Tài liệu Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại tre luồng và biện pháp phòng trừ

LIÊN HIỆP CÁC HỘI KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT VIỆT NAM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ SỨC KHOẺ CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI BÁO CÁO TỔNG KẾT THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Tên đề tài: “Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp phòng trừ” CƠ QUAN CHỦ QUẢN: Liên hiệp các hội Khoa học và kỹ thuật Việt Nam CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. Hà Viết Cường 8170 HÀ NỘI, 12/2010 1 LIÊN HIỆP CÁC HỘI KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT VIỆT NAM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ SỨC KHOẺ CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI BÁO CÁO TỔNG KẾT THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Tên đề tài: “Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp phòng trừ” CƠ QUAN CHỦ QUẢN: Liên hiệp các hội Khoa học và kỹ thuật Việt Nam CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. Hà Viết Cường THỜI GIAN THỰC HIỆN: 5/2009 – 11/2010 HÀ NỘI, 12/2010 2 LIÊN HIỆP CÁC HỘI KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT VIỆT NAM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ SỨC KHOẺ CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: “Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp phòng trừ” - Chủ nhiệm: TS. Hà Viết Cường - Cơ quan chủ trì: Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi - Thời gian thực hiện: 5/2009 – 12/2010 2. Mục tiêu: Đề tài nhằm xác định tác nhân gây bệnh giống bị nhiễm Phytoplasma trên tre luồng và đề xuất biện pháp kiểm soát bệnh. 3. Kết quả nghiên cứu: - Các kết quả PCR và giải trình tự chứng tỏ rằng các mẫu biểu hiện triệu chứng giống phytoplasma trên cây họ tre trúc thu thập một số tỉnh (Thanh Hoá, Hoà Bình, Phú Thọ, Yên Bái, Lào Cai, Hưng Yên) không bị nhiễm Phytoplasma. - Đã phát hiện được 7 bệnh giống bị nhiễm phytoplasma trên các cây họ tre nứa miền Bắc. Các bệnh này bao gồm: chổi sể (tre, luồng, bương), sọc tím luồng, lá nhỏ luồng, lá nhỏ tre, cựa gà (luồng), chổi phù thủy tre cảnh, và chổi phù thủy trúc. Bệnh sọc tím luồng là bệnh có ý nghĩa kinh tế nhất nhưng chỉ giới 3 hạn tại 1 số huyện thuộc tỉnh Thanh Hóa. Bệnh chổi sể và cựa gà phổ biến tại tất cả các điểm điều tra thuộc trung du miền núi (Thanh Hóa, Lào Cai, Phú Thọ, Hòa Bình). Các bệnh còn lại hiếm gặp. - Đã thu thập, xử lý và số liệu hóa khoảng 200 mẫu bệnh giống bị nhiễm phytoplasma trên cây họ tre nứa tại 6 tỉnh miền Bắc và 150 cá thể rầy tại khu vực bị nhiễm bệnh luồng sọc tím tại Thanh Hóa. - Bệnh sọc tím ảnh hưởng rất mạnh đến sinh trưởng, phát triển cây luồng. Kết quả đo đếm cho thấy thời kỳ măng, mức độ ảnh hưởng là cao nhất với đường kính giảm tới 47,1% và chiều dài lóng giảm tới 31,1%. Mức độ ảnh hưởng giảm dần theo độ lớn tuổi cây luồng. - Đã lần đầu tiên phát hiện được 2 loài rầy sống trên luồng ở Việt Nam. Hai loài này đã được đặt tên tạm thời là rầy nâu vằn và rầy trắng. Nhờ sự giúp đỡ của TS. Xiang-Sheng Chen (Đại học Guizhou), loài rầy trắng đã được xác định là Purohita taiwanensis, còn rầy nâu vằn là một loài mới hoàn toàn, thuộc môt chi chưa xác định. Rầy nâu vằn chỉ cư trú trên măng, thường thấy ở chỗ mọng nước, ẩm ướt như bẹ măng, tai măng, có thể ở gốc măng sát đất. Rầy có thể đạt mật độ 33 - 35 con/măng. Không phát hiện thấy rầy trên cây trưởng thành và các cây cỏ dại xung quanh. - Đã tham khảo 6 mồi và thiết kế 5 mồi chung (universal primer) để nghiên cứu chẩn đoán bệnh phytoplasma. Đã sử dụng kỹ thuật PCR với nhiều tổ hợp mồi khác nhau, nhiều điều kiện phản ứng khác nhau và 3 loại PCR khác nhau (PCR thường, PCR lồng và Touch-Down PCR) để phát hiện phytoplasma trên mẫu cây bệnh và rầy. Kết quả nghiên cứu đã không phát hiện được phytoplasma trên cây bệnh cũng như trên rầy. - Đã lần đầu tiên phát hiện và xác định được ở cả mức hình thái và phân tử nấm Heteroepichloe bambusae gây bệnh cựa gà trên cây luồng Thanh Hóa. - Qua nghiên cứu giải trình tự đã phát hiện được một loạt các vi khuẩn và nấm liên quan đên rầy và cây. Trong số này, có nhóm sống nội sinh, có nhóm là tác nhân gây bệnh cây tiềm tàng và có nhóm có thể ứng dụng trong phòng chống 4 sinh học hoặc sử dụng để tạo các chế phẩm trong y học. Các vi khuẩn và nấm phát hiện được bao gồm: a. Hai vi khuẩn là Wolbachia spp. và Arsenophonus sp. từ rầy nâu vằn. Đây là các vi khuẩn sống nội sinh trong côn trùng. b. Bảy vi khuẩn là Pantoea ananatis, Rheinheimera sp., Enterobacter sp., Luteibacter, Xanthomonas albilineans, một vi khuẩn chưa định danh và Acinetobacter từ cây bị bệnh. Trong số này, đáng chú ý nhất là X. albilineans phát hiện từ cây luồng bị bệnh sọc tím. X. albilineans là một vi khuẩn ký sinh thực vật quan trọng, đặc biệt trên cây 1 lá mầm, thuộc nhóm vi khuẩn biệt dưỡng (không thể nuôi cấy trên môi trường thông thường), thuộc nhóm giới hạn mạch xylem, lan truyền nhờ rầy. Đây có lẽ là một tác nhân cần chú ý khi nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh sọc tím trong tương lai. c. Bảy nấm túi là Shiraia sp., Fusarium sp., F. equiseti, Microdochium sp., Xylaria feejeensis, một nấm thuộc họ Magnaporthaceae và một nấm thuộc bộ Pleosporales từ cây bệnh. Tất cả các loài nấm này không cảm ứng mất cân bằng hormone trong cây tới mức làm biến đổi hình thái cây giống như nhiễm Phytoplasma. Kết quả này, cùng với công bố của Morakotkarn et al. (2007), chứng tỏ quần thể nấm nội sinh trên cây họ tre nứa cực kỳ đa dạng. Trong số các nấm nội sinh phát hiện được trên cây luồng, nấm Shiraia sp. có thể được thử nghiệm để sản xuất Hypocrellin A, một chất rất cần trong y học làm thuốc chống ung thư. - Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo đã chứng tỏ bệnh sọc tím không truyền qua tiếp xúc cơ học. Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo với 2 nấm và 2 vi khuẩn (một vi khuẩn chưa định danh và Acinetobacter ) phân lập được từ vết bệnh sọc tím đã không tạo triệu chứng điển hình. - Chế phẩm EXIN-R không có tác dụng làm giảm tác hại của bệnh sọc tím trên cây luồng. 4. Sản phẩm: 5 - Đào tạo: 01 Sinh viên - Bài báo: 01 bài báo - Vật liệu: 194 mẫu bệnh và 50 mẫu rầy 5. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng Hà Nội, Ngày 2 tháng 12 năm 2010 Cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài (ký, họ và tên, đóng dấu) (ký, họ và tên) Đã ký Đã ký 6 LIÊN HIỆP CÁC HỘI KH & KT VIỆT NAM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ SỨC KHOẺ CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI Độc lập - Tự do - Hạnh phúc __________________ Hà Nội, ngày 2 tháng 12 năm 2010 DANH SÁCH TÁC GIẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ (Danh sách những cá nhân đã đóng góp sáng tạo chủ yếu cho đề tài, dự án được sắp xếp theo thứ tự đã thoả thuận) 1. Tên đề tài, dự án: : "Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp phòng trừ” 2. Thời gian thực hiện (Bắt đầu - Kết thúc): 5/2009 – 12/2010 3. Tổ chức chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi 4. Cơ quan chủ quản: Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật Việt Nam 5. Tác giả thực hiện đề tài/dự án trên gồm những người có tên trong danh sách sau (ghi không quá 10 người kể cả chủ nhiệm đề tài/dự án): Số TT Chức danh khoa học, học Tổ chức công tác vị, họ và tên 1 TS. Hà Viết Cường Bộ môn Bệnh cây – ĐH NNHN 2 Th.S. Trần Thị Như Hoa Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi 3 Th.S. Nguyễn Thị Ngọc Lan Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi 4 Th.S. Hà Giang Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi 7 5 Th.S. Ngô Thị Việt Hà Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi 6 KS. Ngô Hải Anh Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi 7 KS. Lê Văn Hải Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật nuôi 8 KS. Mai Thị Hiếu Hợp tác xã Phát triển nông thôn Quan Hoá – Thanh Hoá 9 KS. Chu Văn Sáu Hợp tác xã Phát triển nông thôn Quan Hoá – Thanh Hoá Chủ nhiệm đề tài/dự án Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ, tên và chữ ký) đề tài/dự án (Họ, tên, chữ ký và đóng dấu) Đã ký Đã ký 8 Môc lôc PHẦN I: MỞ ĐẦU ...............................................................................................1 1. Đặt vấn đề..........................................................................................................1 2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................3 3. Nội dung nghiên cứu chính ...............................................................................3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................4 2.1. Lịch sử nghiên cứu Phytoplasma ...................................................................4 2.2. Hình thái Phytoplasma ...................................................................................5 2.3. Tầm quan trọng của Phytoplasma ..................................................................5 2.4. Phân loại Phytoplasma ...................................................................................6 2.5. Hình thái của Phytoplasma.............................................................................8 2.6. Triệu chứng bệnh do phytoplasma .................................................................8 2.7. Lan truyền.......................................................................................................9 2.8. Chẩn đoán.......................................................................................................9 2.9. Phòng chống .................................................................................................10 2.10. Nghiên cứu bệnh Phytoplasma trên cây họ tre nứa ...................................10 2.12. Nghiên cứu bệnh Phytoplasma ở Việt Nam...............................................12 2-13. Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh sọc tím luồng.....................................12 PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................14 3.1 Phương pháp điều tra xác định mức độ nhiễm bệnh....................................14 3.2 Phương pháp thu mẫu bệnh hại....................................................................14 3.3 Phương pháp phân lập mẫu (Doungporn Morakotkarn, 2006).....................14 3.4 Phương pháp chiết DNA ..............................................................................15 3.5 Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) xác định Phytoplasma, vi khuẩn ...................................................................................................................16 3.6 Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) xác định nấm. ................18 3.7 Chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm PCR. ...........................19 3.8 Nhân dòng sản phẩm PCR trong vi khuẩn E.coli .......................................20 3.9 Giải trình tự DNA.........................................................................................20 9 3.10 Phân tích trình tự ........................................................................................20 3.11 Phương pháp lây bệnh nhân tạo .................................................................20 3.12 Thí nghiệm phòng trừ..................................................................................20 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................22 CHƯƠNG 1. ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH BỆNH, ĐIỀU TRA, THU THẬP MẪU BỆNH CÁC BỆNH GIỐNG BỊ NHIỄM PHYTOPLASMA .............................23 4 Triệu chứng các bệnh giống như nhiễm Phytoplasma .....................................23 4.2 THU THẬP MẪU BỆNH .............................................................................30 4.3 MỨC ĐỘ PHỔ BIẾN CỦA CÁC BỆNH.....................................................31 4.3.1 Bệnh lá nhỏ tre, chổi phù thủy tre cảnh và trúc quân tử ............................31 4.3.2 Bệnh lá nhỏ hại luồng.................................................................................32 4.3.3 Bệnh chổi sể và sọc tím..............................................................................32 4.4 ĐÁNH GIÁ TÁC HẠI CỦA BỆNH SỌC TÍM .............................................34 4.4.1 Sự phát triển của bệnh sọc tím theo thời kỳ sinh trưởng của cây ..............34 4.4.2 Ảnh hưởng bệnh sọc tím đến kích thước thân cây luồng...........................35 CHƯƠNG 2. XÁC ĐỊNH NGUYÊN NHÂN PHYTOPLASMA......................38 4.5 ĐIỀU TRA VECTOR TRUYỀN BỆNH.......................................................38 4.5.1 Xác định vector truyền bệnh ......................................................................38 4.5.2 Điều tra vị trí cư trú của rầy nâu vằn .........................................................39 4.6 PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH .......................40 4.6.1 Chọn lọc và thiết kế các cặp mồi chẩn đoán phytoplasma. .......................40 4.6.2 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U3/U5..............................................44 4.6.3 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR (U3/U5) .............................46 4.6.4 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi P1/P7 (kết hợp với Nested – PCR) .49 4.6.5 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN01119 / SN910601 .....................52 4.6.6 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN910601/P7 ..................................54 4.6.7 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U5/Phy1R.........................................58 4.6.8 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer1R và cặp mồi Phy1F/Phy1R.......................................................................................................59 10 4.6.9 Kiểm tra PCR với cặp mồi Phy1F/Spacer2R và Phy1F/Spacer3R............64 4.6.10 Dòng hóa và giải trình tự..........................................................................73 4.6.11 Thảo luận kết quả phát hiện Phytoplasma ...............................................78 CHƯƠNG 3. XÁC ĐỊNH NẤM liên quan đẾN BỆNH.....................................80 4.7 PHÂN LÂP NẤM .........................................................................................80 4.7.1 Bệnh sọc tím luồng.....................................................................................80 4.7.2 Bệnh chổi sể ...............................................................................................82 4.7.3 Bệnh cựa gà ................................................................................................85 4.8 XÁC ĐỊNH NẤM BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG RNA RIBOSOME ......87 4.8.1 Lựa chọn mồi và vùng gien nghiên cứu.....................................................87 4.8.2 Phản ứng PCR ............................................................................................87 4.8.3 Nhân dòng sản phẩm PCR các mẫu nấm trong vi khuẩn E.coli ...............90 4.8.4 Giải trình tự mẫu nấm được nhân bởi cặp mồi ITS4/ITS5 ........................91 4.8.5 Thảo luận kết quả phát hiện và xác định nấm............................................94 CHƯƠNG 4. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH SỌC TÍM .99 4.9 PHÂN LẬP VI KHUẨN ...............................................................................99 4.10 XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG MÃ HÓA RNA RIBOSOME ......................................................................................................100 4.10.1 PCR và dòng hóa....................................................................................100 4.10.2 Giải trình tự ............................................................................................100 CHƯƠNG 5. LÂY NHIỄM NHÂN TẠO VÀ THÍ NGHIỆM PHÒNG TRỪ BỆNH SỌC TÍM ...............................................................................................103 4.11 LÂY NHIỄM NHÂN TẠO.......................................................................103 4.12 THÍ NGHIỆM PHÒNG TRỪ ...................................................................104 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................107 5.1. Kết luận ......................................................................................................107 5.2. Đề nghị .......................................................................................................109 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................110 11 Danh mục chữ viết tắt bp: Base pair DNA: Deoxyribonucleic acid E.coli Escherichia coli ha Hec ta PCR Polymerase RNA Rebonucleic acid Ta Nhiệt độ gắn mồi 12 DANH MôC H×nh Hình 2-2. Bệnh chổi phù thủy do phytoplasma trên cây trúc đen tại Hàn Quốc (Jung et al., 2006)................................................................................................11 Hình 1-1 Bệnh chổi sể trên luồng (2 ảnh hàng trên, Thanh Hóa, 2009), trên bương (ảnh góc trái hàng dưới, Lào Cai, 2010) và trên tre (ảnh góc phải hàng dưới, Lào Cai, 2010) ...........................................................................................25 Hình 1-2. Bệnh sọc tím trên luồng tại Thanh Hóa (2009). A) Sọc tím trên thân, B) Măng bất thường phát triển thành các cây rất nhỏ, C) Các măng bất thường hình thành nhiều trên đốt thân; D) Các cành tăm mọc từ đốt thân. ....................26 Hình 1-3. Bệnh lá nhỏ trên luồng Thanh Hóa (2009) .........................................27 Hình 1-4 Bệnh chổi sể (cựa gà) trên luồng Thanh Hóa (2009)...........................28 Hình 1-5 Bệnh lá nhỏ trên tre Thanh Hóa (2009) ..............................................28 Hình 1-6 Bệnh chổi phù thủy tre cảnh tại Hà Nội – Lá bệnh và lá khỏe...........29 Hình 1-7 Bệnh chổi phù thủy trên trúc quân tử (Hưng Yên, 2009)...................29 Hình 1-8. Điều tra thu thập mẫu cây bệnh và rầy tại Thanh Hóa, Phú Thọ (2009, 20010)..................................................................................................................30 Hình 1-9 Ảnh hưởng của bệnh sọc tím đến kích thước luồng ............................35 Hình 2-1 Rầy nâu vằn (hàng trên) và rầy trắng (hàng dưới) phát hiện trên luồng tại Ngọc Lặc – Thanh Hóa .................................................................................39 Hình 2-2 Sơ đồ cụm gen rDNA của Phytoplasma, vị trí tương đối của các mồi và ước lượng kích thước các sản phẩm PCR ......................................................43 Hình 2-3 PCR lần thứ 5 (với cặp mồi U3/U5) trên mẫu tre, luồng. M = Thang DNA (GeneRuler 1 kb, Fermentas). 8: Tre cảnh (P-20): chổi phù thủy, Đông Anh (Hà Nội); 9: Luồng (P-28): lá nhỏ, Phù Đổng, Gia Lâm (Hà Nội); 11: Luồng (L5): Sọc tím, Ngọc Lặc (Thanh Hóa) ....................................................45 Hình 2-4. Kiểm tra PCR lần 6 (với cặp mồi U3/U5). M: Thang DNA (GeneRuler 1 kb DNA, Fermentas). Thứ tự các mẫu trình bày trong bảng 2.4 .45 13 Hình 2-5. Điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi U3 và U5 nhằm tạo đủ lượng DNA cho giải trình tự. M: Thang DNA (GeneRuler 1 kb DNA, Fermentas), 1: Luồng (P-28); 2: Tre cảnh (P-20), 3: Luồng (L5), 4: Luồng (L4) ......................46 Hình 2-6 Ước lượng sản phẩm PCR tinh chiết (U3/U5) bằng điện di agarose. M là thang DNA, trong đó M1, M2 và M3 tương ứng với lượng dùng 1 µL, 0.5 µL và 0. 25 µL. Các mẫu đều được chạy với lượng 2 µL theo thứ tự sau: 1: Luồng lá nhỏ (P-28), 2: Tre cảnh chổi phù thủy (P-20), 3: Luồng sọc tím (L5).46 Hình 2-7. Đồ thị trình tự nucleotide của 3 mẫu PCR được giải trình tự bằng mồi U5 (Lần 1). ..........................................................................................................48 Hình 2-8 Sơ đồ cụm gen DNA ribosome (rDNA) của Phytoplasma và vị trí tương đối của mồi cũng như sản phẩm PCR trong Nested-PCR dùng 2 cặp mồi P1/P7 và U3/U5...................................................................................................49 Hình 2-9 PCR với cặp mồi P1/P7 ở nồng độ MgCl2 = 1,5µL/25µL (150 µM). M là Thang DNA (GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Fermentas). 1: Luồng lá nhỏ (P-28), 2: Tre cảnh chổi sể (P-20), 3: Luồng sọc tím (L6). Băng có sản phẩm với kíc thước mong muốn ~ 1.8 kb được chỉ bằng mũi tên ......................................52 Hình 2-10 Kết quả điện di PCR lần 1 bằng cặp mồi SN01119 / SN910601. Sản phẩm mong đợi ~ 1,8 kb. M = Thang DNA (GeneRuler 1kb, Fermentas). Số thứ tự các giêng tương ứng theo thứ tự các mẫu trong bảng 2-8. ...........................54 Hình 2-11 Kết quả kiểm tra PCR lần 1 với cặp mồi SN910601 / P7. M là thang DNA (1 kb, Fermentas. Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 2-9) . 57 Hình 2-12 Kết quả kiểm tra PCR lần 3 với cặp mồi SN910601 / P7. M là thang DNA (1 kb, Fermentas. Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 2-9) . 57 Hình 2-13 Kết quả kiểm tra PCR lần 1 với cặp mồi U5/Phy1R. M là thang DNA (1 kb, Fermentas. Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 2-10........... 59 Hình 2-14 Kết quả PCR bằng cặp mồi Phy1F/ Spacer1R và cặp mồi................60 Phy1F/Phy1R trên mẫu cây.................................................................................60 Hình 2-15 PCR bằng cặp mồi Phy1F/Phy1R trên mẫu rầy. Chỉ minh họa 8 trong 38 mẫu rầy thí nghiệm. Từ 1-3 và 6-14 là rầy nâu vằn. Từ 4-5 là rầy trắng ......61 14 Hình 2-16 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR với cặp mồi Phy1F/Phy1R đối với mẫu luồng sọc tím, rầy nâu vằn và rầy trắng (Chỉ 1 phần đồ thị trình tự được minh họa)....................................................................................................63 Hình 2-17 Kết quả PCR thường bằng cặp mồi Phy1F/ Spacer2R và cặp mồi Phy1F/Spacer3R. M là thang DNA (1 kb, Fermentas). Số thứ tự của các cột tương tự như ở bảng 2-14. Mũi tên trên và dưới lần lượt chỉ sản phẩm 1.67 kb và 1.53 kb .................................................................................................................65 Hình 2-18 Kết quả TouchDown-PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer3R. M là thang DNA (1 kb, Fermentas). Băng sản phẩm mong muốn được chỉ bằng mũi tên. Số thứ tự của các mẫu tương tự như ở bảng 2-14 ........................................66 Hình 2-19 Kết quả PCR bằng cặp mồi Phy1F/Space2R và TrueStart Taq DNA Polymerase (Fermentas). Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi là 54 0C và lượng MgCl2 (25 mM) là 1.5 µL/ 25 µL). Kích thước sản phẩm PCR mong muốn là 1.67 kb và được chỉ rõ bằng mũi tên. M là thang DNA (GeneRuler 1 kb, Fermentas). Số thứ tự của các cột tương tự như ở bảng 2-15 (mẫu số 14 được kiểm tra trên 1 bản gel khác cho phản ứng âm). ........................................68 Hình 2-20 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR với cặp mồi Phy1F/Spacer2R (Chỉ 1 phần đồ thị trình tự được minh họa) ............................72 Hình 2-21 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR được dòng hóa(Chỉ 1 phần đồ thị trình tự được minh họa) ............................................................................78 Hình 3-1 Đặc điểm tản nấm phân lập từ mẫu sọc tím trên môi trường T2. (A. Tản nấm trắng, mọc thưa; B. Tản nấm màu nâu nhạt, gợn sóng, sợi mọc dẹt, tản nấm nổi)...............................................................................................................81 Hình 3-2 Triệu chứng và dấu hiệu của bệnh “chổi phù thủy” trên cây tre tại Nhật Bản do nấm A. take gây ra (Tanaka, 2009). DS (deseased shoots): các chồi bệnh; AS (ascostroma): tử tọa và CS (conidiomata): khối sinh bào tử. .............82 Hình 3-3 Đặc điểm tản nấm phân lập được từ mẫu bệnh chổi sể nuôi cấy trên môi trường T2.( thứ tự mẫu theo bảng 3-3) ........................................................84 Hình 3-4 Mẫu nấm số 5 hình thành quả thể dạng gạc hươu. ..............................84 15 Hình3-5 Bệnh cựa gà trên luồng Thanh Hóa (trái) và bệnh “chổi phù thủy” trên tre do nấm Heteroepichloë gây ra tại Nhật Bản (phải) (Tanaka et al., 2002) ...85 Hình 3-6 So sánh đặc điểm nấm cựa gà trên luồng Thanh Hóa (cột trái) và nấm Heteroepichloë (cột phải, theo Tanaka et al., 2002). Hai ảnh hàng trên cùng là hình dạng và cách xắp xếp của quả thể (perithecium) trên tử tọa. Hai ảnh hàng giữa là một phần của túi. Hai ảnh hàng dưới cùng là bào tử túi (chú ý vẫn còn 1 túi ở nấm Heteroepichloë)...................................................................................86 Hình 3-7 Tổ chức vùng rDNA của nấm và vị trí tương đối của cặp mồi ITS4 và ITS5 .....................................................................................................................87 Hình 3-8 Minh họa kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên mẫu nấm thuần phân lập từ bệnh chổi sể và sọc tím. M là thang DNA 1 kb (Fermentas). Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 3-4. Sản phẩm PCR (~ 0.6 kb) được chỉ bằng mũi tên. ................................................................................................89 Hình 3-9 Minh họa kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên các mẫu cựa gà. M là thang DNA 100bp (Fermentas). Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 3-5. Kích thước sản phẩm PCR ~ 0.6 kb được chỉ bằng mũi tên..........89 Hình 3-10. Kết quả biến nạp 6 mẫu nấm vào vi khuẩn XL1-blue (không thể hiện đĩa đối chứng và đĩa cựa gà 6) ............................................................................90 Hình 3-11 Minh họa kiểm tra PCR khuẩn lạc vi khuẩn tái tổ hợp. Băng PCR dương (~0.6 kb) được chỉ bằng mũi tên..............................................................91 Hình 3-12 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR các mẫu nấm (mồi ITS4/ITS5) (chỉ minh họa 1 phần đồ thị trình tự của các phản ứng giải trình tự) ......................... 98 Hình 4-1 Phân lập vi khuẩn từ vết bệnh sọc tím .................................................99 Hình 4-2 PCR nhân gen mã hóa RNA ribosome của 2 mẫu vi khuẩn ST4 và ST5 bằng cặp mồi Phy1F/Phy1R. M là thang DNA 1 kb (Fermentas). Băng sản phẩm PCR (~ 1 kb) được chỉ bằng mũi tên.................................................................100 Hình 4-3 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR 2 mẫu vi khuẩn (mồi Phy1F/Phy1R) và minh họa 1 phần đồ thị trình tự của các phản ứng giải trình tự có chất lượng tốt................................................................................................102 16 Hình 5-1 Thử nghiệm phun thuốc EXIN-R phòng trừ bệnh sọc tím luồng tại đồi Phòng Không – Kiên Thọ - Ngọc Lặc – Thanh Hóa. .......................................106 17 DANH MôC B¶NG Bảng 2.1. Các nhóm phả hệ của Phytoplasma ......................................................7 Bảng 1-1 . Các bệnh giống bị nhiễm phytoplasma trên cây họ tre trúc..............23 Bảng 2-3. Kiểm tra PCR dùng cặp mồi U3/U5 (5 lần thử đầu tiên)...................44 Bảng2-4 Kiểm tra PCR dùng cặp mồi U3/U5 (lần 6) ........................................45 Bảng 2-5 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR (cặp mồi U3/U5)........48 Bảng 2-6 PCR ở các ngưỡng nhiệt độ gắn mồi khác nhau .................................50 Bảng 2-7 PCR với cặp mồi P1/P7 ở các nồng độ MgCl2 khác nhau ................51 Bảng 2-8 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN01119 / SN910601 ..............53 Bảng 2-9 Kết quả kiểm tra PCR với cặp mồi SN910601/P7 ..............................56 Bảng 2-10 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U5/Phy1R ...............................58 Bảng 2-11 Kiểm tra PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer1R và cặp mồi Phy1F/Phy1R trên mẫu cây.................................................................................60 Bảng 2-12 Kiểm tra PCR trên mẫu rầy bằng cặp mồi Phy1F/Phy1R.................61 Bảng 2-13 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR nhân bằng cặp mồi Phy1F/Phy1R.......................................................................................................62 Bảng 2-14 PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer2R và Phy1F/Spacer3R................65 Bảng 2-15 Kết quả kiểm tra PCR dùng cặp mồi Phy1F/Spacer2R và TrueStart Taq DNA Polymerase (Fermentas) .....................................................................67 Bảng 2-16 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR nhân bằng cặp mồi Phy1F/Spacer2R..................................................................................................71 Bảng 2-17 Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) bằng BamHI và E.coRI.......75 Bảng 2-18 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR được dòng hóa.........................77 Bảng 3-1. Phân lập mẫu bệnh sọc tím luồng ở tỉnh Thanh Hóa .........................81 Bảng 3-2 Phân lập mẫu chổi sể trên cây luồng ...................................................83 Bảng3-3 Đặc điểm tản nấm phân lập được từ mẫu bệnh chổi sể nuôi cấy trên môi trường T2......................................................................................................83 Bảng 3-4 Kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên mẫu nấm nuôi cấy thuần .. 88 18 Bảng 3-5 Kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên các mẫu cựa gà trên nấm cựa gà...................................................................................................................89 Bảng 3-6 Kết quả giải trình tự mẫu nấm và tìm kiếm chuỗi tương đồng trên Ngân Hàng Gen ...................................................................................................96 Bảng 4-1Kết quả giải trình tự mẫu nấm và tìm kiếm chuỗi tương đồng trên Ngân Hàng Gen...........................................................................................................101 Bảng 5-1 Ảnh hưởng của thuốc EXIN-R đến sinh trưởng cây măng bệnh ......106 19 PHẦN I: MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là một trong các quốc gia có diện tích cây họ tre nứa lớn và mức độ đa dạng cao. Cây họ tre nứa thuộc họ hòa thảo (Poaceae). Theo thống kê, có khoảng 1250 loài thuộc 75 chi trên toàn thế giới. Việt Nam ước tính có 216 loài thuộc 25 chi (Nguyễn Hoàng Hộ, 2005). Tổng diện tích cây họ tre nứa năm 2004 khoảng 1,6 triệu ha, trong đó 800,000 ha rừng tự nhiên thuần loài, 700.000 ha rừng tự nhiên hỗn loài và 100.000 ha rừng trồng (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2007). Ở Việt Nam, ngoài ý nghĩa văn hóa, nhiều loài cây họ tre nứa còn có giá trị kinh tế lớn như tre, nứa, bương và đặc biệt là luồng. Cây luồng (Dendrocalamus membranaceous) được trồng để lấy măng, nguyên liệu cho xây dựng, sản xuất đồ mỹ nghệ và chế biến giấy. Cây luồng được trồng ở nhiều nơi nhưng đặc biệt nhiều tại tỉnh Thanh Hóa. Tại tỉnh này, luồng là 1 trong những cây lâm nghiệp chiến lược, cây xóa đói giảm nghèo. Năm 2006, diện tích luồng của tỉnh lên tới 69,000 ha , tập trung tại 3 huyện Quan Hóa, Lang Chánh và Ngọc Lặc. Hiện nay, cây luồng bị một số bệnh tấn công trong đó đặc biệt nghiêm trọng là các bệnh sọc tím. Ngoài ra, một số bệnh khác cũng công bố thấy trên luồng tại Thanh Hóa là bệnh chổi xể (chổi phù thủy) và bệnh lá nhỏ. Bệnh sọc tím mới xuất hiện vài năm tại các khu vực trồng luồng tại Thanh Hóa nhưng ảnh hưởng đáng kể đến năng suất, chất lượng luồng. Đối với bệnh sọc tím, các triệu chứng chính của bệnh là măng mọc nhiều từ gốc cây con (trên một tuổi) và mọc thành chùm trên đốt cây trưởng thành cách mặt đất 1-2 m và ngừng sinh trưởng khi đạt chiều cao khoảng 20-30cm; cây măng mọc từ đất có thể đạt 5-6 m nhưng đường kính giảm mạnh. Đặc biệt trên thân măng có các sọc tím chạy từ các đốt phía dưới lên trên. Cây bị bệnh khoảng 2-3 năm rất còi cọc. Trên cây bệnh, lá mọc ít và nhỏ. 20