Tài liệu Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ pa của vi khuẩn bacillus anthracis

  • Số trang: 69 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 628 |
  • Lượt tải: 0
hoanggiang80

Đã đăng 20010 tài liệu

Mô tả:

Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn Bacillus anthracis
Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Bệnh than là một căn bệnh nhiễm khuẩn cấp tính do vi khuẩn Bacillus anthracis (B. anthracis) gây ra cho gia súc, đặc biệt là cho các động vật ăn cỏ nh- trâu, bò, dê cừu ngựa... Bệnh than có khả năng lây nhiễm sang người thành dịch với tỷ lệ tử vong cao. Bệnh có nhiều dạng biểu hiện khác nhau tuỳ theo cách tiếp xúc với bệnh, nhưng nhìn chung, bệnh than bao gồm 4 dạng: than thể da, than thể hô hấp, than thể tiêu hoá và than thể màng não. Bệnh than là một căn bệnh vô cùng nguy hiểm. Nã mang một số đặc điểm được trung tâm kiểm soát và ngừa bệnh Hoa Kỳ dùng để nhận biết các trường hợp có thể làm vũ khí sinh học như thời gian lây nhiễm nhanh, tỷ lệ gây chết cao, tác nhân gây bệnh có thể chống chịu được với điều kiện khắc nghiệt. Chính vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán bệnh than và tác nhân gây bệnh than là rất quan trọng Kháng nguyên tái tổ hợp PA là một trong 3 loại độc tố than của vi khuẩn Bacillus anthracis. PA là nhân tố quyết định tính độc của vi khuẩn than. Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật chủ. Ngoài ra, PA còn có chứa vùng liên kết thụ thể và có khả năng gây đáp ứng miễn dịch chống bệnh than. Chính vì vậy, hiện nay có nhiều nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bảo vệ PA để tạo protein tái tổ hợp làm nguyên liệu để tạo kit chuẩn đoán bệnh than còng nh- tạo vaccine phòng chống bệnh than. Trên thế giới hiện nay đã có rất nhiều công trình công bố về việc biểu hiện gan pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA. Tuy nhiên, ở Việt Nam đây vẫn là vấn đề mới đang được quan tâm. Đáp ứng những yêu cầu cấp bách trong phòng và trừ bệnh than, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: 3 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của vi khuẩn Bacillus anthracis” Mục tiêu của đề tài:  Biểu hiện protein PA của vi khuẩn B. anthracis trong E . coli BL21,  Thu nhận protein PA với lượng lớn để tinh sạch. Nhiệm vụ của đề tài:  Thiết kế vector biểu hiện pET-TRX-FUS mang gen pagA,  Nghiên cứu tạo chủng E. coli BL21 tái tổ hợp mang gen pagA,  Tìm ra điều kiện thích hợp cho quá trình biểu hiện về nhiệt độ, nồng độ IPTG, thời gian,  Tinh sạch được protein trên cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin . 4 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. Sơ lược về bệnh than 1. Lịch sử xuất hiện và phát triển của bệnh than Bệnh than hay còn gọi là bệnh nhiệt thán, đã gây ra những thiệt hại vô cùng to lớn cho ngành chăn nuôi gia súc cũng nh- làm ảnh hưởng tới sức khoẻ con người. Vì thế mà nó được đặt tên là “Black Bane” nghĩa là thảm hoạ đen, vì khi bị nhiễm bệnh, vết thương có màu đen [1]. “Bệnh Than” bắt nguồn từ Hy Lạp “Anthrakos” nghĩa là than, do vết thương trên da có màu đen. Bệnh than được tìm ra bởi John Bell vào cuối thế kỷ 15. Năm 1876, Robert Kock đã tìm ra nguốn gốc của bệnh than và quả trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis (B. anthracis). Bệnh than thường xuất hiện ở những trang trại vào một thời điểm nhất định, đặc biệt là những vùng nông nghiệp phía Nam Châu Mỹ và Châu Phi. Bệnh thường gặp ở những động vật ăn cỏ nh-: cừu, dê, ngựa, trâu bò. Đặc biệt bệnh có thể lây nhiễm sang người nên được coi là mối hiểm hoạ đe doạ cho sức khoẻ cộng đồng. Trận dịch Than được biết đến đầu tiên trong Lịch sử xảy ra năm 1500 Trước Công Nguyên làm chết nhiều vật nuôi của người Ai Cập. Năm 1491 Trước Công Nguyên, tiếp tục một cơn lốc bệnh Than ở Ai Cập làm chết nhiều gia súc, và làm nóng lên sự kiện bệnh Than. Những năm 1960, bệnh than đã làm chết khoảng 60.000 gia súc ở Châu Âu. Năm 1789, một trận dịch bệnh than lan tràn ở vùng Tresnobin (Nga). Tháng 4/1979, ở Sverdlovsk, Liên Xô nay là Ekatarinbua, xảy ra một trận dịch than thể hô hấp làm chết 66 người [20]. Sau đó vài năm, một trận dịch tương tự xảy ra ở Paraguay. 5 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp Năm 1989, ở miền Bắc xứ Wales xảy ra một trận dịch than lớn. Người ta phải giết 4492 con gia súc bị nhiễm than và áp dụng các biện pháp sát trùng chất thải, nhà cửa, thiết bị, đường xá, đất đai bằng fomalin. Năm 1978- 1980, một trận dịch than ở Zimbabwe làm hơn 6000 người bị nhiễm bệnh và 100 người chết. Sau sự kiện ngày 11/9/2001, bọn khủng bố sinh học đã dùng bào tử của vi khuẩn B. anthracis tấn công một số bưu điện của Mỹ bằng các phong bì thư làm 5 người chết và 17 người bị nhiễm bệnh [1] Trận dịch Than gần đây nhất là ngày 14/6/2005 xảy ra ở một quốc gia nhỏ ở Châu Phi làm chết 4 người và hơn 80 người bị nhiễm bệnh [27]. Ở Việt Nam, bệnh Than cũng đã xuất hiện từ lâu nhưng Ýt được thông báo. Theo số liệu thống kê của Viện Vệ sinh Dịch tÔ Trung ương, năm 1997 có 30 người mắc bệnh Than, năm 1998 có 59 người, năm 1999 có 58 người. Riêng năm 2000 có 27 người mắc bệnh than, trong đó có 12 ca ở Cao Bằng, 11 ca ở Lai Châu, 4 ca ở Đồng Nai, tuy nhiên không có ca nào bị tử vong. Hầu hết các ca mắc phải đều tập trung ở miền núi chăn nuôi gia súc lớn nhThanh Hoá, Tuyên Quang, Nghệ An, Lai Châu, Đắk Lăk [1, 2]. Đối với các trường hợp mắc bệnh than ở nước ta hầu hết do tiếp xúc với động vật ăn cỏ nh- trâu, bò, những người làm nghề thuộc da chế biến xương [28]. 2. Các dạng bệnh than Bệnh Than thường xuất hiện ở các loài động vật hoang dã cũng nhđộng vật nuôi, đặc biệt là các loại gia súc ăn cỏ nh- trâu, bò cừu, la, ngựa, dê do chúng hít phải hoặc nhiễm phải bào tử than trong đất. Ở người, nguy cơ mắc bệnh than là do tiếp xúc với động vật ăn cỏ [29]. Bệnh than có thể nhiễm vào cơ thể vật chủ theo ba con đường: qua da, qua đường tiêu hoá và đường hô hấp. Bệnh than có thể biến chứng thành thể than màng não nếu hít vào bào tử than. Tuỳ theo cách thức lây nhiễm mà 6 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp người ta chia bệnh than thành 4 các thể than khác nhau: Than da, than tiêu hoá, than hô hấp, than màng não [19]. 2.1. Bệnh than thể da Đây là hình thức thức than phổ biến nhất chiếm hơn 90% và loại bệnh có khả năng điều trị. Bệnh thường gặp ở những nhóm đối tượng nguy cơ lây nhiễm cao, thường xuyên tiếp xúc với động vật và các sản phẩm từ gia súc đã bị nhiễm than, thường là những người nông dân, bác sỹ thú y, người giết mổ gia sóc hay thịt. Từ các vết thương hở trên da, vi khuẩn hay bào tử B. anthracis có thể xâm nhập vào. Hình 1.1: Bệnh than thể da Triệu chứng của bệnh: Sau 1-2 ngày đầu thấy xuất hiện các vết sẩn ngứa như côn trùng đốt, dần dần xuất hiện các dấu hiệu ngoại tử trong vùng tâm. Sau 2-3 ngày sẽ xuất hiện các mụn nhỏ hay nốt nhú tại vị tri nhiễm, xung quanh xuất hiện các mụn nước. Vài ngày sau, tại vùng trung tâm vết loét sẽ xuất hiện các nốt đen, khô bắt đầu bong vẩy. Trong khoảng 1-2 tuần kể từ khi nhiễm bệnh sẽ xuất hiện các mủ và các hiện tượng đau nhức, mệt mỏi, sốt, bạch cầu tăng, các hạch bạch huyết tăng lên. Sau đó vùng thương tổn sẽ chuyển sang dạng tự phát. Nếu bệnh nặng thêm vết loét sẽ lan rộng và ăn sâu 7 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp làm nhiễm trùng máu dẫn đến không thể chữa khỏi. Than da gây tử vong khoảng 20% các trường hợp không được điều trị. 2.2. Bệnh than thể tiêu hoá Nguyên nhân của bệnh than thể tiêu hoá là do ăn phải thịt gia súc đã bị nhiễm bào tử than mà không được nấu chín, thậm chí cả khi được nấu chín thì khả năng gây bệnh vẫn cao [2]. Người ta tìm thấy vi khuẩn than trong dịch ruột của bệnh nhân mắc bệnh than. Đầu tiên vi khuẩn sẽ tấn công vào những vị trí thương tổn của màng ngày ruột và dạ dày. Từ những vị trí này sẽ xuất hiện những vết loét, lan rộng và lan vào hệ bạch huyết. Bệnh than tiêu hoá thường Ýt gặp nhưng lại có tỷ lệ tử vong khá cao. Bệnh thường có hai thể lâm sàng [11]: Thể bụng: dấu hiệu đầu tiên và rất dễ nhận là có thương tổn xuất huyết hoại tử ở manh tràng và các vùng lân cận. Triệu chứng ban đầu không đặc biệt với những cảm giác buồn nôn, biếng ăn, sốt cao. Sau đó là các triệu chứng đau bụng, tiêu chảy, sốc do nhiễm trùng và tử vong. Bệnh nhân có thể viêm phúc mạc hoặc viêm lá lách do vi khuẩn tấn công vào khu bạch huyết. Sau 2-3 ngày kể từ khi xuất hiện dấu hiệu của bệnh sẽ gây tử vong. Thể họng, miệng: Tại vùng thương tổn thấy xuÊt hiện hoại tử ở vùng vòm họng, cổ họng cứng, sưng amidan. Bệnh nhân sốt cao, khó nuốt, hạch vùng cổ sưng to, nhiễm độc máu và đa số dẫn đến tử vong. Dạng than này có tỷ lệ tử vong cao chiếm 50% mặc dù có được điều trị. 8 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.2: Manh tràng đã bị nhiễm vi khuẩn than 2.3. Bệnh than hô hấp Nguyên nhân gây than hô hấp là do hít phải bào tử than. Sau khi vào cơ thể, các bào tử than sẽ phát triển thành thể hoạt động và di chuyển tới các phế nang, hạch lympho phổi và trung thất gây xuất huyết hoại tử và phù thũng làm trung thất giãn rộng ra cả hai bên làm bệnh nhân có cảm giác đau vùng ức, sốt cao. Các thương tổn xuất huyết và hoại tử lan đến màng phổi gây tràn máu màng phổi. Khí quản cũng bị ảnh hưởng với các triệu chứng nh- ho khan, co thắt, vùng phổi bị phù. Vi khuẩn sẽ theo đường máu lan đến phần dưới niêm mạc của ống tiêu hoá và tạo nên các vết loét ở thành ruột làm bệnh nhân nôn ra máu, tiêu hoá ra máu hoặc cả hai triệu chứng trên. Một sè nang Lympho của đường tiêu hoá cũng bị phù và xung huyết, nếu bệnh nặng hơn có thể biến chứng sang thể màng não gây xuất huyết. Đa số bệnh nhân đều tử vong trong khoản 1- 2 ngày kể từ khi phát bệnh. Tỷ lệ tử vong của bệnh than này rất cao. Hình 1.3: Trung thất dãn ra do hít phải bào tử than 2.4. Bệnh than thể màng não Bệnh thường do biến chứng từ ba thể than trên. Than màng não xuất hiện khi vi khuẩn B. anthracis tấn công vào hệ thống thần kinh trung ương theo đường máu và các mạch bạch huyết. Triệu chứng của bệnh là thường sốt 9 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp cao, mệt mỏi, đau cơ, đau đầu, buồn nôn lên cơn mê sảng khi phát bệnh và dẫn đến hôn mê. Đa số bệnh nhân thường dẫn đến tử vong sau 1- 2 ngày kể từ khi mắc bệnh. Thể than này có tỷ lệ tử vong rất cao. Hình1. 4: Não của người bị nhiễm bệnh than 3. Bệnh than và chiến tranh sinh học Sức tàn phá của bệnh than là vô cùng to lớn, đồng thời nó dễ chuẩn bị và phát tán nhanh nên đã được sử dụng nh- một loại vũ khí sinh học làm tê liệt cả một thành phố, thậm chí cả một quốc gia [24]. Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, bệnh than đã được sử dụng nh- một thứ vũ khí vô cùng lợi hại. Một vài nước nh- Đức, Nhật, Hoa Kỳ, Liên hiệp Anh, Iraq và Liên Xô cũ đã thừa nhận là sử dụng bệnh than làm phương tiện của chiến tranh [30]. Năm 1915, Mỹ đã tiêm vi khuẩn bệnh than vào ngựa, la, trâu, bò, để cung cấp cho các nước trong chiến tranh thế giới thứ nhất. Năm 1937, Nhật bắt đầu thử nghiệm vũ khí bệnh than ở Mãn Châu Lý (Trung Quốc). Năm 1942, Liên hiệp Anh cũng tiến hành thử nghiệm vũ khí bệnh than ở Gruinard Island, vùng duyên hải Scotland. 10 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp Năm 1943, Mỹ bắt đầu phát triển vũ khí bệnh than. Sau chiến tranh thế giới thứ hai, Mỹ vẫn tiếp tục thực hiện chiến tranh sinh học ở Fort Detrick, Maryland. Mặc dù năm 1972, quy ước Quốc tế cấm phát triển và dự trữ vũ khí sinh học nhưng các cuộc chiến tranh và khủng bố vẫn tiếp diễn. Năm 1979, bào tử than đã được phóng thích ở quân đội Liên Xô cũ làm chết 68 người. Năm 1991, lính Mỹ được tiêm phòng vaccine bệnh than để chuẩn bị cho chiến tranh vùng vịnh. Năm 1990-1993, nhóm khủng bố Aum Shinrikyo đã phóng thích bệnh than ở Tokyo nhưng không gây tổn thương. Năm 1995, Iraq thừa nhận đã tạo ra 8.500 lá thư có chứa tác nhân gây bệnh than. Ngày 22/10/2001, những lá thư có chứa bào tử than được chuyển đến các bưu điện Mỹ làm 5 người chết, và 17 người bị nhiễm bệnh. Sự kiện này đã làm đau đầu các nhà cầm quyền Mỹ và buộc họ phải chi trả nhiều triệu đô la cho việc tiêm phòng vaccine. Tháng 9/2001, sau vụ khủng bố ngày 11/9, tại Cangene xảy ra một vụ tương tự làm 22 người mắc bệnh trong đó 11 người mắc bệnh than da và 11 người mắc bệnh than hô hấp, 5 người trong số mắc than hô hấp đã chết [31]. Nguyên nhân mà bệnh than được sử dụng như một loại vũ khí sinh học hiệu quả là do vi khuẩn than phát tán rất nhanh và bào tử của nó có khả năng chống chịu tốt với điều kiện khắc nghiệt của ngoại cảnh. Trước tình hình chính trị bất ổn như hiện nay thì nguy cơ xảy ra chiến tranh sinh học luôn là mối đe doạ lớn. Vì vậy chóng ta cần phải nghiên cứu kỹ về tác nhân và cơ chế gây bệnh than để ngăn ngừa và chống lại chúng bất cứ lúc nào. II. Tác nhân gây bệnh than 11 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp Năm 1849, lần đầu tiên nguồn gốc bệnh than được nhà nghiên cứu người Đức Pallender phát hiện ra tác nhân gây bệnh là vi khuẩn B. anthracis. Năm 1950, ông Daven, nhà nghiên cứu người Pháp cũng tìm ra tác nhân gây bệnh là B. anthracis. Nhiều năm đó, cũng có nhiều nhà khoa học nghiên cứu kỹ hơn về loại vi khuẩn này nh- Kock và cộng sù (1876), Pasteur và cộng sự (1877), Xenkovck và cộng sự (1883). Năm 1877, Kock đã nuôi cấy vi khuẩn B. anthracis trên môi trường tinh khiết và chứng minh nó có khả năng hình thành bào tử và có thể gây chết cho động vật. Ông đã chứng minh sự có mặt của vi khuẩn này trong máu của động vật chết bởi bệnh than. Năm 1822 1905, Pasteur và cộng sự đã tìm thấy bào tử B. anthracis ở nơi chôn xác động vật bị chết bởi bệnh than. 1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis. Vi khuẩn B. anthracis thuộc nhóm I, chi Bacillus. Nó tồn tại trong đất, trong nước và không khí. Vi khuẩn B. anthracis là vi khuẩn gram dương sinh bào tử (trong điều kiện kị khí hay kị khí bắt bắt buộc) không có lông roi nên không có khả năng di động. Kích thước tế bào từ 3-5 m, rộng từ 1-2 m. Tế bào hình que, vuông đầu, sắp xếp với nhau thành chuỗi dài như sợi rơm hoặc chỉ vài tế bào nối với nhau [19]. 12 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.5: Hình thái tế bào của vi khuẩn Bacillus anthracis Bào tử B. anthracis có hình elip nằm ở trung tâm tế bào, kích thước khoảng từ 1- 1,5 m, nang bào tử không phồng, bào tử được hình thành vào thời kỳ cuối của pha sinh trưởng Logarit [15]. Hình 1.6: Bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis Khuẩn lạc B. anthracis có màu trắng sữa hoặc trắng xám tới xám, bề mặt sần sùi, dính, ướt, đường kính 3-5mm [5]. Điều kiện thích hợp cho B. anthracis phát triển là ở điều kiện nhiệt độ 28-320C, pH=7, thời gian nuôi cấy từ 3 - 5 ngày. Khi gặp điều kiện bất lợi tế bào sinh dưỡng sẽ hình thành nội bào tử. Các nội bào tử nằm bên trong tế bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải, thì các nội tử sẽ được giải phóng, chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong một thời gian dài. Các nội bào tử khá bền vững, chúng có thể chịu đựng được các điều kiện khắc nghiệt của môi trường bên ngoài như tia tử ngoại, sự ăn mòn, nhiệt độ môi trường (quá nóng hay quá lạnh), thiếu hụt chất dinh dưỡng hoặc nước. Khi gặp điều kiện thuận lợi, các nội bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Các tế bào sinh dưỡng lại tiếp tục phát triển nếu gặp điều kiện thuận lợi và ngược lại nếu gặp điều kiện bất lợi nó lại hình thành nên các nội bào tử. 13 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp Bào tử B. anthracis được hình thành trong điều kiện nhiệt độ 12- 420C và có khả năng chống chịu tốt với các điều kiện khắc nghiệt. Bào tử B. anthracis đã được tìm thấy ở rất nhiều nơi trên thế giới. Nó vùi sâu trong lòng đất và có thể tồn tại ở đó hàng chục năm. Sau những cơn mưa rào hoặc hạn hán, bào tử sẽ nảy mầm trên bề mặt đất, khi động vật ăn phải sẽ bị nhiễm bệnh và chết. Bào tử B. anthracis có khả năng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt của ngoại cảnh rất tốt, vì vậy nó được sử dụng nh- một thứ vũ khí lợi hại trong chiến tranh và khủng bố [8]. 2. Đéc tố của vi khuẩn B. anthracis Các độc tố của vi khuẩn B. anthracis bao gồm độc tố vỏ nhày và các độc tố than. Độc tố vỏ nhày bản chất là acid poly -  - D- glutamic, đã được mã hoá bởi các gen capA, capB, capC nằm trên plasmid pXO2 (95kb). Các độc tố than bao gồm kháng nguyên bảo vệ PA, nhân tố gây chết LF, nhân tố gây phù nhũng EF. Các độc tố than lần lượt được mã hoá bởi các gen pagA, lef và cya, các gen này nằm trên plasmid pX01 (185kb) [6, 15]. 2.1. Độc tố vỏ nhày Độc tố vỏ nhày hay vá capsule có bản chất là acid poly - - D glutamic, có trọng lượng phân tử là 215 kDa ở trong tế bào và ở ngoài tế bào là 20- 55 kDa. Nó được mã hoá bởi các gen cap nằm trên plasmid pXO2 có trọng lượng phân tử là 95kb [19, 22]. Tất cả các dòng độc của B. anthracis đều tạo ra vỏ nhày. Vỏ nhày giúp cho vi khuẩn B. anthracis tránh được sự bảo vệ của hệ thống miễn dịch vật chủ và kích thích gây nhiễm trùng. Vỏ nhày ức chế đại thực bào và gây ra đáp ứng miễn dịch yếu. Ngoài ra vỏ nhày còn có tác dụng bảo vệ làm tăng tính độc của vi khuẩn bệnh than. Thông thường các khuẩn lạc xù xì sẽ độc hơn các khuẩn lạc nhẵn [19]. 14 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp Vỏ nhày không được hình thành khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng thông thường. Nó chỉ hình thành trong môi trường thạch huyết ngựa hoặc môi trường có bổ sung 0,7 % Na2CO3, ủ ở 370C, trong điều kiện bị khí [11]. Bản thân chuỗi Poly -  - D- glutamic không gây độc nhưng có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại thành phần diệt khuẩn của huyết thanh và bạch huyết, chống lại hiện tượng thực bào. Vì vậy, vỏ nhày có vai trò trong suốt quá trình xâm nhiễm và có vai trò nhất định trong giai đoạn cuối của bệnh [11]. 2.2. Độc tố than Các độc tố than đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh ở cả giai đoạn đầu của bệnh cũng như trong suốt quá trình phát triển của bệnh [7]. Độc tè than bao gồm 3 thành phần: Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen), nhân tố gây phù thòng EF (Edema Factor) và nhân tố gây chết LF (Lethal Factor). 2.2.1. Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective Antigen-PA) Protein độc tố PA hoàn chỉnh có trọng lượng phân tử là 83kDa, bao gồm 735 acid amin (Mr82,684), 394 phân tử nước và 2 nguyên tử canxi. Phân tử PA hoàn chỉnh có 4 vùng chức năng, mỗi vùng có vai trò khác nhau trong quá trình nhiễm bệnh [19, 22]. Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hoá bởi gen pagA nằm trên plasmid XO1. Bản thân PA không gây độc nhưng khi kết hợp với nhân tố gây chết LF hay nhân tố gây phù thũng EF lại sinh sản độc tố gây chết hoặc phù thũng cho tế bào vật chủ. Do đặc tính này mà kháng nguyên bảo vệ PA được xem là một kênh dẫn truyền gián tiếp cho các nhân tố EF và LF để chúng phát huy độc lực. 2.2.2. Tác nhân gây phù thũng (Edema Factor - EF) 15 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp EF được coi nh- mét enzym Adenylate Cyclase (AC), có trọng lượng phân tử 89 kDa, chứa 767 gốc axid amin. Nó có chức năng chuyển hoá ATP nội bào thành cAMP, quá trình này được thực hiện khi EF kết hợp với Calmodulin (CaM- là một thụ quan canxi lớn trong tế bào nhân chuẩn [19, 22]. EF phụ thuộc calmodulin có 3 trình tự được duy trì chặt chẽ, gồm 24 acidamin (303-339) mang vị trí gắn ATP. Trình tự này có liên quan đến quá trình xúc tác. EF có thể tương tác với màng kép lipid mà không phụ thuộc vào pH, không giống như LF, EF còn liên kết với các lỗ màng sau khi được chuyển vào trong tế bào chất [19]. Khi EF được kháng nguyên bảo vệ PA dẫn vào trong tế bào vật chủ độc tố EF sẽ gây nên hiện tượng mất cân bằng enzym và dẫn đến làm mất tính thấm của tế bào vật chủ. Dịch tế bào bị dồn ứ và gây nên hiện tượng trương bào, màng tế bào căng ra mọng nước, đây chính là nguyên nhân gây phù thũng ở tế bào vật chủ [18]. Hình 1.7: Tác nhân gây phù thũng EF 16 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp Nhân tố gây phù thũng EF được tạo bởi Ýt nhất 3 vùng chức năng riêng biệt, trong đó có vùng EF3 (là phức tạp bởi phần enzym của EF với CaM và adennosine 5’-  - β - Methylene – triphosphat, đây là vùng quan trọng nhất, nó kết hợp với CaM để gây phù thũng cho tế bào vật chủ. 2.2.3. Nhân tố gây chết (Lethal Factor- LF) Nhân tố gây chết LF là một protein gồm 776 acid amin, trọng lượng phân từ 90kDa. Nó được coi là một nhân tố quan trọng do vi khuẩn B. anthracis tiết ra [19]. LF chứa một loạt 4 trình tự lặp lại không hoàn toàn trong phần trung tâm, sự mất đoạn trong vùng này làm protein bị bất hoạt hoặc không hoạt động. Sự đột biến ở những gốc có tính chất quyết định sẽ tiêu huỷ hoạt tính độc tố gây chết và gắn Zn2+ với LF [19]. Vì thế, LF được coi là một metalloprotease kẽm [9]. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LF phân giải các acid amin đầu N của protein kinase hoạt hoá quá trình phân bào (Mitogen Activated Protein Kinase- MAPKs) [19]. Sự đột biến ở vùng xúc tác của LF sẽ làm mất độc tính của đại thực bào và ảnh hưởng đến sự phân bào [6]. 17 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.8: Nhân tố gây chết LF Khi LF kết hợp với Zn2+ sẽ làm tăng quá trình sản xuất cytokin trong đại thực bào và tế bào bạch huyết [18]. Đây chính là nguyên nhân gây phá huỷ đại thực bào và là thủ phạm chính dẫn đến hiện tượng sốc và tử vong. Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào, độc tố LF sẽ làm tăng tính thấm của các ion Na+ và K+, sau đó là quá trình thuỷ phân ATP. Quá trình này ức chế sự tổng hợp các đại phân tử liên quan đến đáp ứng miễn dịch [10]. LF phong toả hệ thống báo động của cơ thể bằng cách gắn với một cấu trúc protein đặc biệt của tế bào, vùng metallo- protease của LF sẽ nhằm tới các kênh dẫn truyền tín hiệu nội bào làm cho những thông tin mà tế bào cần thông báo cho hệ miễn dịch về sự xuất hiện của yếu tố lạ bị đình chỉ, từ đó các protease sẽ phá huỷ cấu trúc nội bào gây chết cho tế bào vật chủ. 3. Điều khiển sự biểu hiện của các gen gây độc trong vi khuẩn B. anthracis Người ta đã xác định được rằng có hai nhân tố chính điều hoà sự dịch mã và biểu hiện của gen là atxA và acpA. Gen acpA nằm trên plasmind pXO2 hoạt hoá sự biểu hiện của gen capB (mét trong các gen mã hoá vỏ capsule). Gen atxA nằm trên plasmind pXO1 hoạt hoá sự biểu hiện của các gen capB và các gen mã hoá protein độc tố pagA, lef và cya. Gen atxA là nhân tố điều hoà dương cho sự hoạt hoá quá trình dịch mã của các gen độc tố. Sự hoạt hoá này phải thực hiện trong môi trường có nồng độ CO2/bicacbonat cao. Ngoài ra atxA còn thực hiện một vai trò khác là điều chỉnh sự biểu hiện của các gen độc tố khi nó xâm nhiễm vào tế bào vật chủ để gây độc [19, 26]. Để hiểu rõ vai trò của nhân tố điều hoà atxA, người ta tiến hành gây đột biến để tạo một thể đột biến atxA. Khi nuôi cấy trong môi trường giàu dinh dưỡng, thể đột biến atxA và chủng gốc có sự phát triển nh- nhau. Nhưng trên môi trường nghèo dinh dưỡng nh- môi trường tổng hợp XO hoặc các môi 18 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp trường tương tự khác thì thể đột biến không gây độc chủng Steme (pXO1+ pXO2) rất khó phát triển. Thể đột biến này tạo ra những đám khuÈn lạc nhỏ hơn so với chủng gốc. Nh- vậy gen atxA có liên quan trực tiếp đến sự tổng hợp vỏ capsule có nghĩa là nó liên quan đến gen mã hoá vỏ capsule. Đồng thời sự có mặt của atxA còn có tác dụng rõ rệt đến sự hình thành bào tử. Thể đột biến atxA của chủng Sterne tạo nhiều bào tử hơn khi phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng, còn các chủ Sterne ban đầu mang đột biến atxA nhưng đã loại bỏ các gen độc tố thì không có đặc tiònh trên. Điều đó thể hiện sự liên quan chặt chẽ của atxA và các gen độc tố [26]. Cùng với hai nhân tố điều hoà acpA và atxA, người ta cũng tìm thấy một gen pag kích thước 300bp, nó cùng được dịch mãc xuôi chiều với gen pagA. Gen pagR mã hoá cho mét protein có trình tự acid amin giống các tác nhân điều hoà dịch mã trong các sinh vật khác. Gen pagR ức chế sự biểu hiện của gen acpA và atxA. Ngoài ra, gen pagR còn điều khiển sự biểu hiện của một vài tổ hợp phiên mã promoter- lacZ được hoạt hoá bởi CO2/atxA. Sự điều hoà những tổ hợp này cùng với gen pagA và pagR có thể phụ thuộc vào sự thay đổi mức độ AtxA hoặc không phụ thuộc vào sự biểu hiện của atxA [26]. Sự dịch mã các gen độc tố và gen mã hoá vỏ capsule tăng lên khi tế bào phát triển trong môi trường có nồng độ CO2/bicacbonat cao và ngược lại, nếu nồng độ này thấp sẽ ức chế quá trình dịch mã [15]. Hai nhân tố là CO2/bicacbonat và nhiệt độ cũng đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của 3 gen độc tố. Sự tổng hợp độc tố thu được nhiều nhất khi ủ canh trường có nồng độ CO2>>5% hoặc bổ sung khí bicacbonat vào môi trường đã được đậy kín. Sự tổng hợp độc tố khi ủ canh trường ở nhiệt độ 370C cũng nhiều hơn khi ủ ở 280C [15]. Nh- vậy quá trình dịch mã và biểu hiện của gen độc tố và gen mã hoá vỏ capsule trong vi khuẩn B. Anthracis được điều khiển bởi ba nhân tố điều hoà là acpA, atxA và pagR. Đồng thời 2 yếu tố CO2/ bicacbonat và nhiệt độ cũng chi phối sự biểu hiện của các gen độc tố [22, 24]. 19 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp III. Kháng nguyên bảo vệ PA 1. Vai trò của kháng nguyên bảo vệ PA Kháng nguyên bảo vệ PA là thành phần quan trọng trong quá trình gây độc của vi khuẩn B. anthracis. Phân tử PA hoàn chỉnh có trọng lượng 83 kDa, gồm 735 acid amin, kích thước không gian 3 chiều là 100 x 50 x 30A0. Kháng nguyên bảo vệ PA do gen pagA mã hoá, gen này nằm trên plasmid pXO1 (185kb) [19, 24]. Mặc dù bản thân PA không gây độc nhưng nó lại có khả năng truyền dẫn các độc tố vào bên trong tế bào vật chủ. PA83 có khả năng kết hợp cụ thể trên bề mặt tế bào. Dưới tác dụng của protease nội bào họ furin, PA83 sẽ bị phân tách thành 2 phần là PA20 và PA63, để lộ ra vị trí liên kết với LF và EF [19, 24]. Đây là bước rất nguy hiểm trong quá trình gây độc của PA. Các nghiên cứu gần đây cho thấy nếu trên phân tử PA83 không chứa vị trí phân cắt này thì không có khă năng gây độc. Sau đó, các mảnh PA63 sẽ liên kết với nhau để tạo thành vòng heptam có 7 nhánh. Khi vòng heptam kết hợp với nhân tố LF sẽ gây chết và kết hợp với nhân tố EF sẽ gây phù nhũng cho tế bào vật chủ. Vì vậy, kháng nguyên bảo vệ PA được coi là tác nhân gián tiếp gây ra hiệu quả độc tố của nhân tố gây chết và phù thòng. Bên cạnh đó PA còn có vai trò chính trong miễn dịch bệnh than. Người ta đã nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch của nhiều kháng nguyên vi khuẩn B. anthracis như vá capsule, S - layer hay cá protein khác, kết quả cho thấy chỉ có các protein hình thành độc tố than mới có khả năng kích thích miễn dịch sinh kháng thể nhờ khả năng trung hoà độc tố than [9]. Kháng thể PA sẽ phá huỷ protein PA ở vị trí liên kết với thụ thể trên tế bào vật chủ hoặc phá huỷ vị trí phân cắt trên vùng I của PA83. Chính nhờ vai trò dẫn truyền quan trọng của PA cũng như khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng thể chống bệnh than nên PA đã trở thành tâm điểm chú ý của nhiều nghiên cứu 20 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp chẩn đoán, phòng ngừa bệnh than cũng như các nghiên cứu sản xuất vaccine sử dụng nguyên liệu là protein kháng nguyên bảo vệ tái tổ hợp. 2. Cấu trúc kháng nguyên bảo vệ PA Hình 1.9: Cấu trúc đơn phân kháng nguyên bảo vệ PA Phân tử PA hoàn chỉnh gồm 735 acid anim (83 kDa). Nó có trình tự tương đồng với một họ các độc tố nhị nguyên ADP – ribosyltransferase như: thể nhân B của Clostridium botulinum C2 (33% tương đồng), Clostridium difficile cdt (35% tương đồng), Clostridium perfingens iota-toxin-1b (34% tương đồng), Clostridium spiroforme Sb (33% tương đồng) và protein VIP1 của Bacillus cereus (27% đồng nhÊt). Các con sè này nhằm giải thích cấu trúc bậc 2, 3, 4 của phân tử PA. Nhưng trình tự tương đồng giữa PA và họ độc tố 21 Lê Thu Trang 04-04 Khóa luận tốt nghiệp nhị nguyên ADP - ribosyltransferase không bao gồm vùng IV, điều này chỉ ra sự khác biệt giữa các thụ thể của các độc tố. Kháng nguyên bảo vệ PA được tạo thành bởi các cấu trúc đối song song [17]. Phân tử PA83 hoàn chỉnh gồm 4 phần chức năng: Vùng 1 (1 - 249): Cấu trúc xoắn , vùng này chứa 2 ion Ca2+ và một vị trí hoạt hoá phân giải của các protease. Sau khi PA được hoạt hoá bởi protease nội bào, nó sẽ giải phóng ra mảnh PA20 có chứa đầu N và mảnh PA63. Mảnh PA20 sau khi giải phóng sẽ bị phân giải trong môi trường, 7 mảnh PA63 sẽ liên kết lại với nhau tạo nên vòng heptam cã 7 nhánh (PA63)7, cấu trúc này tan trong nước và xâm nhiễm vào trong tế bào vật chủ [22]. Vùng II (250 – 487): là một  rỗng chứa một cấu trúc nh- cái móc lớn và linh hoạt. Vùng này liên quan đến sự hình thành vòng heptam [19]. Nó chứa một vòng xoắn lớn linh hoạt (302-325) liên quan đến sự hình thành lỗ màng. Ở pH thấp, heptam sẽ biến đổi và chuyển từ dạng tiền lỗ thành lỗ. Ngoài ra, vùng này còn có liên quan đến sự sắp xếp lại 7 vòng xoắn của heptam để tạo thành một lõi gồm 14 chuỗi  liên kết với màng. Vòng này có điểm cắt cho chymotrysin (Phe313- Phe314) hai gốc này còn có liên quan tới sự vận chuyển EF và LF vào trong tế bào chất. Vòng hep tam hình thành nên kênh chọn lọc trong màng nhân tạo và màng tế bào [19]. Vùng III (488 – 594): là vùng nhỏ nhất có cấu trúc  kiểu gấp nếp [22]. Vùng này chứa một lõi kị nước (282- 328) gồm 101 acid amin của 5 trình tự nhắc lại nối đuôi nhau và dường như được tạo ra thông qua quá trình sao chép. Vùng này bao gồm 4 tấm  bện chặt hỗn độn và 4 vòng xoắn ốc nhỏ và 1 khe tương tự nh- ở ferredoxins và vùng A của độ tố gây hội chứng shock độc 1 [22]. Vùng này liên quan đến sự tương tác giữa các Protein với nhau. Có nghiên cứu cho rằng vùng III liên quan đến quá trình oligomerization tạo thành heptam (PA63), một nửa liên kết với thụ thể và một nửa gắn với enzym thuỷ phân [19]. 22 Lê Thu Trang 04-04
- Xem thêm -