Tài liệu Nghiên cứu chè

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 Nguồn gốc cây chè Các công trình nghiên cứu và khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốc của cây chè là vùng cao nguyên Vân nam Trung quốc, nơi có điều kiện khí hậu ẩm ướt quanh năm. Theo các tài liệu của Trung quốc thì cách đây 4.000 năm người Trung quốc đã biết dùng chè làm dược liệu, sau đó mới dùng chè để uống. Năm 1823, R.Bruce phát hiện những cây chè dại lá to ở vùng Atxam (Ấn Độ) từ đó các học giả người Anh cho rằng quê hương của cây chè là ở Ấn Độ chứ không phải ở Trung quốc. Những công trình nghiên cứu của Dejmukhatze (1961-1976) về phức catechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại chè được trồng và mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về sự tiến hoá, trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc cây chè. Dejmukhatze kết luận rằng những cây chè cổ xưa mọc hoang dại tổng hợp chủ yếu là (-)epi catechin và (+)epi catechin galat, ở chúng phát triển chậm khả năng tổng hợp (-)epigalo catechin và galat của nó để tạo thành (+) galo catechin. Khi nghiên cứu các cây chè dại ở Việt nam, ông cũng nhận thấy, chúng tổng hợp chủ yếu là (-)epi catechin và (+)epi catechin galat (chiếm 70% tổng số các loại catechin). Khi những cây chè dại được di thực lên phía Bắc, chúng thích ứng dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có các thành phần catechin phức tạp hơn. Từ sự biến đổi sinh hoá của các lá cây chè mọc hoang dại và các cây chè được trồng trọt, chăm sóc, Dejmukhatze cho rằng, nguồn gốc của cây chè chính là ở Việt Nam.[3] Hiện nay chè được phân bố khá rộng trong những điều kiện tự nhiên rất khác nhau, từ 30 độ vĩ nam đến 45 độ vĩ bắc, là những nơi có điều kiện tự nhiên khí hậu khác xa vùng nguyên sản. Những thành tựu khoa học của các nhà chọn giống Liên Xô (cũ), Trung quốc, Nhật Bản, Đài Loan...đã tạo ra rất nhiều giống chè mới có khả năng thích ứng với các điều kiện khí hậu khác nhau, tạo nhiều triển vọng cho nghề trồng chè trên thế giới. 1.2 Giới thiệu về hợp chất tannin 1.2.1 Định nghĩa tannin Tannin là những hợp chất tự nhiên thuộc nhóm polyphenol phổ biến trong thực vật. Chúng có vị chát, có tính thuộc da. Có nghĩa là có khả năng liên kết với protein của da tạo thành cấu trúc bền vững với quá trình thối rữa. Phân tử lượng tannin khoảng 500 - 5.000. Thuật ngữ " Tannin" sử dụng trong công nghiệp sinh học và thực phẩm để chỉ tất cả những polyphenol tự nhiên có vị chát, song không phải các chất này có khả năng thuộc da thật sự. Tính chất này chỉ có với các hợp chất cao phân tử có phân tử lượng lớn từ 1.000 - 5.000. Các phân tử có phân tử lượng thấp hơn chỉ có vị chát không có tính thuộc da, để phân biệt người ta gọi là "tannin thực phẩm", "tannin chè". 1.2.2 Cấu trúc hoá học và phân loại 1.2.2.1 Cấu trúc hoá học Cấu trúc của tannin phức tạp được chia làm 2 loại: - Tannin thuỷ phân được (tannin pyrogallic). - Tannin không thuỷ phân được (tannin pyrocatechic). Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của tannin 1.2.2.2 Phân loại a, Tannin thuỷ phân được (Tannin pyrogalic = galotannin). Khi thuỷ phân bằng axit hoặc bằng enzim tannase giải phóng ra phần đường thường là glucose, có khi là những loại đường đặc biệt (hamamelose ). Phần không đường là các axit. Axit hay gặp là axit gallic. Các axit gallic có thể nối với nhau để tạo thành axit digallic, trigallic. Ngoài axit gallic còn gặp các axit khác như axit ellagic, axit luteolic... Phần đường và phần không đường nối với nhau bằng cầu nối este (không phải cầu nối axetal) nên người ta coi tannin loại này là những pseudoglycosid. Axit gallic Axit digallic Hình 1.2 : Cấu trúc của axit gallic và axit digallic b, Tannin không thuỷ phân được (Tannin ngưng tụ, tannin pyrocatechic). Dưới tác dụng của axit hoặc emzim dễ tạo thành chất đỏ tannin gọi là phlobaphen không tan (Sản phẩm của sự trùng hợp hoá và oxy hoá) hay là phlobatannin. Trong cấu trúc của các tannin loại này còn có các đơn vị catechin hoặc epicatenchin hoặc gallocatenchin. Sự ngưng tụ thường xảy ra ở dây nối carbon – carbon, ví dụ giữa C8 của catechin và C4 của epicatechin tạo thành dimer. Catechin Epicatechin Hình 1.3: Cấu trúc của Catechin và Epicatechin 1.2.3 Tính chất của tannin 1.2.3.1 Tính chất vật lí - Tannin hầu như không tan trong các dung môi kém phân cực, tan được trong cồn loãng, glycerin, aceton, tốt nhất là nước nóng. - Tannin có dạng bột vô định hình, màu vàng nhạt hay vàng nâu nhạt, mùi đặc biệt, vị chát xít. - Khi thuỷ phân tannin pyrogallic trong môi trường axit thu được axit gallic. 1.2.3.2. Tính chất hoá học - Có tính axit. - Gây tủa một số muối kim loại (sắt III clorid, chì acetat…), alcaloid, albumin, gellatin. - Tạo nhiều dây nối hydro với mạch polypeotid của protein Có thể dựa vào kết tủa với muối sắt để xác định tannin trên vi phẫu. 1.3 Giới thiệu về enzim tannase [27] 1.3.1 Lịch sử phát triển Scheele tìm thấy sự xuất hiện của axit gallic trong dịch chiết từ mụn cây vào năm 1786 (Knudson, 1913)[19]. Robiquet phỏng đoán rằng có một loại vi sinh vật đã lên men và tiếp sau đó nó đã tiết axit gallic bên trong các mụn cây đó. Loraque cho rằng sự hình thành axit gallic từ axit tannic là sản phẩm của một loại vi sinh vật hoặc do quá trình oxi hoá. Để hỗ trợ cho giả thuyết này ông đã tìm ra thêm một số cơ chất có độc tính gây ức chế quá trình hình thành axit gallic từ axit tannic trong các mụn cây đó. Vanteighem là người đầu tiên chứng minh rằng sự hình thành của axit gallic là do hoạt động của một loại nấm mốc. Ông tuyên bố rằng loài vi sinh vật này là nấm mốc Penicillium glaucum và loài nấm mới được ông đặt tên là Aspergillus niger. Ông bắt đầu nuôi bề mặt và dịch thể để đánh giá khả năng phân giải của axit tannic. Frenchbach đã nuôi Aspergillus niger trên môi trường Raulin dịch thể với nguồn đường được thay thế bằng axit tannic và đã tách chiết được enzim tannase từ loại nấm này vào năm 1901 (Knudson,1913)[19]. Các nghiên cứu mở rộng đầu tiên về đặc tính, nguồn gốc, ứng dụng, phạm vi sử dụng, cơ chế phản ứng và độ đặc hiệu của tannase đã được tiến hành bởi nhóm tác giả Fernbanch, Pottevin, Dykerhoff, Ambruter, Thom và Raper vào đầu của thế kỷ XX. Những nghiên cứu này hơn nữa còn cho thầy rằng tannase là một enzim có thể biến đổi và có thể được tổng hợp trong quá trình lên men trạng thái rắn do nấm sợi Aspergillus và Penicillium. Ứng dụng của tannase để sản xuất axit gallic từ các nguyên liệu chứa tannin đã sớm được phát hiện. Năm 1960, tannase được tách và tinh chế từ thực vật và nấm bởi Madhavakrishna - Bose và Dhar – bose. Một công ty của Nhật Bản đã tiến hành thanh lọc và nghiên cứu đặc tính của Aspergillus sinh tannase. Họ cũng đã phát triển một thử nghiệm quang phổ để xác định của hoạt động tannase, trước đây dựa trên phương pháp chuẩn độ. Trong đầu những năm bảy mươi, một số bằng sáng chế đã được công bố cho các ứng dụng tiềm năng của tannase trong ngành công nghiệp thực phẩm và nước giải khát (Van de Lagemaat và Pyle, 2006)[36]. Nhiều nghiên cứu về các nguồn, khảo nghiệm, ứng dụng, sự cố định, phương pháp lọc, và đặc tính của tannase diễn ra trong những năm 1980. Các nghiên cứu chỉ ra rằng ngoài hình thành từ nấm sợi, tannase cũng được tìm thấy trên động vật (Lekha và Lonsane, 1997)[23] và vi khuẩn (Deschamps et al, 1983)[12]. Sau đó phương pháp săc kí đã được phát triển để xác định / phát hiện hoạt tính của tannase (Jean et al, 1981)[17]. Việc sản xuất tannase từ nguồn vi khuẩn được tập trung phát triển từ năm 1990 trở đi. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng lợi thế của quá trình lên men trạng thái rắn để sản xuất tannase từ nguồn nấm mốc. Hatamoto et al. (1996)[16] là người đầu tiên tái bản trình tự và khuếch đại bộ gen có hoạt tính sinh tannase để kích thích hoạt tính chuyển hoá sinh tannase trong Aspergillus oryzae. Osawa và Walsh (1993)[26] đã phát triển một phương pháp khảo nghiệm nhanh chóng và đơn giản để sàng lọc nấm sinh tannase ngoại bào phục vụ cho sản xuất. 1.3.2 Cấu trúc Hình 1.4 : Quá trình thủy phân axit tannic của enzim tannase 1.3.3 Vi sinh vật sinh tannase Trên 140 năm nghiên cứu đã phát hiện ra nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tannase, nổi bật là vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Một số loài động vật cũng có khả năng sinh tannase. Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự trao đổi vi sinh vật trong cơ thể động vật là nguyên nhân sinh tannase chứ không phải là do loài động vật đó. Nấm sợi: Các loài nấm sợi thuộc các chi Aspergillus và Penicillium được sử dụng rộng rãi cho việc sản xuất tannase. Đa số các công trình nghiên cứu đã sử dụng những nhóm này như: Aspergillus awamori Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Penicillium notatum, Penicillium islandicum, Penicillium digitatum, Penicillium citrinum Penicillium glabrum và Penicillium restrictum… Nấm men : Có vài báo cáo về sản xuất tannase từ nấm men như: Candida ssp., Pichia ssp., Debaryomyces hansenii… Vi khuẩn : Các báo cáo về khả năng sinh tannase từ vi khuẩn được thực hiện từ trước những năm 1980. Trong 25 năm gần đây, khoảng một chục các báo cáo đã được công bố về tannase vi khuẩn và khoảng 25 vi khuẩn sinh tannase mạnh đã được phân lập. Deschamps et al, (1983)[12] phân lập một số các chủng vi khuẩn sinh tannase có thể sử dụng axit tannic như nguồn carbon duy nhất. Họ đã có thể sản xuất tannase từ bốn chủng sử dụng tannin từ hạt dẻ và quan sát thấy rằng axit gallic là sản phẩm phân hủy duy nhất. Từ thể kỉ 19 trở đi, đã có sự tập trung mạnh vào việc sản xuất tannase bởi các loại vi khuẩn. Một số chủng đang được sử dụng như: Bacillus plumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Pseudomonas solanaceaum, Lactobacillus ssp., Enterococcus faecalis… Một vài loài vi khuẩn trong đường tiêu hoá của động vật hoang dã đã được tuyển chọn và thuần hoá để sản xuất tannase. Những vi khuẩn này được tách từ phân của gấu túi, dê, bò và con người. Thực vật: Nguồn tannase đã được báo cáo có mặt trong nhiều loài thực vật chứa tannin phong phú, chẳng hạn như Terminalia chebula (myrobolan) trái cây, Caesalpinia (div - Divi) quả, lá Angeissus latifolia (dhawa) và vỏ cây Cassia fistula (Konnam) và Acacia arabica (Babul). Tannase thực vật được tìm thấy là kém ổn định hơn so với các nguồn vi khuẩn và tách chiết khó khăn hơn (Lekha và Losane, 1997)[23]. 1.3.4 Điều kiện nuôi cấy Các loại nấm có nhiều sợi như Aspergillus và Penicillium được sử dụng phần lớn để sản xuất tannase. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng nấm sợi. Các báo cáo về nguồn thu tannase từ vi khuẩn và nấm men có rất ít. 1.3.4.1 Phương pháp nuôi cấy Vi sinh vật sinh tannase được nuôi trên bề mặt dịch thể (SmF) và bề mặt lên men rắn (SSF) để nấm sợi phát triển. Vi khuẩn và nấm men được nuôi cấy riêng trong môi trường SmF. Trong sự giới hạn vị trí và đặc tính của enzim, năng suất thu được có lẽ không khả quan được như các phương pháp khác. Những nghiên cứu so sánh của Lekha và Losane (1994)[22] và Aguilar et al., (2001b)[6] chỉ ra rằng hiệu suất sinh Aspergillus sp., của môi trường SSF cao hơn SmF. Lekha và Losane (1994)[22] cũng chỉ ra rằng lượng enzim thu được từ vi sinh vật nuôi trong môi trường SSF cao hơn hẳn so với môi trường SmF. Các enzim thu được từ môi trường SSF cho nhiệt độ và pH ổn định hơn. 1.3.4.2 Cơ chất và môi trường nuôi cấy Tất cả các kĩ thuật nhân tạo hoặc bán nhân tạo đều được sử dụng để sản xuất chế phẩm tannase. Bradoo et al., (1997)[11] báo cáo về việc sử dụng môi trường Czapeck với một lượng rất nhỏ tannic axit lắc trong bình tam giác để nuôi Aspergillus japonicus. Các nồng độ axit tannic khác nhau ( 0,5 – 10%) trong từng môi trường là nguồn cacbon duy nhất. 2% (w/v) axit tannic cho hiệu suất thu enzim cao nhất. Họ cũng có thể bổ sung thêm vào môi trường một lượng nhỏ đường (0,2% w/v) trong các loại đường như: arabinose, fructose, galactose, xylose, lactose, sucrose, carboxy methyl celluose, bột mì vào môi trường nuôi cấy thu enzim. Nhưng họ cũng lưu ý không dùng đường glucose quá nhiều vì sẽ làm giảm hiệu suất thu enzyme. Nồng độ glucose tối thích là 1%. Seth và Chand (2000)[33] đã sử sụng môi trường nuôi cấy có chứa muối vô cơ và axit tannic để nuôi Aspergillus awamori và kết quả đạt được rất khả quan. Nồng độ axit tannic dao động từ 2,5 – 4,5 % (w/v) , và 3,5 % là nồng độ tối ưu. Saxena (2004)[32] đã sử dụng bột chebulic myrobalan ( 32%) thay cho axit tannic trong thí nghiệm của họ để nuôi các chủng Penicillium. Họ cũng lạc quan cho rằng chế phẩm tannase sử dụng loại tannin trong tự nhiên này phù hợp với việc nuôi cấy lắc trong bình tam giác. 4- 12% ( w/v) lượng bột này dược sử dụng để bổ sung vào môi trường và 11,6% (w/v) là nồng độ thích hợp nhất. Lekha và Losane (1994)[22] đã sử dụng đường từ bã mía trong môi trường lên men rắn để nuôi Aspergillus niger PKL104. Đường trong bã mía được cung cấp vào môi trường dinh dưỡng có chứa 6% (w/v) axit tannic. Aguilare et al., (2001b)[6], đã báo cáo về việc sử dụng bọt Polyurethane cấp vào môi trường lên men rắn của Aspergillus niger. Môi trường trao đổi chất được sử dụng này có chứa nồng độ axit tannic lên đến 20% (w/v) . Nồng độ tối ưu của axit tannic trong môi trường này là 10% (w/v). Hơn nữa, họ còn sử dụng đường glucose với nồng độ 0,65 – 20% (w/v) để cung cấp cho môi trường dinh dưỡng có chứa 2,5% (w/v) axit tannic. Họ cho rằng các chất dị hoá được tích tụ mạnh mẽ hơn trong quá trình tổng hợp tannase là nhờ đường glucose được cung cấp vào môi trường. Ramirez-Coronel et al., (2003)[28] đã báo cáo về việc sử dụng bọt Polyurethane để cung cấp vào môi trường nuôi Aspergillus niger. Họ đã sử dụng môi trường dinh dưỡng có chứa muối khoáng và 0.1% (w/v) axit tannic . Sabu et al., (2005)[29] sử dụng lõi cây cọ và bột nghiền từ hạt me làm cơ chất bổ sung vào môi trường lên men rắn để thúc đẩy quá trình tạo tannase của Aspergillus niger ATCC 16620. Môi trường này được cung cấp thêm NH4NO3, MgSO4, và NaCl. Kĩ thuật bổ sung thêm bột nghiền lõi cây cọ được thêm các cơ chất khác như 1.0% (w/v) glucose, bột mì, sucrose, maltose, glycerol, axit tannic, methyl galate và axit gallic. Battestin và Macedo (2007)[9] đã sử dụng vỏ café và cám gạo thêm vào môi trường lên men rắn để nuôi Paecilomyces variotii. Môi trường này được cung cấp thêm muối vô cơ. Nhiệt độ, tỉ lệ % cám gạo: vỏ cafê, hàm lượng axit tannic và muối được nghiên cứu với những mức dộ khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho phương pháp này. Nồng độ axit tannic được lựa chọn là 3 – 15% (w/v). Kết quả khả quan nhất là ở nồng độ axit tannic 155 (w/v),còn lại tỉ lệ của vỏ café : cám gạo là 50:50. Banerjee et al., (2007)[8] đã sử dụng tannin thô từ một loại quế của Thái Lan vào 5l môi trường lên men. Họ đã có báo cáo thu được loại enzim tốt từ môi trường nuôi cấy có chứa 2.0 % ( w/v) tannin. Nguồn nitơ thường được thêm vào trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tannase là Natri nitrat, ammonium chloride, ammonium di-hydrogen phosphate, ammonium oxalate, ammonium sulphate, monosodium glutamate và axit glutamic (Yamada et al., 1968 ; Lekha và Losane. 1997). Banerjee et al., (2007)[8] đã có báo cáo về việc sử dụng ammonium phosphate như nguồn nito duy nhất để sản xuất tannase. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng thêm một số lượng nhỏ các chất như : Na2HPO4, KCl, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, FeSO4, AlCl3 ( Van de Lagemaat và Pyle, 2006)[36]. Deschamps et al. (1983)[12] sử dụng môi trường khoáng chất với 1% (w/v) chiết xuất hạt dẻ là nguồn cacbon chính để sản xuất tannase từ Bacillus polymyxa, Corynebacterium sp. và Klebisella pneumoniae trong phòng thí nghiệm. Kumar et al. (1999)[21] sử dụng môi trường khoáng chứa axit tannic với nồng độ khá cao khoảng 5% (w/v) để sản xuất tannase từ Citrobacterium freundii. Mondal và Patri (2000) đã sử dụng môi trường dinh dưỡng có nguồn nito là ammonium nitrate và nguồn cacbon là axit tannic(1% w/v) lắc trong bình tam giác để nuôi Bacillus licheniformis KBR 6. Mondal et al. (2001)[24] đã sử dụng môi trường dinh dưỡng có axit tannic(1% w/v) và Amonium chloride lắc trong bình tam giác để nuôi Bacillus cereus KBR9. Ayed và Hamdi (2002)[7] đã sử dụng môi trường trao đổi chất dạng nhũ tương lắc trong bình tam giác để nuôi Lactobacillus platarum. Họ đã sử dụng axit tannic với nguồn nito là ammonium sulfate và casamino axit. Họ sử dụng khoảng 0.1 – 2% axit tannic(w/v) và hoạt tính cao nhất trong môi trường chứa 1,5%(w/v) tannic axit. Họ cũng bổ sung thêm đường glucose và thầy rằng hiệu suất thu enzim rất khả quan. Das Mohapatra et al. (2006) sử dụng 9 loại cây khác nhau chiết xuất ra nguồn tannin nuôi Bacillus lichiniformis KBR6 để sản xuất tannase. Nguồn chiết xuất này không cần bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng nào khác và được nuôi lắc trong bình tam giác. Họ nhận được hoạt lực cao nhất từ nguồn enzim thô của Anacardium occidentale. Sabu et al. (2006)[30] đã nuôi chủng Lactobacillus sp ., ASR – S1 từ bột xay hạt me, cám mỳ, lõi cây cọ và vỏ cafê. Họ đã sử dụng nguồn nitơ là ammonium nitrat cùng với muối khoáng để làm tăng độ ẩm cho môi trường rắn. Hiệu suất tốt với môi trường vỏ café. Belur et al. (2010)[10] đã có nghiên cứu cho rằng môi trường nhũ tương với nguồn nito hữu cơ cho hiệu suất cao hơn nguồn nito vô cơ khi họ tiến hành tách chủng Serratia ficaria DTC. Selwal et al. (2010) đã có nghiên cứu cho thấy chủng Pseudomonas aeruginosa III B 8914 có hiệu suất sinh tannase cao hơn các chủng Phylanthus emblica (amla), Acacia nilotica (keekar), Eugenia cuspidate ( Jomoa) và Syzygium cumini khi nuôi cấy lắc trong bình tam giác. Khi nguồn cacbon được dùng với nồng độ 2% (w/v) , nguồn nito là Ammonium nitrate và muối vô cơ và hiệu suất của chủng Phylanthus emblica (amla) là cao nhất. Đã có những nghiên cứu về hiệu quả của các nguồn cacbon khác được thêm vào môi trường ( 0,2 % w/v) như : Dextrose, manitol, glucose, xylose, starch, lactose, glyxerol, maltose, galactose, sucrose và lượng enzim thu được sẽ ít hơn nếu không cung cấp các nguồn cacbon này vào môi trường. Ngoài ra họ cũng thử sử dụng một số nguồn nitơ khác để bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy như natri nitrate, ammonium chloride, urea, ammonium nitrate và ammonium sulphate. Và kết quả cho thấy chất lượng enzim thu được tốt hơn khi môi trường được cung cấp ammonium nitrate. Nguồn cacbon phụ được thêm vào với nồng độ thấp (0,06 – 7%) như glucose, fructose, sucrose. Cách này để thúc đẩy sự sinh trưởng của vi sinh vật vì nếu chỉ có axit tannic thì vi sinh vật sẽ khó hấp thu chất dinh dưỡng hơn. Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng nồng độ tối ưu của axit tannic để vi sinh vật sinh tổng hợp ra enzim phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật và từng điều kiện nuôi cấy khác nhau. 1.3.4.3 Nhiệt độ lên men Nhiệt độ nuôi thường từ 25 – 40oC với hầu hết các kĩ thuật nuôi cấy và khoảng 30oC với nấm sợi (Yamada et al ., 1968 ; Rajkumar và Nandy, 1983 ; Lekha và Losane, 1994). Kumar et al., (1999) cho rằng nhiệt độ tối đa để sinh tổng hợp tannase là 30 oC với Citrobacter freundii trong khi Das Mohapatra et al., (2006) cho rằng nhiệt đọ tối đa để sinh tổng hợp tannase của Bacillus lichiniforms KBR6 là 35 oC. Mondal et al ., (2001) đã nghiên cứu thấy nhiệt độ tối ưu của Bacillus cereus KBR9 là 40oC trong khi Lactobacillus sp. ASR-S1 sinh tổng hợp tannase tốt nhất ở 30oC (Sabu et al ., 2006). Selwel et al., (2010) nghiên cứu thấy nhiệt độ tối ưu để sinh tổng hợp tannase của Pseudomonas aeruginosa III B 8914 là 37 oC. 1.3.4.4 pH môi trường pH tối ưu của môi trường thường từ 4,5 – 7,0 với SmF và 5,0 – 6,5 với SSF với hầu hết các loài nấm sợi (Van de Lagemaat và Pyle, 2006). Đối với vi khuẩn , Sewal et al., (2010) nghiên cứu thấy pH tối ưu là 5,5 với Pseudomonas aeruginosa III B 8914; Mondal et al ., (2001) tìm thấy pH tối ưu của Bacillus cereus KBR9 là 5,0. pH tối ưu của Bacillus lichiniforms KBR6 là 5,0 (Mondal và Patri, 2000) ; Lactobacillus platarum là 6,0 (Ayed và Hamdi, 2002 ) ; Pseudomonas aeroginosa là 7,0 (Sewal et al., 2010) ; Serratia ficaria DTC là 6,0. 1.3.4.5 Thời gian lên men Đối với các loại nấm sợi, hiệu suất sinh tannase lớn nhất từ 12- 24h trong SmF (Bradoo et al ., 1997 ; Aissam et al., 2005 ; Aguilar et al ., 2007) và 72 – 86 h trong SSF (Lekha và Losane, 1994 ; Kar và Banerjee, 2000 ; Saxena và Saxene, 2004 ; Sabu et al ., 2005). Banerjee et al., (2007) nghiên cứu thấy khả năng sinh tổng hợp tannase trong 36h với 5l môi trường lên men của Aspergillus aculeatus DBF9 là rất cao. Đối với vi khuẩn, hiệu suất lên men cao nhất là trong 24h. Hiệu suất sinh tannase lớn nhất trong pha phát triển là 24h của Pseudomonas aeruginosa III B 8914 (Sewal et al., 2010) ; Lactobacillus plantarum (Ayed và Hamdi, 2002) ; Bacillus cereus KBR9 (Mondal et al., 2001). Hầu hết các thử nghiệm đều cho thầy khả năng sinh tổng hợp tannase lớn nhất là trong 21h đối với Bacillus lichiniforms KBR6 (Mondal et al., 2000 ; Mondal và Pati, 2000); 6h đối với Citrobacter freundii (Kumar et al., 2000)…. Tất cả các kết quả thu được đều chỉ ra rằng những điều kiện tối ưu là khác nhau đối với từng loại vi sinh vật và điều kiện lên men. 1.3.5 Ứng dụng của tannase Hoạt tính của tannase được phân loại theo khả năng thuỷ phân các mối liên kết este. Khả năng thuỷ phân axit tannic của tannase là sự giải phóng ra glucose, axit gallic và các este khác của glucose. Tannin có độc tính và là hợp chất kìm hãm sự trao đổi các protein phức tạp trong vi sinh vật. Tannin bảo vệ các phần dễ bị tổn thương của cây khỏi sự tấn công từ vi sinh vật bằng cách tiết enzim làm dày màng tế bào. Có rất nhiều loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn có khả năng kháng tannin được phát triển để sản xuất tannase. Các phương pháp để ức chế bao gồm làm biến đổi tannin,làm giảm hoạt tính, tách tannin – cơ chất, ức chế hoạt động của tannin bằng cách biến đổi cấu trúc, sửa chữa và cô lập ion. Sự biến đổi của tannin là nhờ tannase. Nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tannase. Tanase thuỷ phân tannin để ngưng tụ sản phẩm, một trong số chúng được sử dụng như một nguồn năng lượng. Axit gallic là một trong những sản phẩm chính của quá trình biến đổi axit tannic. Axit gallic được coi như một cơ chất có tác dụng chống oxi hoá để tạo aliphatic axit, tham gia vào quá trình tạo citric axit. Ứng dụng chính của enzim này là sản xuất axit gallic. Axit gallic được sử dụng để sản xuất thuốc chống sốt rét Trimethoprim. Axit gallic là cơ chất cho quá trình hoá học và trao đổi enzim của propyl gallate. Sử dụng như một chất chống oxi hoá cho dầu và mỡ cũng như trong công nghiệp đồ uống. Tannase cũng được sử dụng để lọc cặn trong rượu, nước quả và nước giải khát có hương vị cafê. Trong sản xuất rượu, tannin gây oxi hoá thành quinon khi kết hợp với không khí dẫn đến vẩn đục làm giảm giá trị sản phẩm. Sử dụng tannase là giải pháp cho vấn đề này. Trong sản xuất bia, tannin có trong thành phần của hoa houblon. Hàm lượng protein trong bia càng cao thì càng dễ có nhiều vẩn đục. Đây là vấn đề khó khăn khi protein trong bia tiếp xúc với tannin trong hoa houblon. Vấn đề này cùng đã được giải quyết khi sử dụng tannase. Tannase cũng được sử dụng để sản xuất trà nhúng có thể hoà tan trong nước lạnh. Hơn nữa tannase của trà xanh có nhiều chất chống oxi hoá hơn hơn các loại trà đen và trà thông thường. Tannase phân giải trà xanh có tác dụng ức chế Nnitrosamine, một loại tác nhân gây ung thư, quái thai được tìm thấy trong một số chất bảo quản thịt. Một và nghiên cứ đã chỉ ra được hoạt độ và tính ổn định của tannase phân giải trà xanh. Ứng dụng của tannase trong thực phẩm và công nghệ đồ uống đã góp phần giải quyết các vần đề khó khăn do tannin gây ra. Sự hoạt động của enzim này trong nước quả làm giảm bớt vẩn đục, hư hỏng, tăng giá trị sản phẩm. Các loại nước qủa mới hiện nay được đón nhận hơn bởi lợi ích cho sức khoẻ từ chúng với thành phần chống oxi hoá. Hàm lượng tannin cao trong hoa quả gây ra đục và hư hỏng,làm giảm màu sắc, hương vị trong quá trình tích trữ trái cây. Để tránh những hư hại này thí quá trình enzim hoá được ưu tiên. Những kết quả nghiên cứu của Rout và Banerjee (2006) từ quả lựu đã chứng minh rằng tannase có khả năng phân giải 25% tannin, trong khi đó sự kết hợp giữa tannase và gellatin (1:1) thì 49% tannase được phân giải. Các cấu tử tannin ở dạng khó hoà tan khi kết hợp với protein. Sự trao đổi qua lại này có vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến. Tannin trong các nguyên liệu có nguồn gốc cây cỏ khó tiêu hoá và protein nội bào phải tiết ra enzim để chuyển hoá. Tannin có có các ion khá phức tạp làm ảnh hưởng đến khả năng tiêu hoá. Sử dụng tanase trong thành phần thức ăn của động vật ăn cỏ giúp cải thiện sự tiêu hoá. Enzym này được sủ dụng trong công nghiệp thuộc da và bán xử lí tannin trong cỏ. Tuy nhiên về mặt thương mại enzim này có giá thành tương đối cao. Tanase được cung cấp bởi một số nhà sản xuất như Biocon ( Ấn Độ), Kikkoman (Nhật bản), ASA Specilaenzyme GmbH (Đức). 1.4 Tình hình sử dụng phế thải chè làm phân bón hữu cơ Sau hơn thời gian trở thành thành viên của tổ chức WTO, cũng như các ngành kinh tế khác, ngành chè nước ta có thêm nhiều cơ hội và thách thức. Và thách thức lớn nhất là chất lượng sản phẩm. Chất lượng là cánh cửa để chè Việt Nam bước ra thị trường thế giới. Để chè thành phẩm có chất lượng tốt thì 30% phụ thuộc vào chế biến còn 70% là do cung cấp nguyên liệu. Vì vậy vấn đề lựa chọn nguyên liệu và hướng dẫn bà con nông dân trong vùng chè kỹ thuật chăm sóc và hái chè để có chất lượng cao là hết sức quan trọng. Từ đó chúng ta mới có thể xây dựng vùng chè sạch. Đặc biệt là quy trình đốn chè, sau mỗi vụ thu hoạch, việc tiến hành đốn rất quan trọng bởi nó ảnh hưởng trực tiếp tới sản lượng ra búp của lứa sau đồng thời tiến hành đốn giúp cho cây chè có tán đồng đều, tạo thuận lợi tới việc thu hái chè bằng máy đạt năng xuất tối đa. Qua đó giúp cho người trồng chè thu hoạch chè với năng suất cao, chất lượng chè đồng đều. Có rất nhiều hình thức đốn chè khác nhau : Đốn tạo hình, đốn phớt, đốn lửng, đốn đau, đốn trẻ lại. Đốn đau trước, đốn phớt sau. Đốn tạo hình chè con trước, đốn chè trưởng thành sau. Trên cơ sở như vậy chúng ta thấy sản lượng chè đốn hàng năm của các vùng trồng chè là rất lớn. Qua tìm hiểu thì hiện nay hầu hết bà con nông dân đều bỏ qua nguồn nguyên liệu này. Họ chỉ biết cách xử lý là đối với các cành chè già thì cho làm củi hoặc dấp xuống gốc cây làm phân bón. Nhưng như vậy khả năng tạo nguồn sâu bệnh sẽ lớn, thời gian phân hủy sẽ rất lâu ít nhất để phân hủy được hoàn toàn cũng phải mất 6 tháng cho đến một năm. Nhằm tăng tốc độ phân hủy các loại phụ phẩm chè dưới gốc cây, việc ứng dụng các chế phẩm vi sinh cũng là một trong những phương cách hữu hiệu nhằm rút ngắn thời gian phân hủy. Việt Nam, nhiều đề tài nghiên cứu ủ phân hữu cơ vi sinh được nghiên cứu và triển khai tại các vùng sản xuất nông nghiệp hoặc các khu xử lý rác thải của thành phố. Các đề tài có thể áp dụng các chế phẩm EM (chứa các vi sinh vật ngoại lai) s n có trên thị trường hoặc các chế phẩm sản xuất trong nước chứa các vi sinh vật được tìm thấy trong các hệ sinh thái ở Việt Nam. Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu này tập trung vào phương pháp ủ đống với nhiệt lượng sinh ra trong các đống ủ cao nên công tác tuyển chọn bộ giống vi sinh vật bổ sung vào đống ủ đa số là các vi sinh vật ưa nhiệt. Tuy nhiên, phương pháp chúng tôi đề xuất trong nghiên cứu này là phương pháp ủ tại gốc chè đốn. Vì vậy, quá trình phân hủy sẽ không sinh ra nhiệt lượng lớn do đống ủ nhỏ và thấp, nhiệt lượng dễ phát tán ra bên ngoài. Vì vậy cần phải tuyển chọn bộ vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phân hủy tốt các loại phế thải chè tại nhiệt độ thấp như nghiệt độ của môi trường xung quanh (30 oC). Hơn nữa, tùy vào các điều kiện sinh thái khác nhau mà vi sinh vật có khả năng sinh trưởng trên nguồn cơ chất khác nhau. Chính vì thế, nguồn cơ chất trong các phần phụ phẩm của chè có thể phù hợp cho sự phát triển của một nhóm vi sinh vật nào đó. Vì vậy, phân lập và tuyển chọn vi sinh vật bản địa có khả năng sinh trưởng tốt trên phụ phẩm chè và có khả năng sinh các enzim ngoại bào mạnh như tannase, cellulose, xylanase, amylase, protease...vv là việc làm có ý nghĩa khoa học cao. Chọn lọc các vi sinh vật đó để tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào phụ phẩm chè thu gom dưới gốc cây không chỉ góp phần rút ngắn thời gian hoàn trả chất dinh dưỡng lại cho đất mà còn là một trong những phương cách tăng cường và làm giàu hệ vi sinh vật hữu ích của bản địa, là nhân tố góp phần vào quá trình phát triển bền vững ngành trồng chè. CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn vi sinh vật và thiết bị 2.1.1 Nguồn vi sinh vật Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu được phân lập từ các mẫu đất trồng chè ở Hoà Bình, Phú Thọ và các chủng đang được lưu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật – ĐHQGHN (VTCC). 2.1.2 Thiết bị, hoá chất và môi trường Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng thiết bị và hoá chất có tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội a, Thiết bị và dụng cụ - Cân điện tử AL - 300 (Osi, Mỹ) - Nồi hấp khử trùng Hiclave HV - 85 (Hirayama, Nhật) - Tủ cấy (Nuaire, Mỹ) - Kính hiển vi quang học Axio (Zeiss, Đức) - Máy li tâm 5417R (Eppendorf, Đức) - Máy đo quang phổ (Beckman, Mỹ) - Một số thiết bị khác Ngoài ra, còn sử dụng các dụng cụ thí nghiệm như bình tam giác (250 ml), ống falcon (15 ml), ống giữ lạnh sâu và đĩa Petri... b, Hoá chất - Các hóa chất nuôi cấy vi sinh vật: Sucrose, NaNO3, K2HPO4 , MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, KCl, agar, pepton, Cao thịt, NaCl, Cao men, Glucose, cao malt... - Nhóm hoá chất thử hoạt tính enzyme: tinh bột tan, casein, CMC và pectin, tannic axit. - Nhóm hoá chất dùng cho định lượng: Methyl gallate (Methyl 3,4,5 – trihydroxybenzoate) 0,01M ; Citrate buffer 0,05M ; Methanolic rodanine 0,667% ( w/v). c, Môi trường Các môi trường dùng trong thí nghiệm bao gồm: Môi trường nuôi cấy, Môi trường phân lập, môi trường giữ giống, môi trường lắc khởi động, môi trường dịch thể, môi trường dùng trong xác định hoạt tính enzyme. * Môi trường nuôi cấy nấm sợi - Môi trường Czapeck (g/l): Sucrose – 30; NaNO3 – 3; K2HPO4 – 1; MgSO4.7H2O0,5 ; FeSO4.7H2O – 0.01; KCl – 0.5; agar : 17. pH 6. - Môi trường PDA (g/l) : khoai tây-200 ; glucose-20 ; agar-17 ; pH6. * Môi trường nuôi vi khuẩn Môi trường NA (g/l) : pepton-5 ; Cao thịt-3 ; NaCl-3 ; agar-16 ; pH7. * Môi trường nuôi xạ khuẩn - Môi trường YG (g/l) : Glucose-10 ; Cao men-10 ; agar-17 ; pH7. - Môi trường ISP4 (g/l): Tinh bột tan-10 ; K2HPO4-1 ; MgSO4.7H2O-1 ; NaCl-1; (NH4)2SO4-2 ; CaCO3-2, pH7. * Môi trường nuôi nấm men Môi trường YM (g/l) : Glucose-10 ; pepton-5 ; cao men-3 ; cao malt-3 ; agar-17 ; Cloraphenicol-0.4 ; pH6.2.