Tài liệu Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương . (tt)

  • Số trang: 24 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 116 |
  • Lượt tải: 0
thuvientrithuc1102

Đã đăng 15893 tài liệu

Mô tả:

ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc (TBG) là tế bào có khả năng biệt hóa thành các tế bào chức năng khác nhau để thay thế cho các tế bào già và chết tự nhiên hay tổn thương do các nguyên nhân khác nhau, mở ra triển vọng dùng tế bào gốc để tái tạo lại các mô. Ghép TBG từ tuỷ xương tự thân đã được dùng trên lâm sàng để điều trị thành công các trường hợp gãy xương lâu liền và khớp giả. Khi được tiêm vào ổ gãy xương, các TBG của tủy xương sẽ biệt hoá thành các tế bào tạo xương (TBTX), tái tạo lại ổ khuyết xương. Tuy nhiên nguồn tế bào gốc ở tủy xương có khó khăn về số lượng tế bào và qui trình thu thập tế bào. Màng bao dây rốn trẻ sơ sinh có các TBG trung mô (Mesenchymal Stem Cell) tương tự như các TBG trung mô ở tủy xương. Bên cạnh đó, việc phân lập TBG từ màng dây rốn có nhiều ưu điểm cả về phương diện kỹ thuật cũng như đạo đức so với phân lập TBG từ một số nguồn khác, do đó có thể sử dụng chúng như một nguồn TBG thay thế cho TBG ở tủy xương. Để ứng dụng điều trị vết thương xương sớm có kết quả, các TBG cần được biệt hóa thành tế bào tạo xương trước khi được cấy ghép vào ổ gãy xương. Các TBG trung mô được phân lập từ những nguồn khác nhau, sau đó được tăng sinh và biệt hóa in vitro thành các tế bào tạo xương bằng cách bổ sung các yếu tố kích thích biệt hóa và tạo xương vào môi trường nuôi cấy, bao gồm các cytokine, các vitamin và canxi. Tế bào tạo xương được đánh giá bằng hình thái tế bào, các phương pháp nhuộm đặc hiệu với canxi, các marker đặc trưng của tế bào tạo xương. Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương” với các mục tiêu sau: 1. Thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn người làm vật liệu để biệt hóa tế bào. 2. Biệt hoá in vitro tế bào gốc trung mô màng dây rốn người theo hướng thành tế bào dạng tạo xương nhằm ứng dụng điều trị tổn thương xương. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI Từ nguồn tế bào gốc trung mô phân lập được từ dây rốn trẻ sơ sinh đã tiến hành biệt hóa các tế bào gốc trung mô này thành tế bào dạng tạo xương rồi cấy ghép thử nghiệm tế bào được biệt hóa trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch bằng hóa chất. Đây là công trình lần đầu được nghiên cứu một cách hệ thống về quy trình thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào tạo xương tại Việt Nam, mở ra một tiềm năng mới cho lĩnh vực y học tái sinh/tái tạo sử dụng công nghệ tế bào gốc CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tế bào gốc và công nghệ tế bào gốc 1.1.3. Tế bào gốc Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới (Self-Renewal). 1.1.4. Phân loại tế bào gốc Hiện nay có rất nhiều cách phân loại TBG, tùy theo các tiêu chí khác nhau cũng như sự tiếp cận công nghệ TBG ở các góc độ khác nhau: Theo mức độ tiềm năng biệt hóa có: TBG toàn năng, TBG vạn tiềm năng, TBG đa tiềm năng, TBG ít tiềm năng, tế bào đơn tiềm năng; Theo cách thức tạo ra các TBG có các TBG tự nhiên và các TBG nhân tạo; Theo nguồn gốc phân lập tế bào gốc có: Tế bào gốc phôi, Tế bào gốc thai, Tế bào gốc nhũ nhi, Tế bào gốc trưởng thành, Tế bào giống tế bào gốc phôi hay tế bào gốc vạn tiềm năng cảm ứng, Tế bào gốc ung thư. 1.1.5 Tế bào gốc trung mô 1.1.5.1. Khái niệm Tế bào gốc trung mô là tế bào gốc trưởng thành, đa tiềm năng được thu nhận từ những mô có nguồn gốc từ trung bì như: xương, sụn, chất nền tủy xương, mô xơ cơ ở khoảng giữa hai tổ chức, cơ vân, mô mỡ. 1.1.5.2. Đặc điểm Các TBG trung mô có hình dáng đặc trưng và giống các nguyên bào sợi: đó là các tế bào hình thoi, kích thước 20µm, có nhiều nhánh bào tương, nhân lớn, trong tế bào, lưới nội bào hạt rất phát triển. 1.1.5.3. Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô TBG trung mô là các tế bào có khả năng tăng sinh mạnh mẽ và có thể biệt hóa tạo thành nhiều loại tế bào khác nhau như các tế bào mỡ, tế bào tạo xương, tế bào sụn, tế bào cơ, tế bào thần kinh.. nói cách khác đây chính là các tế bào tiền thân trưởng thành đa tiềm năng, chúng là nguồn cung cấp tế bào để bù đắp lại sự thiếu hụt mô. Trong cơ thể dưới tác dụng của các tín hiệu từ các vết thương, ổ gãy xương, ổ viêm, hay chỉ là các điều kiện vi môi trường từ một vị trí đặc biệt nào đó các tế bào này sẽ được huy động và biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt. Khi nuôi cấy TBG trung mô in vitro, sau 70 lần phân chia các tế bào này vẫn không thay đổi tiềm năng biêt hóa, điều này chứng tỏ tiềm năng tăng sinh to lớn của chúng. TBG trung mô có khả năng biệt hóa trong điều kiện in vitro thành tế bào thuộc trung bì như tế bào tạo xương, tế bào mỡ và sụn.. Để biệt hóa in vitro thành tế bào tạo xương, tế bào được cảm ứng biệt hóa trong môi trường nuôi cấy có bổ sung một hỗn hợp các hóa chất như dexamethasone, acid ascorbic, ß-glycerophosphate, calcitriol.. với một hàm lượng và tỷ lệ nhất định để tạo thành những tế bào chuyên biệt. 1.1.5.4. Các nguồn tế bào gốc trung mô Tế bào gốc trung mô có mặt trong nhiều mô khác nhau của cơ thể người. Đầu tiên tủy xương được coi là nguồn TBG trung mô cơ bản, tuy nhiên những nghiên cứu sau này càng chỉ ra nhiều nguồn tách TBG trung mô 2 với số lượng lớn hơn tủy xương nhiều lần như màng nhau, màng dây rốn, màng ối, máu ngoại vi, máu cuống rốn, mô mỡ, gan..trong đó màng bao dây rốn là một nguồn cung cấp TBG trung mô rất lý tưởng. 1.2. Ứng dụng của tế bào gốc Trên lâm sàng, tế bào gốc trưởng thành đã được sử dụng trong điều trị các bệnh tự miễn, tai biến mạch máu não, suy giảm miễn dịch, các bệnh máu, tạo xương không hoàn chỉnh, tổn thương tủy sống, liền vết thương da, tái tạo cơ tim sau nhồi máu cơ tim, tiểu đường type I, tổn thương xương và sụn, bệnh Parkinson..Trong các loại TBG, TBG trung mô là một trong loại tế bào có thể phân lập, tăng sinh với một số lượng lớn và được sử dụng nhiều trên lâm sàng trong nhiều thập kỷ qua và như một mô hình điều trị mới cho một loạt các các bệnh. Hiện nay, thử nghiệm lâm sàng dựa trên TBG trung mô đã được thực hiện ít nhất trên 12 loại bệnh lý khác nhau, với nhiều thử nghiệm đã hoàn thành và chứng minh được tính an toàn và hiệu quả 1.3. Các bệnh về xương khớp và tế bào gốc trong điều trị các bệnh về xương khớp Các bệnh về xương khớp là một nhóm bệnh thường gặp nhất trong mọi nhóm bệnh và có xu hướng ngày càng tăng. Bệnh này gây đau đớn kéo dài cho hàng trăm triệu người, gây tàn phế cho nhiều triệu người và gắn liền với nghỉ việc, giảm năng suất lao động, hạn chế các hoạt động hàng ngày và làm giảm chất lượng cuộc sống. Để điều trị các bệnh về xương khớp hiện nay: ở mức độ nhẹ và trung bình, phương pháp điều trị nội khoa bao gồm phương pháp vật lý trị liệu hoặc kết hợp với thuốc giảm đau, kháng viêm. Mặc dù có triệu chứng giảm đau tạm thời, cải thiện, có hiệu quả trong các trường hợp thoái hóa khớp gối, vai và các khớp khác, nhưng phương pháp này không giải quyết được tận gốc của bệnh. Một số trường hợp tiến triển hay trường hợp bị nặng, phương pháp thay khớp là phương pháp điều trị duy nhất hiện nay. TBG trung mô có tiềm năng tái tạo lại các mô bị tổn thương và cũng tiết ra các yếu tố tăng trưởng để tăng cường tái tạo mô. Tùy thuộc vào bệnh lý cụ thể sẽ đưa ra phương pháp điều trị bằng TBG cũng khác nhau. 1.4. Dây rốn 1.4.1. Mô học, giải phẫu và chức năng Dây rốn được hình thành vào khoảng tuần thứ 4 trong quá trình phát triển của phôi do màng ối phát triển đã ép túi noãn hoàng, cuống phôi. Dây rốn dài khoảng 40 cm tới 60 cm, bao bên ngoài là lớp nội sản mạc, bên trong là lớp chất “thạch” Wharton xen kẽ với 2 động mạch và 1 tĩnh mạch rốn. Dây rốn có chức năng đảm bảo sự liên tục giữa thai nhi với bánh nhau, từ đó thực hiện quá trình trao đổi chất giữa thai nhi và cơ thể mẹ. 1.4.2. Tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn Dây rốn là nơi tập trung TBG rất dồi dào, trong đó máu dây rốn chứa các TBG tạo máu (Hematopoietic Stem Cell) và TBG trung mô, màng bao dây rốn chứa các TBG trung mô và các TBG biểu mô (Epithelial Stem Cell). 1.4.3. Tế bào gốc từ màng dây rốn và tiềm năng ứng dụng Các nghiên cứu miễn dịch về các marker bề mặt tế bào và HLA của tế bào gốc dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ người mẹ. Ngoài việc tế bào gốc có ít kháng nguyên HLA lớp II, các tế bào gốc dây rốn còn bộc lộ HLA-G là loại kháng nguyên hoà hợp tổ chức có chức năng sinh lý là ức chế miễn dịch giúp cho thai nhi không bị phản ứng thải bỏ miễn dịch từ người mẹ (bản chất thai nhi khi nằm trong bụng mẹ cũng là một mô ghép khác gen đồng loài). Việc HLA-G bộc lộ trên bề mặt tế bào gốc phân lập từ dây rốn đã 3 giúp cho chúng dễ được chấp nhận ở một cơ thể khác, vì thế tế bào gốc dây rốn có ưư điểm hơn các loại tế bào gốc khác khi ghép cho một cơ thể khác. Các TBG trung mô thường được lựa chọn để biệt hoá thành các tế bào tạo xương. Khả năng biệt hoá của TBG trung mô theo hướng thành tế bào tạo xương đã được khẳng định trong rất nhiều nghiên cứu độc lập nhau, do vậy khả năng ứng dụng vào điều trị trong tương lai của chúng là rất nhiều triển vọng. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: Dây rốn của 15 trẻ sơ sinh được mẹ đẻ là các sản phụ trên 18 tuổi, có tiền sử khỏe mạnh, có kết quả âm tính với các xét nghiệm sàng lọc bệnh nhiễm trùng (bao gồm virus HIV, virus viêm gan B, virus viêm gan C, vi rus CMV và vi khuẩn giang mai) tình nguyện hiến cho mục đích nghiên cứu thuộc phạm vi đề tài xây dựng ngân hàng TBG dây rốn; trẻ sinh ra ở độ tuổi thai >37 tuần, sinh một và không có tai biến trong quá trình sinh đẻ. Chuột nhắt trắng dòng albino swiss do Ban chăn nuôi động vật, Phòng Trang bị vật tư kỹ thuật, Học viện Quân y cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 2.2.1.1. Thu thập và bảo quản dây rốn Sau khi em bé sơ sinh được sinh ra tự nhiên, được cắt rốn và chuyển qua chăm sóc sơ sinh, phần dây rốn tự do còn lại cùng với bánh nhau sau khi xổ nhau được thu thập vào khay inox vô trùng. cắt dây rốn một đoạn khoảng 10-15cm cho vào chai thu thập có môi trường nuôi cấy (DMEM/F12, 2% antibiotic/antimycotic, Invitrogen). Mẫu được bảo quản trong bình kín ở nhiệt độ dưới 4-8 C cho tới khi sử dụng. 2.2.1.2. Phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người Tế bào gốc trung mô từ màng bao dây rốn được phân lập bằng phương pháp nuôi cấy mô định hướng chọn lọc TBG trung mô theo mô tả của Phan Toàn Thắng và cộng sự (2005) sử dụng môi trường thành phẩm do tác giả và Công ty CellResearch Corporation (Singapore) cung cấp cho Ngân hàng tế bào gốc MekoStem; với các môi trường cơ bản DMEM high glucose, DMEM low glucose, F12 glutamax hay phối trộn các môi trường với nhau như DMEM high glucose: F12 (1:1), DMEM low glucose: F12 (1:1) theo mô tả của Chun Qiao và CS (2008); Kiran Seshareddy và CS (2008) để tìm ra môi trường thích hợp nhất sử dụng cho các giai đoạn sau của nghiên cứu. 2.2.1.3. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô màng dây rốn Các tế bào thế hệ 1 (P1: Passage 1) sau khi nuôi cấy tăng sinh tới khi che phủ 60-80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy (confluence), thì tiến hành thu hoạch và cấy chuyển cho tế bào tiếp tục tăng sinh. Dùng “cào thu hoạch tế bào” cào cho chúng bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy hoặc dung dịch Trypsin/EDTA 0,25%. Tế bào sau thu hoạch được tiếp tục nuôi cấy tăng sinh trong môi trường cơ bản (DMEM:F12, 10% FBS, 1% kháng sinh). 4 2.2.2. Kiểm định sản phẩm tế bào gốc 2.2.2.1. Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt Việc định danh TBG trung mô được thực hiện bằng kĩ thuật flowcytometry phân tích sự biểu hiện một số protein bề mặt của tế bào là các dấu ấn cụm biệt hóa CD (cluster of diferentiation) đặc trưng cho TBG trung mô. Các TBG trung mô sau khi cấy chuyền tăng sinh ở thế hệ thứ 3 được thu nhận bằng cách xử lý với trypsin/EDTA 0,25%. Tất cả các mẫu được phân tích ở tối thiểu là 10.000 tế bào và phân tích bằng phần mềm CellQuest Pro trên máy FACSCalibur (BD Bioscience, Mỹ). Panel các marker bề mặt để định danh TBG trung mô bao gồm: CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD90, CD166 và HLA-DR. 2.2.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn Tính gốc của tế bào được kiểm định bằng thử nghiệm biệt hoá theo hướng tạo tế bào mỡ như mô tả của Lee và CS (2004) và Phan Kim Ngọc và CS (2008). Tế bào sau khi phát triển kín 60-80% bề mặt bình nuôi 25 cm2 ở lần cấy chuyền thứ 5-7 được nuôi trong môi trường cảm ứng tạo mỡ: 89% DMEM/F12 bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, 0,5 µM Dexamethasone, 0,5 µM 3-Isobutyl-1-methylxanthin - IBMX, 50 µM Indomethacin. 2.2.3. Biệt hóa in vitro tế bào gốc trung mô theo hướng thành tế bào tạo xương 2.2.3.1. Khảo sát môi trường cơ bản và nồng độ chất cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo xương Biệt hóa TBG trung mô thành TBTX, sử dụng tế bào ở lần cấy chuyển thứ 4. Khảo sát thay đổi thành phần môi trường cơ bản DMEM-F12 Ham glutamax (1:1), FBS, 1% kháng sinh và bổ sung các chất cảm ứng biệt hóa tế bào: 100 nM dexamethasone, 0,25 mM axít L-ascorbic và 100 mM β-glycerolphosphate. Sau khi lựa chọn được môi trường cơ bản cho biệt hóa, để môi trường có thành phần bổ sung cho cảm ứng biệt hóa thích hợp nhất, tiến hành khảo sát thay đổi nồng độ dexamethasone, ß-glycerolphosphate (ß-GP), axít L-ascobic (AsA). Canxi xuất hiện trong TBTX biệt hóa từ TBG màng dây rốn được đánh giá thông qua khả năng bắt mầu của canxi với thuốc nhuộm alizarin red và xét nghiệm định lượng canxi bằng kỹ thuật phân tích hóa sinh thường quy. 2.2.3.2. Kiểm tra sự tích lũy canxi của tế bào sau biệt hóa bằng nhuộm alizarin red Để đánh giá tế bào biệt hóa là tế bào tạo xương trước hết đánh giá sự xuất hiện canxi trong tế bào thông qua khả năng bắt mầu của canxi với alizarin red. 2.2.3.3. Khả năng tích tụ canxi của tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô Tế bào gốc trung mô màng dây rốn được nuôi cấy cảm ứng biệt hóa và được đánh giá khả năng tích tụ canxi ở thời điểm 7, 14 và 21 ngày bằng cách nhuộm với 10% Alizarin Red. Alizarin Red là một loại thuốc nhuộm có khả năng liên kết với canxi muối và dựa vào khả năng này có thể định lượng nồng độ canxi của tế bào biệt hóa: Loại bỏ môi trường cũ trong plate nuôi cấy 6 giếng, rủa tế bào 3 lần bằng D-PBS, cố định tế bào và rửa lại 3 lần bằng D-PBS, nhuộm tế bào với Alizarin Red 10%. Để xác định số lượng màu cho 1 ml cetylpyridium chloride 10% và ủ trong 20 phút để tách rửa các thuốc nhuộm có khả năng liên kết với canxi muối. Lấy 100 μl của dung dịch tách rửa này cho vào plate 96 giếng, kết quả đọc ở bước sóng 405 nm (Norgaard et al., 2006). Kết quả được tính toán so với đường chuẩn được xây dựng dựa trên Alizarin Red và cetylpyridium clorua. Sự lắng 5 đọng canxi là thể hiện như tương đương phân tử canxi. Một mol Alizarin Red liên kết với hai mol canxi trong phức hợp Alizarin Red S-calcium. 2.2.3.4. Xác định hoạt tính của Alkaline phosphates (ALP) Hoạt tính ALP được xác định theo phương pháp của Mohamadreza B.E và CS.,2010: Các tế bào cảm ứng biệt hóa cứ sau 7, 14, 21 ngày trong các plate nuôi cây được thu hoạch, rửa sạch bằng D-PBS, đồng nhất các mẫu tế bào biệt hóa với 1 ml đệm Tris pH 7,4 và siêu âm phá vỡ tế bào. Lấy 0,1 ml dung dịch tế bào được phá vỡ trộn với 0,5 ml p-nitrophenyl phosphate (pNPP) và 0,5 ml đệm, ủ ở 37 ° C trong 15 phút, hỗn hợp trên đã được bổ sung thêm 10 ml 0.05 N NaOH để dừng phản ứng. Kết quả được đo ở bước sóng 405 nm trên hệ thống DTX 880. 2.2.4. Tách chiết RNA và tiến hành phản ứng RT-PCR (Reverse Trancriptase - Polymerase Chain Reaction) Tế bào nuôi cấy biệt hóa được xác định biểu hiện gen bằng kỹ thuật RT-PCR: Trước và sau khi biệt hóa tế bào, RNA tổng số được tách chiết bằng bộ Rnase minikit (Quiagen) như sau và tổng hợp cDNA (BioRad) theo qui trình của nhà sản xuất. Kết quả sau khi tách RNA và tổng hợp cDNA được điện di trên gel agarose 0,8 %. Qui trình của phản ứng PCR có sử dụng các cặp mồi Osteocalcin (OC) 310 bp, Osteopontin (ON) 347 bp, Collagenase type I (Col) 360 bp, Alkaline phosphatase (ALP) 453 bp, ß-Actin 838 bp. Chu trình chạy PCR: Tổng thể tích phản ứng là 25 μl, chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: 94oC/3phút, [94oC/30 giây, 5560oC/45 giây, 72oC/50 giây] x 35 chu kỳ, 72oC/8 phút. 2.2.5. Phương pháp xác định số lượng tế bào nuôi cấy Đếm số lượng tế bào trong buồng đếm Neubauer: Tiến hành xử lý đĩa nuôi cấy tế bào với trypsin, lấy hỗn dịch tế bào và bơm nhẹ hỗn dịch tế bào vào mép buồng đếm và để hỗn dịch tự chảy đầy vào buồng đếm. Số lượng tế bào được tính theo công thức: C = n x 104/ml (n: số lượng tế bào đã đếm được trong buồng đếm). Đếm số lượng tế bào bằng máy đếm: Phương pháp này được tiến hành theo bộ Kit của máy đếm tự động tế bào (Countess™ Automated Cell Counter - Invitrogen). 2.2.6. Thu hoạch và bảo quản tế bào Tế bào tăng sinh che phủ khoảng 60-80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy, thu hoạch tế bào và bảo quản trong môi trường có 10% DMSO và lưu giữ ở - 1960C cho đến khi sử dụng. 2.2.7. Phục hồi tế bào sau bảo quản lạnh sâu Nhanh chóng làm rã đông tế bào bằng cách đặt tuýp tế bào đông lạnh trong bể ấm nước ở nhiệt độ 37oC. Sát khuẩn bề mặt tuýp bằng cồn 70%, ủ ở nhiệt độ 37oC. Ly tâm 1,500 vòng/phút x 5 phút, loại bỏ dịch nổi, hòa tan cặn tế bào trong 5 ml môi trường DMEM-F12 và 10 % FBS, môi trường đã được ủ ở nhiệt độ 37oC. Ly tâm 1,500 vòng x 5 phút ở nhiệt độ phòng (18-25oC). Hòa tan cặn tế bào và nuôi cấy tế bào trong môi trường cơ bản (DMEM-F12 và 10% FBS) ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2. 2.2.8. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mô màng dây rốn lên chuột nhắt đã gây suy giảm miễn dịch bằng hóa chất 2.2.8.1. Tạo mô hình chuột nhắt suy giảm miễn dịch Được tiến hành theo phương pháp của Trương Hải Nhung và cộng sự .,2010 Sử dụng hóa chất gây ức chế miễn dịch theo phác đồ tiêm Busulfan (BU) 20mg/kg chuột 1 liều duy nhất kết hợp với cyclophosphamide 6 (CY) 50mg/kg (BU/CY) tiêm vào màng bụng liên tục trong 4 ngày. Sau các ngày tiêm, thu nhận máu ở tĩnh mạch đuôi, rồi pha loãng trong dung dịch phá hủy hồng cầu và giữ lại bạch cầu. để đánh giá các chỉ tiêu suy giảm miễn dịch thông qua sự thay đổi số lượng bạch cầu tổng số. chỉ số bình thường của chuột nhắt từ 2.300 – 11.500 bạch cầu/mm3. Vì vậy ở mật độ tế bào bạch cầu trong 1 ml máu nhỏ hơn 2000 tế bào/ml được coi là chuột suy giảm miễn dịch. 2.2.8.2. Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn trên chuột Cấy ghép tế bào tạo xương biệt hóa từ TBG trung mô trên chuột được tiến thành theo phương pháp của Yoichi Yamada và cộng sự., 2003 có điều chỉnh cho phù hợp với phòng thí nghiệm. Tế bào tạo xương biệt hóa được 21 ngày dừng nuôi cấy, thu hoạch tế bào biệt hóa và cấy ghép bằng cách tiêm dưới da vùng sau hai bên lưng chuột, thể tích tiêm 200 μl. Lô đối chứng tiêm bằng nước muối sinh lý và tiêm tế bào gốc trung mô màng dây rốn. Theo dõi sau 1 tháng kiểm tra khả năng tích tụ tạo nốt canxi tại vị trí tiêm. 2.3.9. Nhuộm hematoxylin và eosin Các mẫu dây rốn, miếng mô màng dây rốn, các nốt tích tụ can xi khi cấy ghép trên chuột suy giảm miễn dịch sau khi được thu thập sẽ được cố định trong dung dịch formalin 10%/PBS. Sau đó mẫu được chuyển đến Bộ môn – Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện 103, Học viện Quân y để nhuộm hematoxylin và eosin. 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu: Dựa trên phần mềm thống kê y học SPSS 16.0. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn người 3.1.1. Kết quả thu thập mẫu dây rốn Kết quả sau một thời gian nghiên cứu đã thu thập được 15 mẫu dây rốn của các sản phụ hiến cho nghiên cứu: Các mẫu dây rốn được thu thập đều đạt các tiêu chí chọn lọc trên, không rách nát đảm bảo cho nghiên cứu. Các mẫu dây rốn được làm tiêu bản hóa mô để xác định cấu trúc và vị trí tách màng dây rốn sử dụng cho phân lập tế bào, kết quả được thể hiện thông qua hình 3.1. Hình 3.1: Kết quả nhuộm HE xác định cấu trúc dây rốn. A: dây rốn tiêu bản cắt ngang (100X; B: Hình ảnh cấu trúc màng dây rốn (200X). 7 3.1.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn và khả năng bám dính 3.1.2.1. Thời gian nuôi cấy mô Dây rốn sau khi rửa sạch bằng nước muối sinh lý có bổ sung kháng sinh, mẫu dây rốn được chia nhỏ thành những mẩu kích thước 2 x 3 cm rồi rửa lại bằng dung dịch DMEM có pha kháng sinh trước khi được đặt vào đĩa petri và nuôi cấy trong môi trường định hướng phân lập TBG trung mô. kết quả được thể hiện ở hình 3.3, hình 3.4, hình 3.5 và hình 3.6. Các đoạn dây rốn sau khi được phẫu tích cắt thành những đoạn nhỏ được đặt trong các đĩa nuôi cấy có môi trường DMEM:F12 bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh và đặt trong điều kiện 37 C và 5% CO2 và nuôi từ 1 đến 6 ngày, sau mỗi ngày một thời gian được tách màng phân lập tế bào. Thời gian nuôi cấy mô dây rốn nào là phù hợp cho việc tách màng phân lập tế bào, chúng tôi đã tiến hành khảo sát thời gian nuôi cấy mô dây rốn ở các thời gian khác nhau từ 1 ngày, 2 ngày cho đến 6 ngày. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn Ngày nuôi cấy mô (ngày) Khả năng tách màng Khả năng bám dính (%) 1 Khó tách Không bám dính 2 Khó tách Bám dính khoảng 10% 3 Tách được Bám dính khoảng 40 -60% 4 Tách màng tốt Bám dính khoảng 70-90% 5 Tách màng tốt Bám dính khoảng 70-90% 6 Tách màng tốt Bám dính khoảng 70-90% Các đoạn dây rốn được nuôi cấy cứ sau 1 ngày tiến hành phẫu tích lớp màng bao dây rốn, cắt chúng thành các mảnh nhỏ kích thước 4 x 5mm. đặt những mảnh màng dây rốn này sang một đĩa nuôi cấy mới có môi trường DMEM:F12 high glucose bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh, đặt đĩa nuôi cấy trong điều kiện 37 C và 5% CO2, cứ sau 2-3 ngày thay môi tường một lần và loại bỏ các miếng mô không bám được trên đĩa nuôi cấy. Có nhiều phương pháp phân lập tế bào, có thể nuôi cấy sơ cấp thu nhận trực tiếp tế bào từ các mô, miếng mô để cho tế bào phát triển từ miếng mô ra bên ngoài hoặc có thể tách thành tế bào đơn bằng cơ học hay enzym như Trypsin, Colagenase, Dipase, Hyaluronidase (Hwai-Shi Wang and et.al., 2004; John R. W. Masters and et.al., 2000). Nhưng một trong những điều kiện để phân lập tế bào từ miếng mô là miếng mô phải bám được vào một chất nền thích hợp. Sau khi miếng mô bám dính, các tế bào tăng sinh mạnh trong mặt phẳng của chất nền rắn. Đối với nuôi cấy mô phân lập tế bào từ mô ở giai đoạn chưa trưởng thành là tốt nhất, thường được chuẩn bị từ các mô của phôi hoặc từ trẻ sơ sinh. Thông thường, mô được cắt thành những lát mỏng có độ dày khoảng từ 0,5 - 1,0 mm. Kỹ thuật duy trì nuôi cấy và phân lập tế bào từ mô thu được tế bào nhiều hay ít và có thể được nuôi cấy mô trong nhiều tháng, tùy thuộc vào kỹ thuật và môi trường thích hợp của mỗi một labô nghiên cứu. Một trong những lợi thế chính của phương pháp này là cấu trúc của các mô có thể được bảo quản và một số chức năng bình thường được duy trì trong nuôi cấy (John R. W. Masters and et.al., 2000) là điều kiện thuận lợi cho 8 phân lập tế bào. Đối với kết quả của chúng tôi sau khi khảo sát thời gian nuôi cấy mô để tách màng dây rốn sau 1, 2 ngày cho đến 6 ngày kết quả cho thấy (Bảng 3.1) sau 1 và 2 ngày nuôi cấy mô việc tách màng rất khó, hiệu suất thu được không cao đồng thời sau 1 ngày các màng tách không bám dính được và sau 2 ngày khả năng bám dính của màng dây rốn tách được chỉ đạt khoảng 10%. Sau 3 ngày tách được dễ dàng hơn nhưng hiệu suất bám dính chỉ đạt khoảng 40-60%. Sau 4 ngày tách màng tốt, khả năng bám dính đạt khoảng 70-90%. Sau thời gian nuôi cấy mô 5 và 6 ngày tách màng dây rốn rất dễ dàng, nhưng khả năng bám dính cũng chỉ đạt khoảng 70-90%, bằng thời gian nuôi cấy mô 4 ngày. Từ kết quả này cho thấy để rút ngắn thời gian và tiết kiệm được nguyên vật liệu, môi trường nuôi cấy, thời gian sau 4 ngày nuôi cấy mô tách màng là phù hợp. Như vậy chọn thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn phục vụ cho nuôi cấy phân lập tế bào là 4 ngày. 3.1.3. Kết quả nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào Việc nuôi cấy phân lập có tính chọn lọc, định hướng phân lập TBG trung mô được tiến hành bằng hình thức nuôi cấy mô sơ cấp theo qui trình của Phan TT và CS (2005) mô tả có cải tiến cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Các đoạn dây rốn sau khi được khảo sát chọn được thời gian tối ưu là 4 ngày, tiến hành tách màng dây rốn để phân lập tế bào. Màng dây rốn sau khi xử lý cắt thành từng mảnh nhỏ được đặt vào đĩa nuôi cấy mô 100mm và cho vào đĩa môi trường nuôi cấy DMEM/F12, bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, để ở 37 C và 5% CO2. Cứ 2 đến 3 ngày thay môi trường nuôi cấy1 lần. Định kỳ cứ sau 24 giờ nuôi cấy theo dõi 1 lần, để quan sát các tế bào mọc ra từ các miếng mô bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Kết quả sau khi nuôi cấy mô màng dây rốn phân lập tế bào được thể hiện ở hình 3.3, bảng 3.2. Hình 3.3. Nuôi cấy màng dây rốn phân lập tế bào. A: Bổ sung môi trường nuôi cấy phân lập tế bào; B: Đĩa nuôi cấy phân lập tế bào; C, D: Kết quả phân lập tế bào 9 Bảng 3.2: nuôi cấy mô màng dây rốn phân lập tế bào TT 1 2 3 Nuôi cấy mô dây rốn/đĩa nuôi cấy Số lượng đĩa nuôi cấy (n) Số lượng miếng mô dây rốn/đĩa nuôi cấy (Mean ± SD) Tỷ lệ (%) (Mean ± SD) Số miếng mô ban 10 21 ± 1.764 100 đầu/đĩa nuôi cấy Số miếng mô bám 10 19,9 ± 2.132 94.72 ± 5.727 dính/đĩa nuôi cấy Số miếng mô mọc 10 19,6 ± 2.221 93.31 ± 6.693 tế bào/đĩa nuôi cấy p: giá trị so sánh số lượng miếng mô bám dính và có tế bào di cư ra với số lượng miếng mô ban đầu nuôi cấy p 0.003 0.010 Kết quả sau khi nuôi cấy các mảnh mô đã có tế bào phát triển ra khỏi miếng mô. Với các tế bào từ miếng mô khác nhau trong cùng một mẫu nuôi cấy, sự phát triển tế bào là không giống nhau: đa số các miếng mô tế bào phát triển khá nhanh, một số miếng mô khác tế bào phát triển chậm hơn, đặc biệt một số miếng mô không có tế bào phát triển. Hiện tượng này có thể được giải thích là do trong màng bao dây rốn, các TBG trung mô tồn tại trong các “ổ” (niche), quá trình phẫu tích là hoàn toàn ngẫu nhiên, các miếng mô nào không có “ổ” TBG trung mô thì không có tế bào phát triển; miếng mô nào có “ổ” gần rìa, các tế bào phát triển tương đối nhanh; miếng mô nào “ổ” nằm gần vị trí trung tâm, các tế bào sẽ phát triển châm hơn. Qua khảo sát số lượng màng dây rốn có khả năng bám dính và số lượng màng dây rốn bám dính có tế bào di cư ra khỏi miếng mô. Ở giai đoạn đầu nuôi cấy trên mỗi 1 đĩa có thể đặt trung bình khoảng 21 ± 1.764 miếng mô màng dây rốn/đĩa nuôi cấy, sau một thời gian nuôi cấy số lượng miếng mô có thể bám dính là 19,9 ± 2.132 miếng mô/đĩa nuôi cấy (p < 0,005), miếng mô không bám dính được loại bỏ qua mỗi lần thay môi trường nuôi cấy. Số miếng mô bám dính có tế bào di cư ra là 19,6 ± 2.221 (p < 0,01) đạt 93.31 ± 6.693 % so với số lượng miếng mô màng dây rốn nuôi cấy ở thời gian đầu khảo sát. Từ kết quả ở hình 3.3 và bảng 3.2 cho thấy, đã nuôi cấy mô phân lập được tế bào, từ kết quả này làm tiền đề để khảo sát các yếu tố khác ảnh hưởng tới quá trình phân lập tế bào. 3.1.3. Kết quả khảo sát môi trường cơ bản phân lập và nuôi cấy tế bào gốc Sau khi nuôi cấy mô phân lập được tế bào, có sử dụng môi trường nuôi cấy là DMEM/F12, bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, môi trường này có thực sự tối ưu cho nuôi cấy phân lập hay chưa và đồng thời khảo sát tìm thêm môi trường mới cho quá trình nuôi cấy mô phân lập tế bào và nuôi cấy tăng sinh ở các thí nghiệm tiếp theo. Tiến hành khảo sát nuôi cấy mô phân lập tế bào với các môi trường hay được sử dụng và phối trộn các môi trường với nhau để tìm ra môi trường thích hợp và cố định các thành phần bổ sung như 10% FBS, 1% kháng sinh. Theo dõi, quan sát sau thời gian 3 tuần kết quả môi trường DMEM(h):F12 (1:1) là phù hợp nhất, kết quả được thể hiện thông qua bảng 3.2 và hình 3.8. Trong nghiên cứu này đã khảo sát với các môi trường cơ bản khác nhau và giữ nguyên thành phần bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, kết quả với môi trường DMEM high glucose, tế bào phát triển ra từ miếng mô sau 12 ngày nuôi cấy (hình 3.8-1). Môi trường cơ bản sử dụng DMEM low glucose không thấy xuất tế bào phát triển ra từ miếng mô (hình 3.8-2). Môi trường F12 cũng không thấy có tế bào phát triển ra từ miếng mô (hình 10 3.8-3).. Đối với môi trường DMEM(h):F12 tỷ lệ (1:1), tế bào phát triển ra từ miếng mô sau 6 ngày nuôi cấy (hình 3.8-4). Còn với môi trường DMEM(l):F12 (1:1) tế bào phát triển ra từ miếng mô sau 8-10 ngày nuôi cấy (hình 3.8-5), nhưng so với môi trường DMEM(h):F12 tỷ lệ (1:1) thì muộn hơn, có thể trong môi trường này hàm lượng glucose cao hơn và kết hợp F12 glutamax nên kích thích làm tế bào xuất hiện sớm hơn. Như vậy môi trường DMEM(h):F12 tỷ lệ (1:1) là thích hợp nhất và sử dụng môi trường này dùng cho nuôi cấy, phân lập cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.4. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy mô phân lập tế bào gốc trung mô Để xác định được khoảng thời gian nuôi cấy phân lập tế bào gốc trung mô. Các miếng mô 4 x 5 mm sau phẫu tích được đặt vào các đĩa nuôi cấy có môi trường DMEM/F12 (1:1), bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh để ở điều kiện 37 C và 5% CO2 nuôi cấy với chế độ quan sát 24 giờ 1 lần trong 3 tuần để theo dõi các tế bào phát triển ra từ các miếng mô bám trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Kết quả trên cho thấy sau 2 ngày nuôi cấy mô các mẫu mô bắt đầu bám dính trên bề mặt đĩa nuôi, chưa phát hiện tế bào. Sau 4 ngày nuôi cấy mô đa số các mẫu màng dây rốn bám dính tốt hơn nhưng vẫn chưa thấy tế bào phát triển, tuy nhiên có một vài mảnh màng dây rốn của 1/15 mẫu dây rốn thu thập được có xuất hiện một vài tế bào, nhưng số lượng không nhiều và không đều cho hầu hết các miếng mô khác, có thể trong quá trình thao tác xử lý, phẫu tích màng dây rốn đã giải phóng tế bào ra khỏi cấu trúc mô. Đến ngày thứ 6 một số mẫu mô bám dính có hiện tương co nhỏ lại và bắt đầu xuất hiện các tế bào phát triển ra từ miếng mô, bám dính vào bề mặt đĩa nuôi nhưng chưa có hình dạng hình thoi đặc trưng. Đến ngày thứ 8 một số miếng mô bám dính có hiện tượng teo nhỏ hơn, nhiều miếng mô có tế bào và tế bào bắt đầu phát triển ra từ miếng mô nhiều hơn so với ngày thứ 6. Đến ngày thứ 10 đa số các vị trí các tế bào phát triển, trải rộng trên bề mặt nuôi cấy và có hình dạng đặc trưng là các tế bào hình thoi, kích thước khoảng 20µm, có nhiều nhánh bào tương. Tại các vị trí tương ứng với ngày thứ 6 chưa phát hiện tế bào thì tới thời điểm này các tế bào cũng đã phát triển nhưng với một tốc độ chậm hơn, biểu thị bằng mật độ tế bào thưa hơn. Đặc biệt, ở các vị trí mẫu mô không thay đổi kích thước, không thấy sự có mặt của tế bào. Đến ngày thứ 14, các tế bào phát triển đạt mật độ 60-80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy. Các tế bào hợp dòng và trải đều trên bề mặt đĩa nuôi cấy và tiếp tục tăng sinh. Trong quá trình nuôi cấy có một vài miếng mô xuất hiện tế bào muộn nhất vào ngày thứ 16 và 17, nhưng không đại diện cho tất cả các mẫu dây rốn thu thập về. Kết quả phân lập tế bào gốc trung mô thành công 15/15 mẫu dây rốn, đạt tỷ lệ 100% số mẫu dây rốn thu thập về nghiên cứu đều có tế bào phát triển ra vào ngày thứ 6, phát triển lan ra vào khoảng ngày thứ 10 (mẫu xuất hiện tế bào sớm nhất vào ngày 3 và muộn nhất vào ngày 17). Sau khi nuôi cấy, sau trung bình 10 ngày, các mảnh mô co lại, bám chặt hơn vào bề mặt đĩa nuôi và bắt đầu xuất hiện các tế bào lan ra xung quanh rìa mép của mảnh mô. Số lượng tế bào xung quanh mảnh mô tăng sinh nhanh hơn sau đó tạo nên một tấm tế bào dày. Trên tất cả 15 mẫu mẫu nghiên cứu, quá trình teo nhỏ tiếp tục diễn ra. Các tế bào phát triển đạt mật độ 6080% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy, đây là thời điểm thích hợp để loại bỏ các miếng mô chuyển sang nuôi cấy ở đĩa nuôi cấy mô mới và các tế bào còn lại trong đĩa nuôi cấy tiếp tục được nuôi với môi trường nuôi cấy mới cho 11 đến khi tế bào phát triển phủ kín bề mặt đĩa nuôi cấy. Các mảnh mô được gắp bỏ và tế bào được cấy chuyền để cung cấp thêm môi trường và không gian sống cho tế bào. Như vậy thời gian sau 14 ngày nuôi cấy phân lập có thể cấy chuyển miếng mô để phân lập tiếp tế bào gốc trung mô. 3.1.6. Khảo sát số lần cấy chuyển mô Sau khi đã tối ưu được các điều kiện nuôi cấy phân lập như chọn được thời gian nuôi cấy mô tách màng dây rốn là 4 ngày, môi trường cơ bản để nuôi cấy phân lập là môi trường DMEM : F12 (1:1), thời gian nuôi cấy phân lập đạt mật độ cần thiết cho nghiên cứu và cấy chuyển là 14 ngày. Miếng mô sau 14 ngày nuôi cây phân lập là thời điểm cấy chuyển miếng mô, tuy nhiên miếng nô có còn tế bào phát triển ra nữa hay không và sử dụng được nữa hay không. Trong nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát số lần cấy chuyển mô phân lập tế bào. Các miếng mô sau khi nuôi cấy phân lập tế bào đạt được mật độ khoảng 60-80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy, nhấc miếng mô sang đĩa nuôi cấy mới, tế bào còn lại ở đĩa nuôi cấy cũ tiếp tục cho nuôi cấy tăng sinh cho đến khi tế bào phát triển che kín đĩa nuôi cấy. còn miếng mô sau khi cấy chuyển được nuôi cấy cho đến khi đạt mật độ cần thiết lại tiếp cấy chuyển nuôi cấy phân lập tế bào. Kết quả được thể hiện ở hình 3.8. Hình 3.8: Kết quả hóa mô của các miếng mô nuôi cấy phân lập tế bào gốc trung mô qua các lần cấy chuyển. A: miếng mô phân lập TBG sau thế hệ thứ nhất (P1);B: miếng mô phân lập tế bào sau lần cấy chuyển thứ 5 (P5). Kết quả khảo sát khả năng sử dụng mô phân lập TBG, sau 4-5 lần cấy chuyển mô. Cấy chuyển mô sau 2,3,4 lần hiệu suất vẫn đạt 60-80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy. Sau lần thứ 5 đa số các miếng mô không phân lập được TBG (không còn thấy tế bào phát triển ra từ miếng mô - hình 3.8-B). Như vậy hiệu suất sử dụng miếng mô phân lập là 4 lần. Từ kết quả này cho thấy trong 4 lần cấy chuyển tùy thuộc vào yêu cầu nghiên cứu và các ứng dụng khác cần tế bào có thể cấy chuyển tiếp các miếng mô hoặc có thể bảo quản các miếng mô ở -196oC cho đến khi sử dụng, vừa là nguồn lưu giữ tế bào trong mô, đồng thời tiết kiệm được thời gian, nguyên vật liệu và môi trường khi chưa cần thiết tiếp tục nuôi cấy, phân lập và tăng sinh tế bào.. 3.1.6. Khảo sát thời gian cấy chuyển, nuôi cấy tăng sinh tế bào Các mẫu TBG trung mô màng dây rốn mới được phân lập bằng nuôi cấy mô dây rốn sau 14 ngày tế bào phát triển đạt mật độ 60 - 80% bề mặt nuôi cấy. Các miếng mô được chuyển sang nuôi cấy ở đĩa nuôi cấy mô mới và những tế bào còn lại trong đĩa nuôi cấy tiếp tục nuôi với môi trường nuôi cấy mới cho đến khi tế bào phát triển phủ kín bề mặt đĩa nuôi cấy là tế bào ở thế hệ thứ nhất (passage - P1) được thu hoạch và cấy chuyển ra 12 nhiều đĩa mới hoặc bảo quản đông lạnh. Các tế bào mới phân lập hoặc mới giải đông lạnh sau bảo quản đông lạnh khi mới cấy chuyển hoặc cấy lại, tế bào trôi lơ lửng trong môi trường nuôi cấy, không có hình dạng đặc trưng. Sau 1 ngày, tế bào bám dính trên bề mặt nuôi cấy, có hình dạng đặc trưng và bắt đầu tăng sinh. Đến ngày thứ 4, tế bào đã trải rộng trên bề mặt nuôi cấy. Sau 8 ngày, các tế bào phát triển đạt mật độ 60 - 80% bề mặt đĩa nuôi cấy, tiếp tục cấy chuyển cho tăng sinh và bảo quản để sử dụng cho biệt hóa tế bào và các thí nghiệm tiếp theo. Hình 3.9: Nuôi cấy tăng sinh TBG trung mô (200X). A: tế bào sau khi cấy chuyển; B: tế bào sau 24 giờ cấy chuyển nuôi cấy tăng sinh; C: Tế bào sau 4 ngày cấy chuyển nuôi cấy tăng sinh; D: Tế bào sau 8 ngày cấy chuyển nuôi cấy tăng sinh Kết quả ở hình 3.9 cho thấy: khi vừa được cấy chuyền, TBG trung mô chưa có hình dạng đặc trưng và trôi lơ lửng trong môi trường. Sau 24 giờ nuôi cấy, TBG trung mô bắt đầu bám dính. Sau 4 ngày TBG trung mô đã trải rộng, có dạng hình thoi đặc trưng và tiếp tục tăng sinh. Tuy nhiên, khả năng tăng sinh của tế bào vẫn còn chậm. Sau 8 ngày TBG trung mô hợp dòng và trải đều trên bề mặt đĩa nuôi cấy, tế bào phát triển đạt mật độ 6080% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy. Nuôi cấy duy trì và tăng sinh các TBG là bước khởi đầu của công nghệ TBG. Các kết quả bước đầu mà đề tài đem lại có nghĩa thực tiễn quan trọng trong việc tạo nguồn TBG là nguyên liệu để cung cấp cho những nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo. 3.2. Kiểm định sản phẩm tế bào gốc 3.2.1. Định danh tế bào bằng dấu ấn bề mặt Từ 15 mẫu dây rốn phân lập và nuôi cấy tăng sinh được TBG trung mô, các mẫu tế bào này có phải là TBG hay không. Chính vì vậy cần xác định các marker đặc hiệu cho TBG trung mô. Trong nghiên cứu này đã thực hiện định danh 10 mẫu tế bào bằng kĩ thuật Flow Cytometry phân tích sự biểu hiện một số protein bề mặt của tế bào chuyên biệt cho TBG trung mô. Kết quả được thể hiện ở hình 3.10. 13 Hình 3.10: Kết quả phân tích biểu hiện một số marker bề mặt của tế bào thu nhận được sau khi cấy chuyền 3 lần. Kết quả phân tích biểu hiện marker bề mặt trên 10 mẫu tế bào nuôi ở thế hệ thứ 3 (lần cấy chuyền thứ 3). Với một panel các marker dương tính và âm tính được phân tích, kết quả cho thấy hầu hết các dòng tế bào đều âm tính với các marker CD14, CD34, CD45 và HLA-DR và dương tính với các marker CD13, CD44, CD90 và CD166 (hình 3.10). Theo Ủy ban Tế bào gốc mô và trung mô của Hội Liệu pháp tế bào quốc tế (ISCT), các TBG trung mô biểu hiện các marker bề mặt sau CD90, CD73 và CD105 và âm tính với các marker CD14, CD34, CD45 và HLA-DR. Theo quy định, một marker được cho là âm tính khi được đánh giá bằng kĩ thuật flow cytometry phải có tỉ lệ phần trăm dương tính nhỏ hơn 2% trong tổng số tế bào dương tính. Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy, tế bào thu nhận từ màng dây rốn đều âm tính với các marker theo tiêu chuẩn là CD14, CD34, CD45 và HLADR. Theo quy định, một marker được cho là dương tính khi phân tích bằng kĩ thuật flow cytometry cho tỉ lệ dương tính từ 95% trở lên. Trong 3 marker cần yêu cầu dương tính, nghiên cứu này đã phân tích marker CD90 và cho thấy tỉ lệ dương tính cao hơn 97%. Các marker CD13, CD44 và CD166 tuy không được cho là tiêu chuẩn khẳng định TBG trung mô nhưng gần đây chúng được sử dụng nhiều trong định danh TBG trung mô từ máu dây rốn, Wharton’s jelly, tủy xương. CD13 là một loại Aminopeptidase N (APN) nằm trên màng tế bào và biểu hiện trên rất nhiều dòng tế bào khác nhau ở nhiều mô khác nhau. Tương tự, CD44 và CD166 là hai protein bám dính trên bề mặt tế bào, biểu hiện mạnh trong các dòng tế bào biểu mô (CD44) hay nguyên bào sợi (CD166) giúp tế bào bám dính vào chất nền. Dòng TBG trung mô thu nhận từ quy trình trên dương tính mạnh với CD13 và CD44; và dương tính tương đối yếu với CD166. Như vậy các tế bào phân lập được là tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn. Tuy nhiên cũng cần phải biệt hóa để kiểm tra tính gốc của tế bào. 14 3.2.2. Kiểm tra tính gốc của tế bào gốc trung mô màng dây rốn Để kiểm tra tính gốc của tế bào phân lập được. Tế bào được kiểm định bằng thử nghiệm biệt hoá theo hướng tạo tế bào mỡ. Tế bào sau khi phát triển kín 60-80% diện tích bề mặt nuôi cấy ở lần cấy chuyền thứ 5-7 được nuôi trong môi trường cảm ứng tạo mỡ: DMEM/F12 (1:1) bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, 0,5 µM Dexamethasone, 0,5 µM 3-Isobutyl-1-methylxanthin - IBMX, 50 µM Indomethacin. Kết quả được thể hiện thông qua hình 3.23. Hình 3.11: Kết quả biệt hóa TBG trung mô thành tế bào mỡ A: TBG trung mô trước khi cảm ứng biệt hóa; B: tế bào có các giọt mỡ bên trong nguyên sinh chất với hình dạng tròn và phản xạ ánh sáng; C: các giọt mỡ nhuộm màu với thuốc nhuộm Oil Red màu đỏ Sau 48 giờ nuôi cấy, các tế bào bắt đầu tích tụ các giọt mỡ trong tế bào chất. Các giọt mỡ nhỏ góp lại dần thành các giọt lớn. Đến lượt mình, các giọt mỡ lớn sau đó sẽ góp lại thành giọt mỡ lớn hơn chiếm gần hết thể tích của tế bào và ép nhân tế bào ra phía ngoài, sát với màng. Vì thế, chúng từ dạng dài, trải rộng chuyển sang dạng bầu dục và cuối cùng là hình khối tròn. Các tế bào tạo mỡ với hình dạng khối tròn bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 7 sau khi tiến hành cảm ứng biệt hóa. Sự xuất hiện các giọt mỡ có thể quan sát được dưới kính hiển vi đảo ngược ở độ phóng đại 200 hay 400 lần. Dưới kính hiển vi, các giọt mỡ tròn phản chiếu ánh sang (hình 3.11). Theo Ủy ban Tế bào gốc mô và trung mô của Hội Liệu pháp tế bào quốc tế (ISCT) đã đưa ra các tiêu chuẩn để khẳng định TBG trung mô người. Một là dựa vào đặc điểm hình thái, khả năng bám dính trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Hai là biểu hiện các marker bề mặt chuyên biệt. Thứ ba là có thể biệt hóa thành dòng tế bào tạo xương, sụn, mỡ Như vậy các tế bào nghiên cứu phân lập được từ màng dây rốn đáp ứng được cả ba tiêu chí mà Ủy ban Tế bào gốc mô và trung mô của Hội Liệu pháp tế bào quốc tế đã đưa ra để khẳng định là TBG trung mô người. Như vậy đã phân lập được tế bào gốc trung mô màng dây rốn, các tế bào này được tiếp tục nuôi cấy tăng sinh, bảo quản để sử dụng cho các nghiên cứu biệt hóa tiếp theo và các hướng phát triển ứng dụng cho sau này. 15 3.3. Biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương 3.3.1. Khảo sát môi trường cơ bản để biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương Tế bào cấy chuyển đến passage thứ 4, có khả năng bám dính và tăng sinh trên bề mặt nuôi cấy. Tế bào phát triển đạt 60 - 80% diện tích bề mặt, hút bỏ môi trường cũ, bổ sung môi trường biệt hóa. Môi trường biệt hóa được khảo sát với môi trường cơ bản là nuôi cấy TBG trung mô DMEM-F12 Ham glutamax (1:1), 10% FBS, 1% kháng sinh và bổ sung các chất cảm ứng biệt hóa tế bào: 100 nM dexamethasone, 0,25 mM axít L-ascorbic và 100 mM β-glycerolphosphate, nhằm lựa chọn được môi trường thích hợp cho biệt hóa TBG trung mô thành TBTX. Môi trường TBG trung mô được khảo sát thay đổi các yếu tố, DMEM, F12, 10% FBS, cố định 1% kháng sinh và yếu tố cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo xương: 0,1 µM dexamethasone, 0,25 mM L- axít scorbic và 10 µM β- glycerol-phosphate. Kết quả sau 21 ngày nuôi cấy, đánh giá sự biệt hoá tế bào thông qua khả năng tích tụ của canxi trong bào tương nhờ phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm alizarin red. Tế bào nuôi cấy biệt hóa trong môi trường BH1: có bổ sung yếu tố cảm ứng biệt hóa, sử dụng môi trường cơ bản là DMEM, nhưng không bổ sung FBS; môi trường BH3: bổ sung các yếu tố cảm ứng biệt hóa, sử dụng môi trường cơ bản là DMEM:F12, nhưng không bổ sung FBS, tế bào không bắt mầu với alizarin red, điều này chứng tỏ các tế bào này không có lắng đọng canxi trong tế bào chất. Với các môi trường BH2, BH4, BH5, tế bào bắt đầu chuyển từ dạng dài sang hình dạng đặc trưng của TBTX là dạng tròn và cuối cùng là hình hạt đậu (osteoblast). Khi được cảm ứng biệt hóa, hầu như tất cả tế bào đều ngừng phân chia. Đây cũng là một dấu hiệu cho thấy tế bào gốc đã biệt hóa thành tế bào chức năng. Khi nhuộm với alizarin red, tế bào tròn hay hình hạt đậu bắt màu đỏ cam. Màu đỏ cam là phức hợp của thuốc nhuộm với ion calcium hiện diện trong tế bào chất (tính chất đặc trưng của nguyên bào xương). Tế bào bắt màu với alizarin red ở môi trường BH2 so với tế bào ở môi trường BH4 và BH5 không nhiều. Tế bào ở môi trường BH4, BH5 gần như toàn bộ bắt mầu với alizarin red, tuy nhiên tế bào ở môi trường BH4. Kết quả trên đã chứng tỏ TBG trung mô đã chuyển sang dạng TBTX với hình thành muối canxi trong tế bào chất. 3.2.2 . Khảo sát nồng độ chất cảm ứng biệt hóa TBG trung mô màng dây rốn thành tế bào tạo xương Kết quả sau khi khảo sát thay đổi nồng độ dexamethasone, ß-glycerolphosphate, L- axít ascobic với mỗi một thành phần được khảo sát ở nồng độ khác nhau, thành phần và yếu tố khác được cố định. Sau 21 ngày nuôi cấy biệt hóa tiến hành thu hoạch tế bào và định lượng hàm lượng canxi. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3: Lượng canxi tích lũy trong tế bào cảm ứng biệt hóa bằng các chất cảm ứng khác nhau ở những nồng độ khác nhau Dexamethasone (nM) ĐC 1 10 100 500 1000 Nồng độ can β-GP Nồng độ can L - AsA xi (mM/l) (mM) xi (mM/l) (mM) - Xem thêm -