Tài liệu Nghiên cứu bảo tồn vốn gen cây ngưu tất (achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÓ THỊ THUÝ HẰNG NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÓ THỊ THUÝ HẰNG NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ TÂM Thái Nguyên, 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin trân thành cảm ơn Th.S. Vũ Anh Tuấn, KTV Lƣơng Thị Hồng Vân - bộ môn Hoá hữu cơ - Khoa Hoá học trƣờng Đại học Sƣ phạm đã tận tình hƣớng dẫn tôi thực hiện một số thí nghiệm trong luận văn. Tôi xin cảm ơn KTV Đào Thu Thuỷ (PTN Công nghệ Tế bào thực vật), KTV Trần Thị Hồng (PTN Di truyền học), đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành các thí nghiệm. Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh KTNN, Khoa Hoá học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Tác giả Phó Thị Thuý Hằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả Phó Thị Thúy Hằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU................................................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề......................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu......................................................................... 3 3. Nội dung nghiên cứu........................................................................ 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 4 1.1. Giới thiệu chung về cây Ngưu tất............................................... 4 1.1.1. Đặc điểm phân loại..................................................................... 4 1.1.2. Một số đặc điểm nông sinh học của cây Ngƣu tất...................... 4 1.1.3. Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch.... 5 1.2.Tình hình sản xuất Ngưu tất trên thế giới và ở Việt Nam........ 6 1.3. Ứng dụng cây Ngưu tất trong y học........................................... 8 1.3.1. Cơ sở hoá học tính chữa bệnh của cây Ngƣu tất........................ 8 1.3.2. Một số nghiên cứu ứng dụng cây Ngƣu tất trong y học............. 10 1.4. Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực trong công tác nhân giống cây trồng........................................................... 12 1.4.1. Ƣu thế của nhân giống in vitro................................................... 12 1.4.2. Các phƣơng thức nhân giống in vitro......................................... 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.4.3. Một số thành tựu trong nhân giống cây trồng bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro.................................................................................... 15 1.5. Ứng dụng kĩ thuật PCR - RAPD trong phân tích sự đa dạng di truyền.............................................................................................. 19 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............ 23 2.1. Vật liệu……………………………….......................................... 23 2.1.1. Vật liệu thực vật.................................................................... 23 2.1.2. `Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu................................. 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................ 24 2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro......................................... 24 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu hợp chất saponin trong rễ cây Ngƣu tất.......................................................................................................... 28 2.2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử................................................... 29 2.2.4. Phƣơng pháp xử lí và tính toán số liệu ...................................... 33 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 34 3.1. Nghiên cứu nhân giống cây Ngƣu tất và trồng thử nghiệm ngoài đồng ruộng............................................................................................ 34 3.1.1. Nghiên cứu khử trùng hạt........................................................... 34 3.1.2. Ảnh hƣởng riêng rẽ của chất KTST đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Ngƣu tất trong ống nghiệm............................ 36 3.1.3. Ảnh hƣởng của α-NAA tới sự tạo rễ của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm........................................................................................... 42 3.1.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi và sự sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm............................. 44 3.1.5. Kết quả đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên..................................... 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2. Hàm lƣợng saponin tổng số trong rễ cây Ngƣu tất in vitro trồng ngoài đồng ruộng và cây trồng bằng hạt................................... 51 3.3. Sử dụng kĩ thuật RAPD đánh giá hệ gen cây Ngƣu tất in vitro và cây trồng bằng hạt................................................................................ 53 3.3.1.Kết quả tách chiết ADN tổng số 53 3.3.2. Kết quả phản ứng RAPD 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................... 60 PHỤ LỤC............................................................................................. 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ĐC: Đối chứng HS: Hệ số IBA: Axit 3-indolebutiric KLK: Khối lƣợng khô KTST: Kích thích sinh trƣởng PCR: Polimease Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polimease) TĐST: Tốc độ sinh trƣởng TN: Thí nghiệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG trang Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trƣờng MS........................... 23 Bảng 2.2. Trình tự nucleotit của 5 đoạn mồi ngẫu nhiên…………... 32 Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Ngƣu tất.......................................... 34 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm …………………… 38 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến tốc độ sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm ………………………... 40 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến hình thành rễ của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm (sau 30 ngày)................................................... 42 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm............................................ 44 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm………………………………… 46 Bảng 3.7. Kết quả đƣa cây Ngƣu tất ra môi trƣờng tự nhiên............ 49 Bảng 3.8. Theo dõi một số chỉ tiêu sau 30 ngày đƣa cây ra vƣờn ƣơm… 50 Bảng 3.9. Một số chỉ tiêu theo dõi rễ cây in vitro và rễ cây trồng bằng hạt khi thu hoạch........................................................................ 50 Bảng 3.10. Hàm lƣợng hợp chất saponin trong rễ cây in vitro và cây trồng bằng hạt............................................................................... 52 Bảng 3.11. Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện của 5 mẫu ngƣu tất khi phân tích với 5 mồi ngẫu nhiên………………………………… 55 Bảng 3.12. Số phân đoạn ADN đa hình thu đƣợc từ 5 mẫu Ngƣu tất với tƣờng mồi nghiên cứu……………………………………….. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1. Biểu đồ so sánh ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ bình không nhiễm và tỷ lệ hạt nảy mầm của hạt Ngƣu tất Hình 3.2. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm và sự phát triển của chồi mầm Ngƣu tất Hình 3.3. Biểu đồ so sánh khả năng nhân chồi giữa BAP và kinetin.. 35 36 39 Hình 3.4. Biểu đồ so sánh tốc độ sinh trƣởng giữa BAP và kinetin… 41 Hình 3.5. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi và tốc độ sinh trƣởng của chồi Ngƣu tất trong ống nghiệm Hình 3.6. Hình ảnh rễ Ngƣu tất trong môi trƣờng có α-NAA......... 41 43 Hình 3.7. Biểu đồ ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm………..... Hình 3.8. Biểu đồ ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm…………... Hình 3.9. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân chồi và tốc độ sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm 45 47 Hình 3.10. Một số hình ảnh đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên…….. 48 51 Hình 3.11. Một số phản ứng định tính hợp chất saponin……… 53 Hình 3.12. Hình ảnh một số giai đoạn tách chiết hợp chất saponin 53 Hình 3.13. Hình ảnh điện di kiểm tra độ tinh sạch ADN………… 54 Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPP15 và OPP19……………………………………………. Hình 3.15. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPH04 và OPN05…………………………………………… Hình 3.16. Điện di sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% mồi OPF10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 57 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Theo báo cáo của Tổng Công ty Dược Việt Nam (năm 2000) cho thấy, Tổng công ty đã nhập khẩu 182 loại dược liệu với tổng khối lượng 18.300 tấn, trong đó có 81 loại nhập với khối lượng trên 100 tấn/loại. Trong đó, có 13 loại thuốc đi từ động vật và khoáng vật; 169 loại từ cây thuốc, nhiều loại là thuốc bắc đầu vị, một số không có ở Việt Nam [33]. Hiện nay, dược liệu tự sản xuất trong nước (bao gồm thu hái trong tự nhiên và trồng trọt) không đáp ứng đủ nhu cầu, 60% phải nhập khẩu, có hơn 20 loài cây thuốc đã nhập nội thành công ở nước ta, đã từng sản xuất đạt sản lượng lớn, nay cũng phải nhập khẩu trở lại trong đó có cây Ngưu tất. Có nhiều loài vốn là những cây trồng thế mạnh của Việt Nam cũng phải nhập từ nước khác như: Bạch biển đậu, Binh lang (hạt cau), Hoắc hương, Xạ can, Địa liền, Hồng hoa, Xuyên tâm liên, Ý dĩ [32]. Như vậy, trong khi thường xuyên xuất khẩu gần 100 loại dược liệu, bán thành phẩm và thành phẩm, doanh thu khoảng 30-50 triệu USD/năm, thì Việt Nam vẫn phải nhập khẩu dược liệu, chủ yếu từ Trung Quốc. Không những thế, còn xuất hiện tình trạng xuất khẩu tiểu ngạch dược liệu qua các cửa khẩu vùng biên dẫn đến nguy cơ tuyệt mẫu nhiều loài cây thuốc quý hiếm [33]. Trước thực trạng trên, để thực hiện được phương châm lấy dược liệu làm nền tảng trong chiến lược phát triển của ngành Y tế, cần phải có những chính sách mạnh mẽ, thích hợp, đồng bộ và khoa học dựa trên những điểm chính sau: song song với việc quy hoạch vùng dược liệu, bảo vệ nguồn tài nguyên dược liệu, đẩy mạnh công tác thông tin và nghiên cứu dược liệu. Một trong những trọng điểm của định hướng là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây thuốc trên quy mô lớn, phát triển nguồn dược liệu hàng hoá phục vụ cho việc điều trị trong nước và xuất khẩu. Tuy nhiên, để thực hiện tốt điều đó, bên cạnh việc đẩy mạnh các nghiên cứu cơ bản như thành phần hoá học, tác dụng dược lí của cây thuốc, các nghiên cứu ứng dụng cũng cần được xem trọng [30]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 Ngưu tất có tên khoa học là Radix Achyranthis Bidentatae, là cây thuốc Bắc có nguồn gốc từ Trung Quốc di thực vào nước ta từ năm 1960. Sang thập kỷ 70 của thế kỷ XX, cây Ngưu tất được phát triển đại trà, đáp ứng được nhu cầu trong nước và một phần xuất khẩu. Ngoài Ngưu tất chính danh (Ngưu tất Bắc), ngày nay y học dân gian nước ta còn sử dụng khá phổ biến cây Ngưu tất nam, tên thông dụng là cỏ xước (Achyranthes aspera L.) với công dụng như Ngưu tất [32]. Cây Ngưu tất được sử dụng rộng rãi, trong y học cổ truyền phương Đông, rễ cây Ngưu tất có tác dụng làm tan máu ứ, bớt sưng tấy, đau nhức, chống co rút, rung giật, làm mạnh gân cốt. Ngày này, y học hiện đại còn sử dụng Ngưu tất để hạ huyết áp và giảm cholesterol trong máu [12]. Từ rễ cây Ngưu tất, các nhà khoa học đã tách chiết và xác định được cấu trúc hoá học của 6 saponin với thành phần aglycon là axit oleanolic. Các saponin phân lập đã được xác định lần lượt là dimetyl ester của prosapogenin chikusetru – saponin-va, prosapogenin của chikusetru – saponin – Ib, metyl ester của chiksetru-saponin-IVa, ester của chiksetru-saponin-V, meyl ester của Achyrantosid B và trimetyl ester của saponin5. Thành phần saponin của Ngưu tất gồm các glycosid có aglycon là axit oleanolic phù hợp với công dụng của dược liệu này là chống viêm, sưng, trị đau nhức [38]. Hiện nay, ở nước ta Ngưu tất được trồng ở một số tỉnh như: Lạng Sơn, Bắc Ninh, Nghệ An...nhưng số lượng rất ít, không đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu trong nước. Mặc dù đã dùng cây cỏ xước để thay thế nhưng nhu cầu về Ngưu tất vẫn rất lớn. Xuất phát từ giá trị to lớn đó của cây Ngưu tất, nhằm bảo vệ nguồn gen và tạo ra được một số lượng lớn giống cây Ngưu tất cung cấp cho gieo trồng. Chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu bảo tồn vốn gen cây Ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 2. Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm nhằm bảo tồn nguồn gen và tạo ra số lượng nhất định cây con đồng đều cung cấp cho sản xuất và trồng thử ngoài đồng ruộng. - Khẳng định tính ổn định của cây nuôi cấy in vitro thông qua đánh giá sự ổn định về hàm lượng hợp chất saponin và genome cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây nuôi cấy trong ống nghiệm. 3. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm - Nghiên cứu khử trùng hạt để có mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm. - Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng lên sự phát sinh hình thái cây Ngưu tất trong ống nghiệm. - Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của nồng độ NAA hoặc IBA. - Nghiên cứu đưa cây ra môi trường tự nhiên 2. Định lượng hợp chất saponin trong rễ cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây nuôi cấy in vitro 3. Sử dụng kĩ thuật RAPD để đánh giá sự ổn định di truyền giữa cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây Ngưu tất nuôi cấy in vitro. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Ngƣu tất 1.1.1. Đặc điểm phân loại Ngưu tất có tên khoa học là (Radix Achyranthis Bidentatae).Tên thường gọi: Cyathula officinalis Kuan, Cyathula root, Achyranthes root. Ngưu tất gồm nhiều loài, thường gặp là Hoài Ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume), Ma Ngưu tất (Cyathula capitata (Wall Moq) và Xuyên Ngưu tất (C.officinalis Kuan) [37]. Ngưu tất thuộc Chi Cúc bách nhật (Gomphrera Globosa L.). Họ rau Dền (Amaranthaceae). Bộ Cẩm Chướng (Caryophyllales). Phân lớp Cẩm Chướng (Caryophyllidae). Lớp 2 lá mầm hay lớp Ngọc Lan (Dicotyledoneae) [20]. 1.1.2. Một số đặc điểm nông sinh học của cây Ngƣu tất Ngưu tất có thân thảo mảnh, hơi vuông, phân thành đốt, phình ra ở hai đầu trông giống như đầu gối con trâu nên có tên là Ngưu tất. Cây thường chỉ cao 1m, cũng có khi tới 2m, lá mọc đối, có cuống, dài 5 – 12cm, rộng 2 – 4cm, phiến lá hình trứng, đầu nhọn, mép lá nguyên [12]. Hoa dài 2 – 5cm, mọc thành bông ở đầu cành hoặc kẽ lá. Hoa thường gập xuống, sát vào cuống của cụm hoa. Hoa không có cánh. Đài hoa gồm 5 lá khô xác, dài gần bằng nhau. Bộ nhị gồm 5 nhị, chỉ nhị dính với nhau và dính cả với nhị lép. Nhị lép có răng rất nhỏ. Đầu chỉ nhị mang các bao phấn hình mắt chim. Bầu nhụy hình trứng. Quả hình bầu dục, có một hạt [38]. Rễ hình trụ tương đối thẳng, dài 20-30 cm, đường kính 0,5-1cm. Ðầu trên mang vết tích của cổ rễ, đầu dưới hơi thuộn nhỏ. Mặt ngoài màu vàng đất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 hay nâu nhạt, có nhiều nếp nhăn dọc nhỏ và vết tích của rễ con. Rễ gồm 1 hoặc 2 hoặc 3 rễ cái, chung quanh có các rễ con. Rễ cái nạc, lúc đầu hơi giòn, màu trắng ngà, sau khi chế biến có màu hồng, trong và mềm dẻo. Ở nước ta có cây cỏ xước mọc hoang dại, trông rất giống cây Ngưu tất, được các vị lương y dùng thay cho Ngưu tất với tên thông dụng nam Ngưu tất, tên khoa học Achyranthes Aspera L. cùng họ Dền. Nhìn bề ngoài, cỏ xước trông rất giống Ngưu tất tuy nhiên phiến lá Ngưu tất to và tù hơn, còn lá cỏ xước gầy và nhọn hơn. Rễ cỏ xước có nhiều rễ con hơn, rễ cái bị hoá gỗ. Còn rễ Ngưu tất ít rễ con hơn, rễ cái nạc và dài như chiếc đũa [12]. 1.1.3. Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch Kỹ thuật trồng cây Ngưu tất Chọn đất và làm đất: Ngưu tất ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn. Đất phù sa, cao ráo, thoát nước rất hợp với Ngưu tất. Đất nhiều cát sỏi, bạc màu, đất chua mặn không trồng được Ngưu tất. Ruộng trồng Ngưu tất phải được cày bừa, đập đất kỹ. Cày hoặc cuốc sâu có tác dụng làm cho rễ Ngưu tất dài, ăn sâu, cho năng suất cao. Khi lên luống thường bón lót phân chuồng vào lưng chừng luống. Lượng phân chuồng, theo tài liệu Trung Quốc phải bón tới 50 hoặc 60 tấn/ha, nghĩa là 2 - 3 tạ một sào Bắc bộ. Nhưng ở nước ta ít khi dùng lượng phân nhiều như thế. Tuy nhiên không nên trồng chay, năng suất sẽ thấp. Luống làm rộng 70 - 80cm cao 30 40cm. ở Trung Quốc người ta còn cày sâu, đập đất nhỏ và lên luống cao tới 70cm. Theo chuyên gia Trung Quốc, làm như vậy sẽ cho củ Ngưu tất dài 70 80cm [9]. Khi lên luống đã hoàn chỉnh, rạch 2 hàng dọc trên mặt luống cách nhau 20cm. Rắc phân chuồng bột trộn với tro khô. Gieo hạt: Trồng Ngưu tất bằng cách gieo hạt. Hạt được ngâm nước ấm vài giờ, xong trộn với cát khô và tro khô để dễ gieo. Gieo rất thưa trên rạch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 luống. Gieo xong đậy rơm hoặc rạ. Nếu có nhiều rạ thì đậy cả mặt luống nếu không, ít nhất cũng phải đậy ở rạch luống. Thời vụ gieo: ở miền núi tháng 2 và 3, ở đồng bằng tháng 10 và 11 (cuối thu đầu đông). Chăm sóc: Gieo hạt xong, quan trọng nhất là tưới ẩm hàng ngày cho hạt mau nẩy mầm. Khi hạt đã mọc thì bỏ rạ và tưới bằng thùng tưới có hoa sen để cho cây khỏi bết xuống đất. Khi cây có 4 - 5 đôi lá thật thì tưới thêm phân đạm pha loãng hoặc nước tiểu pha loãng để cho cây mau kín luống. Tuyệt đối không được tưới bằng nước phân chuồng tươi sẽ không đảm bảo về an toàn dược liệu. Nếu có cỏ phải làm cỏ, xới xáo, phá váng. Khi cây đã giao tán, kín luống, nhổ tỉa bớt những chỗ quá mau, để cây cách cây 15cm. Có thể tưới bằng cách tát nước vào ruộng, ngập rãnh luống rồi té nước lên mặt luống, làm như vậy sẽ giữ được độ ẩm cho cây. Tiếp đó tháo nước cho rút hết khỏi ruộng. Thu hoạch và chế biến sơ bộ: Thời gian thu hoạch ở miền núi vào cuối năm từ cuối tháng 10 đến tháng 12, ở đồng bằng vào tháng 4 đến tháng 5 năm sau [9]. Khi cây đã xuất hiện nhiều lá vàng, ở gốc lá đã rụng dần, đào thử thấy rễ Ngưu tất mập, dài 20 - 30cm là có thể thu hoạch. Trước hết cắt bỏ phần lá, thu gọn vào một chỗ. Dùng thuổng hoặc sà beng đào sâu bẩy đất lên để rễ khỏi bị đứt. Rũ sạch đất ở rễ, đem về rửa sạch, phơi ráo nước. Cắt bỏ rễ con, xông lưu huỳnh từ một đến hai đêm. Phơi âm can, hay nắng nhẹ, không nên phơi nắng to trên sân gạch, Ngưu tất sẽ bị khô xác [21]. 1.2. Tình hình sản xuất Ngƣu tất trên thế giới và ở Việt Nam Từ thời nguyên thuỷ, con người trong lúc tìm kiếm thức ăn, có khi ăn phải chất độc phát sinh nôn mửa hoặc đi ỉa lỏng, hoặc hôn mê có khi chết người, do đó dần dần có nhận thức phân biệt được vị nào ăn được, vị nào có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 độc. Kinh nghiệm dần được tích luỹ không những giúp cho loài người biết lợi dụng tính chất của cỏ cây làm thức ăn mà còn biết dùng làm thuốc chữa bệnh, hay dùng các vị có chất độc làm tên thuốc độc dùng trong săn bắn và chống ngoại sâm. Cây thuốc Ngưu tất cũng được tìm ra bằng con đường đó [12]. Ngưu tất là một loại cây dược liệu thu hoạch củ được trồng rộng rãi ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Ấn Độ, Campuchia, Lào...Trong đó Trung Quốc là nước có diện tích cũng như sản lượng Ngưu tất nhiều nhất thế giới. Năm 1960, cây Ngưu tất bắt đầu được trồng ở nước ta, trong những năm của thập kỉ 70 được phát triển đại trà, đáp ứng nhu cầu trong nước và một phần xuất khẩu. Thời gian sau đó, diện tích cây Ngưu tất giảm trầm trọng, chỉ còn trồng rải rác ở một số tỉnh chuyên canh về dược liệu như Lào Cai, Lai Châu, Hưng Yên, Thanh Hoá...và một số vườn dược liệu của các bệnh viện, Viện Nghiên cứu hoặc còn mọc hoang ở thung lũng các tỉnh miền núi phía Bắc như Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang... Hiện nay, sản lượng Ngưu tất trong nước rất ít, chỉ đáp ứng được 60% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu chủ yếu từ Trung Quốc [31]. Theo tinh thần “Định hướng chiến lược ngành y tế” và “Chính sách quốc gia về thuốc của Việt Nam” Chính phủ đã có những chính sách cũng như những quy định pháp luật cụ thể cho việc phát triển dược liệu. Hiện nay, các vùng dược liệu mới đang được quy hoạch ở các tỉnh như: Lào Cai, Mèo VạcHà Giang, Chí Linh-Hải Dương, Hương Sơn – Hà Tĩnh. Viện Dược Liệu được chọn làm cơ quan tham gia chương trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng miền núi, chương trình trồng rừng phủ xanh đất trống, đồi núi trọc, góp phần xoá đói giảm nghèo cho nhân dân miền núi. Viện đang xây dựng dự án trồng khảo nghiệm một số cây thuốc quý tại Quản Bạ, Đồng Văn – Hà Giang như Đương quy, Bạch truật, Ngưu tất.. [30].. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Bên cạnh việc mở rộng diện tích gieo trồng, các nghiên cứu khoa học cũng được đẩy mạnh. Năm 2005, Phạm Văn Hiển và CS đã xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro cây Ngưu tất từ đốt thân và ngọn chồi với tỷ lệ ra bầu 70% – 90% tuỳ thời vụ, tỷ lệ ra rễ in vitro đạt 90%. Đã tạo được mô sẹo cây Ngưu tất từ gốc thân và trục dưới lá mầm [8]. Năm 2000, Ngô Thị Xuyên đã tiến hành đề tài nghiên cứu tuyến trùng nốt sưng gây hại cây Ngưu tất ở một số tỉnh như: Thanh Trì, Gia Lâm – Hà Nội; Bình Minh, Nghĩa Trai – Hưng Yên, Hà Trung – Thanh Hoá; Tam Đảo – Vĩnh Yên và Sa Pa – Lào Cai. Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ nhiễm tuyến trùng nốt sưng khác nhau. Bệnh hại nặng ở vụ mùa xuân và đất trồng cây dược liệu liên tục quanh năm [29]. Năm 2005, Mai Đăng Đẩu đã nghiên cứu thiết kế, chế tạo hệ thống thiết bị chiết xuất dược liệu và hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất saponin từ Ngưu tất. Thành công của đề tài đã góp phần quan trọng trong việc tạo ra các thuốc mới từ Ngưu tất [5];[36]. 1.3. Ứng dụng cây Ngƣu tất trong y học 1.3.1. Cơ sở hoá học tính chữa bệnh của cây Ngƣu tất Rễ Ngưu tất có chứa axit oleanolic 0,096%, saponin toàn phần 4,04% và axit oleanolic α -L-rhamnopyranosyl - β - D- galactopyranoxit. Rễ còn chứa ecdysteron, inokosteron và muối kali. Hàm lượng ecdysteron khoảng 0,037%. Rễ Ngưu tất chứa một xaccarit là fructan mạch ngắn với mức độ trùng hợp trung bình là 8. Chất này có tác dụng cải thiện hệ miễn dịch. Rễ Ngưu tất còn có một peptitpolyxaccarit trong đó 24,1% là peptit bao gồm glycin, serin, axit glutamic và axit aspartic. Chất peptitpolyxaccarit có tác dụng miễn dịch. Betain có trong rễ với hàm lượng 0,93-1,029% đã được chứng minh là ổn định trong quá trình chế biến. Rễ khô còn có emodin và physcion [38]. Saponin là một glicozit tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật. Tiền tố sapo có nghĩa là xà phòng; và thực tế thường gặp từ "saponification" Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp. Chất saponin của Ngưu tất có tác dụng phá huyết và làm vón albumin. Ecdysteron và inokostenon có tác dụng kìm hãm sự phát triển của một số sâu bọ [34]. Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh. Một vài động vật cũng có saponin như các loài hải sâm, cá sao. Các saponin đều là các chất hoạt quang. Thường các steroit saponin thì tả truyền, còn triterpenoit saponin thì hữu truyền. Điểm nóng chảy của các sapogenin thường rất cao. Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axit loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm genin gọi là sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường. Các đường phổ biến là D-glucoza, D-galactoza, L-arabinoza, axit galactunoic, axit D-glucuronic... Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsteroi hoặc sapogenintritecpen dạng β-amirin (axit olenoic), dạng α-amirin (axit asiatic), dạng lupol (axit buletinic) hoặc tritecpen bốn vòng [35]. Dựa vào cấu trúc của phần sapogenin, người ta chia saponin ra làm 3 nhóm lớn là triterpenoit saponin, steroit saponin và glicoancaloit dạng steroit. Saponin có loại axit, trung tính hoặc kiềm. Trong đó, triterpenoit saponin thường là trung tính hoặc axit (phân tử có nhóm –COOH). Steroit saponin nhóm spirostan và furostan thuộc loại trung tính còn nhóm glicoancaloit thuộc loại kiềm [35]. Theo Đông y, Ngưu tất có vị chua, hơi đắng, tính bình không độc, vào 2 kinh can và thận, có tác dụng làm tan máu ứ đọng, bớt sưng tấy, đau nhức, chống co rút, rung giật, làm mạnh gân cốt. Trong nhân dân, Ngưu tất được dùng trong bệnh viêm khớp, đau người, sau khi đẻ máu hôi tanh không sạch, đau bụng, kinh nguyệt khó khăn. Nghiên cứu của các nhà khoa học gần đây Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9