc. .............. 60 3.16. Tổn thương mô học vết thương sau gây bỏng thực nghiệm (10X) .......... 62 3.17. Biến động số lượng vi khuẩn trực khuẩn mủ xanh ở vết bỏng trước và sau điều trị. ....................................................................................... 63 3.18. Đặc điểm mô học vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh sau 10 ngày được điều trị (10X).................................. 67 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn bệnh viện là một vấn đề nan giải lớn cần được giải quyết. Trong số các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) chiếm tỷ lệ cao, thậm chí chiếm tỷ lệ cao nhất ở các nước đang phát triển. Vi khuẩn này có khả năng chịu đựng cao với các yếu tố vật lý, hóa học, môi trường ẩm ướt và có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh, kể cả các kháng sinh mới được đưa vào sử dụng trên lâm sàng. Vì vậy, nhu cầu thực tiễn đòi hỏi cần có các biện pháp điều trị hiệu quả hơn như sử dụng huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh [2], [5]. Công nghệ chế tạo kháng huyết thanh truyền thống dùng cho điều trị bệnh ở người thường sử dụng các động vật lớn có vú như ngựa, cừu. Tuy nhiên công nghệ này có nhược điểm là kích thước động vật lớn, đòi hỏi lượng kháng nguyên để gây miễn dịch phải nhiều; để có kháng thể phải lấy máu động vật để tách huyết thanh hoặc huyết tương rồi tinh chế kháng thể với qui trình chế tạo phức tạp; việc lấy máu động vật không được thường xuyên, từ đó ảnh hưởng đến sản lượng kháng thể thu được từ mỗi cá thể động vật không nhiều [10], [11]. Loài gà có khả năng sinh kháng thể tương tự như động vật có vú. Trong số các kháng thể trong máu gà mái có một lớp kháng thể được chuyển qua và tích tụ trong lòng đỏ trứng, được gọi là IgY (yolk immunoglobulin). Muốn sản xuất kháng thể IgY chỉ cần gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng do chúng đẻ ra là có kháng thể đặc hiệu. Gà mái ở độ tuổi đẻ ổn định, việc thu hoạch trứng được thực hiện hàng ngày với lượng kháng thể thu được từ mỗi quả trứng rất lớn so với kích thước của gà mẹ. Kỹ thuật tách chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng cũng tương đối đơn giản, từ đó công nghệ chế tạo IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ lòng đỏ trứng 2 do gà đẻ ra trở nên đặc biệt hấp dẫn cho yêu cầu sản xuất lượng lớn kháng thể sử dụng cho chẩn đoán và điều trị bệnh ở động vật cũng như cho người [34], [89]. Trên thế giới, các tác giả Thụy Điển đã chế tạo IgY kháng trực khuẩn mủ xanh được Bộ Y tế Thụy Điển cho phép sử dụng để dự phòng nhiễm trực khuẩn mủ xanh đường hô hấp cho các bệnh nhân bị chứng xơ nang phổi (cystic fibrosis) [72]. Tại Việt Nam, các tác giả ở Học viện Quân y đã bước đầu thành công trong việc gây miễn dịch cho gà mái tạo ra được kháng thể IgY kháng một chủng chuẩn trực khuẩn mủ xanh [13]. Xuất phát từ cơ sở lý luận về tính ưu việt của công nghệ sản xuất kháng thể IgY; từ cơ sở thực tiễn về nhu cầu cần có các chế phẩm kháng thể đặc hiệu bổ trợ cho thuốc kháng sinh chống lại các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng nói chung, đặc biệt là trực khuẩn mủ xanh nói riêng; từ cơ sở thực tiễn về tính khả thi trong việc chế tạo IgY kháng trực khuẩn mủ xanh trong điều kiện Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng trực khuẩn mủ xanh” với các mục tiêu: 1. Chế tạo globulin miễn dịch từ lòng đỏ trứng gà (kháng thể IgY) kháng một số chủng trực khuẩn mủ xanh lưu hành tại Việt Nam bằng phương pháp gây miễn dịch cho gà mái, thu hoạch kháng thể từ trứng gà. 2. Đánh giá hiệu quả ức chế trực khuẩn mủ xanh của kháng thể IgY trên in vitro và trên vết thương nhiễm trực khuẩn mủ xanh thực nghiệm. Mục tiêu chung của đề tài là triển khai áp dụng một công nghệ mới, công nghệ chế tạo IgY, phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam và Căm-Pu-Chia, để tạo ra một chế phẩm kháng thể dùng dưới dạng dung dịch rửa hoặc tẩm đắp vết thương để dự phòng và điều trị vết thương, vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh, phục vụ cho công cuộc kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện do loài vi khuẩn này. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. TRỰC KHUẨN MỦ XANH Trực khuẩn mủ xanh (TKMX) là một vi khuẩn Gram âm thuộc giống Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae, được phát hiện từ năm 1872. TKMX có khả năng chịu đựng cao với các yếu tố vật lý, hóa học, môi trường ẩm ướt và có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh, kể cả các kháng sinh mới được đưa vào sử dụng trên lâm sàng. Do tính kháng đa kháng sinh nên TKMX đang trở thành vấn đề thực sự khó khăn trong việc phòng và điều trị các nhiễm khuẩn thông thường và nhiễm khuẩn huyết (NKH) do loài vi khuẩn này nói chung, nhiễm khuẩn vết thương bỏng nói riêng. Vì vậy, nhu cầu thực tế đang đòi hỏi cần có các biện pháp dự phòng và điều trị hiệu quả hơn đối với nhiễm TKMX [2], [18], [26], [29], [82]. 1.1.1 Đặc điểm hình thể TKMX là vi khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng lẻ, hoặc thành đôi và có khi xếp thành chuỗi, kích thước 1,5 - 3 x 0,5 - 0,8µm, di động nhờ vào lông ở cực (rất hiếm chủng không có khả năng di động), có pili, không có bào tử. Những chủng TKMX phân lập trên da và tuyến nhày có thể có nhiều hình thái [2], [5]. 1.1.2. Đặc điểm nuôi cấy TKMX là vi khuẩn ưa khí tuyệt đối, phát triển dễ trên các môi trường thông thường, nhiệt độ thích hợp 30 - 37ºC nhưng vi khuẩn cũng có thể mọc ở 42ºC, pH 7,0 - 7,2. Trong môi trường lỏng, sau 18 - 24 giờ vi khuẩn mọc làm đục đều môi trường và tạo váng trên bề mặt [2]. Tính chất khuẩn lạc: trên môi trường đặc, vi khuẩn phát triển có thể có 3 dạng khuẩn lạc: 4 - Dạng S (Smooth) là khuẩn lạc nhỏ, tròn, trơn, nhẵn, bờ đều đặn, trung tâm hơi lồi. Đây là dạng khuẩn lạc hay gặp trong tự nhiên. - Dạng R (Rough) là khuẩn lạc to, xù xì, bờ không đều. Phần lớn những chủng TKMX gây bệnh có khuẩn lạc dạng R. - Dạng M (Mucoid) là khuẩn lạc tròn, nhầy, rất hiếm gặp. Dạng khuẩn lạc này thường phân lập được từ bệnh nhân bị nhiễm trùng mạn tính. Tính chất sinh sắc tố: một trong các đặc tính quan trọng của TKMX là khả năng sinh sắc tố khi phát triển trên môi trường dinh dưỡng hoặc trên các tổ chức tế bào cơ thể. Đặc tính này có ý nghĩa trong việc xác định TKMX in vitro và in vivo. Những sắc tố do TKMX tiết ra không có tính độc. Có 4 loại sắc tố: - Pyocyanin: có màu xanh da trời trong môi trường trung tính hoặc hơi kiềm, pyocyanin có thể tan trong nước và clorofor. Để phát hiện pyocyanin, người ta nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang thường, thạch thường, nhưng tốt nhất là trên môi trường King A. - Pyoverdin: là sắc tố huỳnh quang có màu vàng xanh, có thể tan trong clorofor. Trong môi trường nuôi cấy để lâu, sắc tố này bị oxy hoá thành pyorubin màu hồng nhạt. Dùng môi trường King B để phát hiện pyoverdin. - Pyorubin: màu hồng nhạt, được sinh ra thuận lợi trong môi trường có 1% glutamat. Rất ít chủng TKMX sinh sắc tố này. - Pyomelanin: màu nâu đen, có thể khuếch tán và tan được trong nước, không tan trong clorofor, ether, alcool. Để phát hiện pyomelanin, dùng môi trường King A. Khoảng 95% trường hợp các chủng TKMX sinh sắc tố pyocianin và pyoverdin. Tuy nhiên không phải chủng TKMX nào cũng có khả năng sinh sắc tố. Tỷ lệ % số chủng không sinh sắc tố có sự khác nhau theo từng công trình nghiên cứu. 5 Tính chất sinh vật hoá học: tất cả các chủng TKMX đều có phản ứng oxydase (+), catalase (+). Không lên men lactose và saccharose, sử dụng glucose bằng hình thức oxy hoá, không sinh indol và H2S, một số ít chủng TKMX urease (+). Hầu hết TKMX làm lỏng gelatin và thoái hoá nitrit thành nitrat, LDC (-), ODC (-), ADH (+), citrat simmon (+), ONPG (-), tuy nhiên có 98% số chủng TKMX type huyết thanh P11 có khả năng thuỷ phân ONPG, do có enzym β- galactosidase. Hình 1.1: Trực khuẩn mủ xanh. Nguồn: www.cellsalive.com 1.1.3. Khả năng gây bệnh TKMX là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nên trong những điều kiện nhất định chúng có thể xâm nhập vào cơ thể và gây bệnh. TKMX thường gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thương, vết mổ, vết bỏng. Từ vết thương, vết bỏng vi khuẩn có thể vào máu gây NKH. Khi bị NKH do loài vi khuẩn này tỷ lệ tử vong thường rất cao. TKMX gây nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới, viêm màng não, viêm màng trong tim, viêm tai giữa. Nhiễm khuẩn do TKMX còn hay gặp ở bệnh nhân mắc các bệnh ác tính, giảm bạch cầu, bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch hoặc dùng thuốc ức chế miễn dịch kéo dài. TKMX có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập, lan truyền và gây bệnh [2]. 6 1.1.4. Sức đề kháng và khả năng kháng kháng sinh TKMX có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá. Trong môi trường ẩm, không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu đặt ở 50C, chúng sống được hơn 6 tháng. TKMX kháng lại nhiều thuốc sát trùng ở nồng độ thường dùng để diệt vi khuẩn khác. Cetrimit là một hoá chất diệt khuẩn ở nồng độ 0,2gam/lít. Nhưng ở nồng độ này, TKMX kháng lại thuốc vì vậy người ta cho vào Cetrimid môi trường phân lập loại bỏ tạp nhiễm [2]. TKMX là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nhưng khi gây bệnh thường khó điều trị và gây tỉ lệ tử vong cao, một trong những lý do căn bản của việc khó điều trị các nhiễm trùng do TKMX là do tính đa kháng kháng sinh của chúng. TKMX là một trong số các loài vi khuẩn gây bệnh hay gặp có khả năng đề kháng kháng sinh cao nhất. TKMX kháng thuốc chủ yếu do nhận gen kháng thuốc thông qua con đường truyền plasmid. Bên cạnh sự kháng thuốc do plasmid, sự đề kháng do đột biến gen ở nhiễm sắc thể cũng có vai trò quan trọng [2], [26], [36], [64], [69]. 1.1.5. Phân loại trực khuẩn mủ xanh theo type huyết thanh Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do TKMX. Mặt khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch tễ học quá trình lây nhiễm TKMX. Phương pháp hay sử dụng nhất là type huyết thanh (serotype). Năm 1957, Habs và cộng sự đã xây dựng một hệ thống định type của TKMX với 12 nhóm huyết thanh. Hệ thống này gọi là IATS (International antigenic typing system). Hệ thống này được Uỷ ban phân loại quốc tế chấp nhận và đề nghị thành 16 nhóm kháng nguyên chịu nhiệt được ký hiệu từ O1 đến O16 (hoặc P1 đến P16) [2], [102]. 7 Có phản ứng ngưng kết chéo giữa các type P2 và P5; P7 và P8; P13 và P14, đồng thời có khoảng 5% số chủng tự ngưng kết. Khoảng 90 - 95% số chủng TKMX có thể xác định được type theo phương pháp này. Sự phân bố các type huyết thanh ở các nước có khác nhau và trong một nước, giữa các vùng cũng có sự khác nhau [20]. 1.2. NHIỄM KHUẨN VẾT BỎNG DO TRỰC KHUẨN MỦ XANH TKMX là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội và là loài vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) điển hình. TKMX có thể gây các loại nhiễm trùng trên da, nhiễm trùng đường tiêu hóa và nhiễm trùng ở người suy giảm miễn dịch hoặc sau chấn thương. Trong khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi đề cập chủ yếu đến vai trò của TKMX trong nhiễm khuẩn vết bỏng và NKH bỏng. 1.2.1. Tình hình nhiễm khuẩn vết bỏng do trực khuẩn mủ xanh Từ cuối thế kỷ 19, người ta đã biết đến một trong những nguyên nhân gây tử vong ở bệnh nhân bỏng là do nhiễm khuẩn. Trong những năm gần đây vai trò của TKMX trong nhiễm khuẩn bỏng càng trở nên quan trọng vì tỷ lệ nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn này không ngừng tăng từ 25 - 30% (1980) đến 40% (1995 - 1997) và sự phối hợp giữa TKMX và S.aureus chiếm tới 30 35%; giữa TKMX và E .coli chiếm 40%. Có thể nói nhiễm TKMX được mô tả ở khắp nơi trên thế giới [6], [8], [21], [23], [32], [35], [110]. Theo Donatif và cộng sự nghiên cứu từ 1976 đến 1988 cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn bỏng do TKMX là 25 – 45% [35]. Nhiều nghiên cứu đều cho thấy TKMX là căn nguyên hàng đầu trong nhiễm khuẩn bỏng. Khi tiến hành nghiên cứu các vi khuẩn chỉ điểm gây NKBV ở trung tâm Bỏng (Hàn Quốc), Song W. và cộng sự (2001) đã xác định TKMX chiếm tỷ lệ cao nhất: 45,7%, sau đó là S.aureus 19,2% và Acinetobacter baumannii chiếm 13,4%. Các tác giả cũng chỉ ra rằng các chủng TKMX phân lập từ bệnh nhân bỏng có tỷ lệ kháng kháng sinh cao hơn các chủng TKMX phân lập từ bệnh nhân khác [94]. Estahbanati và cộng sự (2002) nghiên cứu ở viện Bỏng Motahari -Teheran 8 (Iran) từ tháng 12/1998 – 4/1999 cho thấy TKMX chiếm tỷ lệ cao nhất (57%), sau đó là Acinetobacter (17%), E.coli (12%) và S. aureus (8%) [36]. Lari A.R. và cộng sự (2000), nghiên cứu tình trạng NKBV tại trung tâm bỏng Tohid – Teheran (Iran) cho thấy tỷ lệ TKMX phân lập từ mủ vết bỏng ở ngày thứ nhất là 35%; ngày thứ 3 là 73% và ngày thứ 7 là 87% [60]. Ở Việt Nam, theo Lê Thế Trung, tỷ lệ TKMX gây nhiễm khuẩn vết bỏng là 30% [23]. Tác giả Nguyễn Đình Bảng (1991) cho biết TKMX là căn nguyên thứ hai gây nhiễm khuẩn vết bỏng sau S. aureus [6]. Theo Lê Thế Trung, ở tuần thứ hai sau bỏng, tỷ lệ TKMX dương tính khi phân lập từ vết bỏng là 81,9%. Ở những bệnh nhân có hoại tử ướt tại vết bỏng, TKMX thường xuất hiện sớm (từ ngày thứ 4 - 6 sau bỏng). Kể từ tuần thứ 3 - 6 sau bỏng, TKMX thường lấn át các vi khuẩn khác. Với bỏng sâu dưới 10% diện tích cơ thể, TKMX tồn tại từ 5 – 10 ngày. Với vết bỏng sâu trên 10% diện tích cơ thể, TKMX tồn tại kéo dài từ 20 - 70 ngày [23]. Như vậy, phần lớn các tác giả trong và ngoài nước đều cho rằng TKMX là căn nguyên thứ nhất hoặc thứ hai gây nhiễm khuẩn vết bỏng. 1.2.2. Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trực khuẩn mủ xanh ở bệnh nhân bỏng Bệnh nhân bỏng thường phải nằm viện lâu ngày với sức đề kháng giảm, chịu tác động của nhiều yếu tố (thay băng, tiêm truyền, hoặc chịu các biện pháp can thiệp khác như đặt sonde, catheter, thở máy… ) làm tăng khả năng nhiễm trùng chéo. Với những vết bỏng có pH kiềm, đặc biệt hay gặp ở hoá chất kiềm mạnh, bỏng vôi tôi nóng. TKMX thường đứng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn. Bỏng vôi tôi nóng hay gặp ở một số nước có phong tục dùng vôi tôi để xây nhà. Bỏng vôi tôi nóng là loại bỏng hoá chất đặc biệt vừa do sức nóng ướt (1500C) vừa do bỏng kiềm (pH vôi tôi:13,1); các vết bỏng nông, sâu thường xen kẽ; thường có hoại tử ướt, quá trình viêm mủ ở các hoại tử