Tài liệu Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép (cyprinus carpiolinnaeus, 1758) trong tủ lạnh

i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các quý phòng ban trường Đại học Nha Trang nói chung và Khoa Nuôi trồng thuỷ sản nói riêng; đặc biệt là sự hướng dẫn trực tiếp và tận tình của TS. Lê Minh Hoàng đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài này. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này. Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến tất cả các thầy, cô giáo trong Khoa Nuôi trồng thuỷ sản – Trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức cơ bản nhất làm cơ sở và nền tảng cho tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thanh Thủy ii MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i MỤC LỤC ..............................................................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG .....................................................................................iv DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................vi TÓM TẮT .............................................................................................................vii MỞ ĐẦU ................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................3 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá chép:..........................................................3 1.1.1. Hệ thống phân loại:.......................................................................... 3 1.1.2. Phân bố: .......................................................................................... 3 1.1.3. Đặc điểm hình thái:.......................................................................... 4 1.1.4. Đặc điểm sinh thái học ..................................................................... 4 1.1.5. Đặc điểm sinh trưởng....................................................................... 5 1.6.1. Tuổi và kích thước thành thục: ......................................................... 5 1.6.2. Tập tính sinh sản:............................................................................. 5 1.6.3. Mùa vụ sinh sản:.............................................................................. 6 1.6.4. Sức sinh sản: ................................................................................... 6 1.6.5. Một số đặc điểm về tinh trùng cá: ..................................................... 6 1.2. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh............................... 12 1.2.1. Trên thế giới:................................................................................. 12 1.3.2. Ở Việt Nam: .................................................................................. 14 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 15 2.1. Địa điểm nghiên cứu: .................................................................................. 15 2.2. Thời gian nghiên cứu:.................................................................................. 15 2.3. Đối tượng nghiên cứu:................................................................................. 15 iii 2.4. Phương pháp nghiên cứu: ............................................................................ 15 2.4.1. Chọn cá đực và vuốt tinh:............................................................... 16 2.4.2. Một số đặc điểm tinh dịch cá chép đưa vào nghiên cứu: .................. 17 2.4.3. Thí nghiệm ảnh hưởng của chất bảo quản đến thời gian bảo quản trong tủ lạnh: ................................................................................................... 20 2.4.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến thời gian bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh:.................................................................................. 21 2.4.6. Thí nghiệm ảnh hưởng của việc bổ sung kháng sinh đến thời gian bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh:................................................................... 21 2.5. Phương pháp xử lý số liệu: .......................................................................... 21 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 22 3.1. Ảnh hưởng của các chất bảo quản khác nhau lên thời gian bảo quản tinh trùng: ................................................................................................................. 22 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến thời gian bảo quản tinh trùng:............... 24 3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung kháng sinh lên thời gian bảo quản tinh trùng: . 25 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN............................................... 28 4.1. Kết luận:...................................................................................................... 28 4.2. Đề xuất ý kiến: ............................................................................................ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 30 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1: Chiều dài và tốc độ tăng trưởng của cá chép tại hạ lưu sông Hồng [16] ...5 Bảng 1.2: Thành phần tinh dịch của một số loài cá nước ngọt ............................... 11 Bảng 2.1: Một số chỉ tiêu của cá chép đực được đưa vào nghiên cứu..................... 17 Bảng 2.2: Mật độ tinh trùng qua 3 đợt thí nghiệm.................................................. 18 Bảng 2.3: Hoạt lực của tinh trùng cá chép đưa vào thí nghiệm............................... 19 Bảng 2.4: Thành phần của các chất bảo quản trong 100 ml nước cất ..................... 20 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1: Hình dạng ngoài của Cá chép - Cyprinus carpio. .....................................3 Hình 1.2: Cấu tạo tinh trùng cá [56].........................................................................7 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. CCSE (common carp sperm extender).............................................................................. 15 Hình 2.2: Vuốt tinh cá ........................................................................................... 16 Hình 2.3: Kiểm tra hoạt lực tinh trùng ................................................................... 20 Hình 3.1: Hoạt lực của tinh trùng (%) trong 5 chất bảo quản khác nhau 0,3 M glucose, 0,6 M sucrose, CCSE-1, CCSE-2 và CCSE-3 (Common Carp Solution Extender) được bảo quản ở 4oC. Control: không pha loãng.................................... 23 Hình 3.2. Hoạt lực của tinh trùng (%) với các tỷ lệ pha loãng khác nhau trong CCSE-2 bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC. Control: không pha loãng. ......................... 25 Hình 3.3. Hoạt lực của tinh trùng (%) bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC khi bổ sung kết hợp 25ppm penicillin + 25ppm streptomycin. Control: không pha loãng ............... 27 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT M: mol. mM: mmol. CCSE: Common Carp Sperm Extender. GTTB: Giá trị trung bình. SD: Độ lệch chuẩn. ASTT: Áp suất thẩm thấu. ppm: Parts per million. TLTK: Tài liệu tham khảo. TT: Thứ tự. HSTT: Hệ số thành thục. s: Giây. vii TÓM TẮT Bảo quản tinh trùng cá trong tủ lạnh rất hữu ích cho nghiên cứu về gen và sinh sản nhân tạo cá. Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra chất bảo quản, tỷ lệ pha loãng và hiệu quả của việc bổ sung kháng sinh tốt nhất cho bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. Trong thí nghiệm về chất bảo quản, tinh trùng cá chép được bảo quản trong các chất bảo quản lần lượt là: 0,3 M glucose; 0,6 M sucrose, (common carp sperm extender) CCSE-1, CCSE-2 và CCSE-3. Thí nghiệm về tỷ lệ thì chất bảo quản được pha loãng ở các thang tỷ lệ 1:1, 1:3, 1:5 (tinh dịch: chất bảo quản). Trong trường hợp thí nghiệm về chất kháng sinh thì tinh trùng được pha loãng với tỷ lệ 1:3 với chất bảo quản CCSE-2 được bổ sung 25ppm penicilin và 25ppm streptomycin. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC. Kết quả thu được từ các thí nghiệm cho thấy: điều kiện tốt nhất cho bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong tủ lạnh là bảo quản bằng chất bảo quản CCSE2 ở tỷ lệ 1:3 ở nhiệt độ 4oC trong đó tinh trùng có thể duy trì hoạt lực đến ngày thứ 17. Trong điều kiện bổ sung thêm kháng sinh thì hoạt lực tinh trùng có thể duy trì đến ngày thứ 29. Những kết quả này cho thấy rằng tinh trùng cá chép có thể bảo quản được trong tủ lạnh. Từ khoá: Cá chép, Cyprinus carpio, tinh trùng, bảo quản lạnh, chất bảo quản. 1 MỞ ĐẦU Cá Chép (Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) là loài thuộc họ Cyprinidae - họ cá nước ngọt lớn nhất [51] và được nuôi phổ biến trên toàn thế giới, sản lượng đạt 13% (3,4 triệu tấn) so với tổng sản lượng cá nước ngọt toàn cầu [36]. Chúng thích nghi với các điều kiện và môi trường sống khắc nghiệt do đó chúng phân bố rộng rãi trên toàn thế giới. Ngoài ra, cá chép có tốc độ tăng trưởng nhanh, là loài có giá trị kinh tế, thịt cá thơm ngon nhất là sau mùa cá được vỗ béo nên được nhiều người nuôi và người tiêu dùng ưa thích [30]. Đây là đối tượng nuôi quan trọng trong ao, hồ, đầm, ruộng, lồng bè. Cá có thể nuôi đơn hoặc nuôi ghép đều cho năng suất và hiệu quả rất cao. Chúng còn được nuôi để diệt ấu trùng muỗi, làm cá cảnh trong công nghệ di truyền màu sắc [30]. Tuy nhiên, hiện nay sản lượng cá chép tự nhiên đã và đang giảm sút hết sức nghiêm trọng do khai thác quá mức. Mặt khác do việc nhập giống, lai tạo cá ra các vùng nước tự nhiên và lai tạp làm mất dần nguồn gen quý hiếm, bản địa của đàn cá chép Việt Nam. Do vậy việc lưu giữ dòng thuần cá chép tại Việt Nam làm nguyên liệu cho chọn giống, lai tạo các thế hệ con lai kinh tế là hết sức cần thiết và mang ý nghĩa thực tiễn to lớn [15]. Một trong những phương pháp giúp lưu giữ dòng thuần cá nói riêng và các loài động vật thuỷ sản nói chung đó là bảo quản lạnh tinh trùng. Trong quá trình sản xuất giống nhân tạo, việc bảo quản lạnh tinh giúp cho quá trình thụ tinh được chủ động hơn, đơn giản trong việc vận chuyển cá bố mẹ từ nơi này đến nơi khác, phục vụ lai tạo giống mới, khắc phục khó khăn trong sản xuất nhân tạo một số loài cá do sự lệch pha giữa cá đực và cá cái đồng thời bảo vệ được nguồn gen. Ngoài ra, bảo quản lạnh tinh trùng còn có vai trò quan trọng trong việc hạn chế tối đa việc lưu giữ cá đực, bảo tồn dòng thuần, hạn chế suy giảm do cận huyết trong quần đàn [54]. Bảo quản lạnh làm giảm hoạt động trao đổi chất của các tế bào tinh trùng và kéo dài thời gian sống của chúng [42]. Bảo quản lạnh tinh trùng cá là một kỹ thuật đơn giản cho phép tinh trùng luôn có sẵn tại các thời điểm khác nhau để tiến hành thụ tinh với trứng bằng cách tiêm hormon cho con cái, làm tăng năng suất sinh sản [48]. 2 Trước tình hình đó cần có thêm nhiều nghiên cứu cụ thể về đặc điểm sinh sản của cá, đặc biệt là việc nghiên cứu thành phần tinh dịch của cá chép nhằm đưa ra được những chất bảo quản, tỷ lệ pha loãng tốt nhất giúp cho quá trình bảo quản lạnh tinh trùng có hiệu quả cao nhất. Có rất nhiều công trình nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng của một số loài cá đã được công bố như cá hồi [60], cá tra [52], cá tầm [29], cá đù vàng [42]... Tuy nhiên, nghiên cứu về bảo quản lạnh tinh trùng cá chép vẫn còn nhiều vấn đề cần phải được nghiên cứu nhằm gia tăng thời gian bảo quản. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép (Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) trong tủ lạnh” được thực hiện. Đề tài này được thực hiện với các nội dung chính sau: - Ảnh hưởng của chất bảo quản lên thời gian bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. - Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lên thời gian bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. - Ảnh hưởng của việc bổ sung chất kháng sinh lên thời gian bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm tìm ra được: (1) chất bảo quản tốt nhất, (2) tỷ lệ pha loãng tối ưu nhất và (3) hiệu quả của việc bổ sung chất kháng sinh cho thời gian bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh. Thành công nghiên cứu này có thể giúp cho việc bảo quản tinh trùng cá chép trong tủ lạnh tốt hơn và tăng hiệu quả kinh tế trong sinh sản nhân tạo cá chép. Do thời gian thực tập ngắn, cơ sở vật chất chưa hiện đại và kiến thức về lĩnh vực này còn hạn chế nên đồ án tốt nghiệp không thể tránh khỏi thiếu sót. Rất mong quý thầy cô và bạn đọc đóng góp ý kiến để đồ án được hoàn thiện hơn. Trân trọng cảm ơn! Nha Trang, tháng 6 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thanh Thuỷ 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá chép: 1.1.1. Hệ thống phân loại: Hình 1.1: Hình dạng ngoài của Cá chép - Cyprinus carpio. Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Cypriniformes Họ: Cyprinidae Giống: Cyprinus Loài: C. carpio Tên tiếng Anh: Common carp. Tên tiếng Việt: Cá chép. 1.1.2. Phân bố: Trên thế giới: Cá chép phân bố rộng khắp các vùng trên toàn thế giới trừ Nam Mỹ, Tây Bắc Mỹ, Madagasca và châu Úc. Ở Việt Nam: Cá phân bố rộng trong sông ngòi, ao hồ, ruộng ở hầu hết các tính phía Bắc Việt Nam. Cá có nhiều dạng hình như: Cá chép trắng, chép cẩm, chép hồng, chép đỏ, chép lưng gù, chép thân cao, chép Bắc Cạn v.v... là loài cá có giá trị kinh tế cao. 4 1.1.3. Đặc điểm hình thái: Thân cá hình thoi, mình dây, dẹp bên. Viền lưng cong, thuôn hơn viền bụng. Đầu cá thuôn, cân đối, mõm tù. Có hai đôi râu: Râu mõm ngắn hơn đường kính mắt, râu góc hàm bằng hoặc lớn hơn đường kính mắt. Mắt vừa phải ở hai bên, thiên về phía trên của đầu. Khoảng cách hai mắt rộng và lồi. Miệng ở mút mõm, hướng ra phía trước, hình cung khá rộng; rạch miệng chưa tới viền trước mắt. Hàm dưới hơi dài hơn hàm trên. Môi dưới phát triển hơn môi trên. Màng mang rộng gắn liền với eo. Lược mang ngắn, thưa. Răng hầu phía trong là răng cấm, mặt nghiền có vân rãnh rõ [5]. Khởi điểm của vây lưng sau khởi điểm vây bụng, gần mõm hơn tới gốc vây đuôi, gốc vây lưng dài, viền sau hơi lõm, tia đơn cuối là gai cứng rắn chắc và phía sau có răng cưa. Vây ngực, vây bụng và vây hậu môn ngắn chưa tới các gốc vây sau nó. Vây hậu môn viền sau lõm, tia đơn cuối hoá xương rắn chắc và phía sau có răng cưa. Hậu môn ở sát gốc vây hậu môn. Vây đuôi phân thuỳ sâu, hai thuỳ hơi tầy và tương đối bằng nhau. Vẩy tròn, lớn. Đường bên hoàn toàn, chạy thẳng giữa thân và cuống đuôi. Gốc vây bụng có vẩy nách nhỏ dài. Lưng xanh đen, hai bên thân phía dưới đường bên vàng xám, bụng trắng bạc. Gốc vây lưng và vây đuôi hơi đen. Vây đuôi và vây hậu môn đỏ da cam [5]. 1.1.4. Đặc điểm sinh thái học Cá chép sống ở tầng đáy cá vực nước, nơi có nhiều mùn bã hữu cơ, thức ăn đáy và cỏ nước. Cá có thể sống được trong điều kiện khó khăn khắc nghiệt, ngưỡng oxy thấp: 0,5-0,6 mgO2/l trong thực tế thường là 0,2-0,3 mgO2/l; chịu đựng được nhiệt độ từ 0-4oC, thích hợp ở 20-27oC, pH: 5-9, độ mặn: 8-10‰. Cá chép ăn tạp, thiên về ăn động vật không xương sống ở đáy. Thức ăn của cá khá đa dạng như mảnh vụn thực vật, rễ cây, các loài giáp xác (Copeporda, Decaporda, Gatstropoda), ấu trùng muỗi, ấu trùng côn trùng, thân mềm. Tùy theo kích cỡ cá và mùa vụ dinh dưỡng mà thành phần thức ăn có sự thay đổi nhất định. Ngoài thức ăn tự nhiên có trong thuỷ vực thì cá còn ăn thức ăn nhân tạo như cám nổi [5]. 5 1.1.5. Đặc điểm sinh trưởng Cá chép là loài có kích cỡ trung bình, lớn nhất có thể đạt tới 15-20 kg. Cấu trúc thành phần tuổi của cá chép ở sông Hồng trước đây có tới 7 nhóm tuổi. Sinh trưởng chiều dài hàng năm của cá chép như sau: 1 tuổi là 17,3 cm, 2 tuổi là 20,6 cm, 3 tuổi là 30,2 cm, 4 tuổi là 35,4 cm, 5 tuổi là 41,5 cm và 6 tuổi là 47,5 cm. Tốc độ tăng trưởng giảm dần theo chiều dài nhưng lại tăng dần theo trọng lượng. Chiều dài và tốc độ tăng trưởng hàng năm của cá chép tại hạ lưu sông Hồng thể hiện qua Bảng 1.1. Bảng 1.1: Chiều dài và tốc độ tăng trưởng của cá chép tại hạ lưu sông Hồng [17] Nhóm tuổi Chiều dài (cm) L2 L3 L4 Tốc độ tăng trưởng (cm) 1+ L1 17,3 L5 L6 2+ 15,5 20,6 15,5 5,1 3+ 16,8 25,7 30,2 16,8 8,9 4,5 4+ 19,0 26,6 32,0 35,4 19,0 7,6 5,4 3,4 5+ 15,0 22,3 28,0 34,9 41,5 15,0 7,3 5,7 6,9 6,6 6+ 18,6 25,1 31,0 38,4 42,4 47,5 18,6 6,5 5,9 7,0 4,0 5,1 7+ 17,0 24,1 30,0 36,2 42,0 47,5 17,0 7,1 6,2 6,1 5,8 5,1 100,0 42,0 36,5 36,0 34,0 32,0 % so với chiều dài 1 tuổi L-chiều dài, T-tốc độ tăng trưởng T1 17,3 T2 T3 T4 T5 T6 1.6.1. Tuổi và kích thước thành thục: Ở Việt Nam, cá thành thục sinh dục lần đầu khi đạt 1 năm tuổi, 500 – 700 g/con; cá chép đực thành thục khi đạt 8 tháng tuổi, trọng lượng trung bình 500 g/con [17]. 1.6.2. Tập tính sinh sản: Cá sinh sản trong ao, hồ, sông, ruộng trũng, không di cư sinh sản. Cá đẻ trứng dính, khi rơi vào môi trường nước, trứng dính trên các giá thể: bèo, thực vật thủy sinh… Đường kính trứng 1,2 – 1,8 mm. Trứng cá chép có thể hô hấp trong môi trường không khí ẩm [11]. 6 1.6.3. Mùa vụ sinh sản: Ngoài tự nhiên: Cá đẻ chủ yếu vào mùa xuân từ tháng 3 – 6 và mùa thu tháng 7 – 9. Cá có thể sinh sản nhiều lần trong năm. Trong điều kiện nuôi & sinh sản nhân tạo: cá sinh sản cuối tháng 12 âm lịch, có thể sinh sản nhân tạo không cần sử dụng kích dục tố. 1.6.4. Sức sinh sản: Hệ số thành thục ngoài tự nhiên: HSTT cá cái 18-21%; trong điều kiện nuôi đạt 12-25%. Sức sinh sản phụ thuộc vào nhiều vào trọng lượng cá cái, khoảng 15-20 vạn trứng/kg cá cái [11]. 1.6.5. Một số đặc điểm về tinh trùng cá: 1.6.5.1. Quá trình tạo tinh trùng: Tinh trùng trước khi thành thục trải qua nhiều giai đoạn phát triển khác nhau cuối cùng mới phân hóa cao độ hình thành tế bào sinh dục đực hoàn thiện có năng lực thụ tinh. Quá trình tạo tinh trùng của cá diễn ra trong tinh sào [6], bắt đầu từ tế bào sinh dục nguyên thủy và trải qua các giai đoạn sau:  Giai đoạn tăng sinh: Từ tế bào sinh dục nguyên thủy phân chia nguyên nhiễm nhiều lần tạo thành các tinh nguyên bào. Tinh nguyên bào có một nhân to, chất nguyên sinh trong nhân phân bố đều, đường kính của tinh nguyên bào dao động từ 9-16 µm [1].  Giai đoạn sinh trưởng: Ở giai đoạn này, chất dinh dưỡng do tinh nguyên bào hấp thụ được đồng hóa và chuyển thành nguyên sinh chất của tế bào. Do đó tế bào sinh trưởng mãnh liệt, thể tích tăng lên và hình thành tinh bào sơ cấp (tinh bào cấp 1). Nguyên sinh chất trong nhân tế bào từ dạng hạt đã biến thành thể nhiễm sắc sợi mảnh hoặc thô chuẩn bị cho giai đoạn phân chia tiếp theo.  Giai đoạn thành thục: Tinh bào sơ cấp trải qua 2 lần phân chia liên tục 7 - Lần 1: Từ 1 tinh nguyên bào sơ cấp phân chia giảm nhiễm hình thành 2 tế bào thứ cấp. Số lượng nhiễm sắc thể trong nhân giảm đi một nửa (thể đơn bội kép). - Lần 2: Tinh bào thứ cấp phân chia nguyên nhiễm tạo nên 2 tinh tử có bộ nhiễm sắc thể 1n. Như vậy, từ 1 tế bào sinh dục nguyên thủy sẽ tạo thành 4 tinh tử có bộ nhiễm sắc thể 1n. Tinh tử trải qua các quá trình biến thái đặc biệt để hình thành nên tinh trùng. 1.6.5.2. Cấu tạo tinh trùng: Hình 1.2: Cấu tạo tinh trùng cá [57] Ở các lớp động vật khác nhau, tinh trùng của chúng khác nhau khá nhiều. Tuy nhiên tất cả đều có nét chung về hình thái và có liên quan mật thiết đến chức năng chủ yếu là khả năng sống và thụ tinh [1]. Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: phần đầu, phần cổ và phần đuôi.  Phần đầu: Đầu tinh trùng là phần có khả năng kích thích trứng và chuyển vật chất di truyền vào trong trứng. Hình thái của đầu tinh trùng khác nhau tùy loài, có thể là hình đa giác, hình xoắn (ở cá sụn) hay hình ovan, ở cá xương đầu tinh trùng có cấu tạo đơn giản gần như hình tròn [1]. 8 Đầu tinh trùng thường rất to so với các phần cổ và đuôi. Trên cùng của đầu, nằm ngang dưới màng là thể đỉnh. Thể đỉnh có hình như chiếc mũ trùm xuống phía dưới, trong đó chứa enzyme Hialuronidaza có tác dụng hòa tan màng tế bào trứng mở đường cho tinh trùng xâm nhập vào khi thụ tinh. Thể đỉnh do bộ máy Golgi tạo thành. Nhân tinh trùng nằm dưới thể đỉnh, rất to và đông đặc, chứa nguyên liệu di truyền của giao tử đực. Bao quanh nhân và thể đỉnh là một lớp tế bào chất mỏng [3].  Phần cổ: Phần cổ tương đối ngắn, cách đầu bằng một màng mỏng. Trong cổ chứa trung tử đầu và trung tử đuôi nằm vuông góc với nhau. Từ trung tử đuôi phát ra các sợi trục của tinh trùng. Trung tử đầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia trứng đã được thụ tinh [1].  Phần đuôi: Đuôi tinh trùng cá là cơ quan vận động dài và mảnh tùy theo loài. Phần đầu của đuôi tinh trùng là vòng xoắn ty thể. Ty thể là bào quan mang các enzyme oxy hóa và enzyme oxyphosphorine hóa, do vậy nó có liên quan đến quá trình hoạt động chuyển hóa năng lượng của tinh trùng. Phần cuối của đuôi gồm 10 đôi sợi trục: 1 đôi phân bố ở giữa và 9 đôi ở ngoại vi. Đuôi đảm bảo cho tinh trùng hoạt động. Vì để gặp được trứng, tinh trùng phải chuyển động một khoảng cách nhất định. Sự di chuyển được thực hiện bằng cách chuyển động co duỗi lượn sóng và chuyển động đập của đuôi [1]. 1.6.5.3. Đặc điểm sinh học của tinh trùng:  Kích thước và số lượng: Kích thước của tinh trùng thường rất bé so với tế bào trứng trong cùng 1 loài. Ví dụ: cá rô 20 µm, người từ 50-70 µm, hầu 75 µm, tôm he 10 µm [1], ngược lại, số lượng tinh trùng của chúng lại rất lớn. Ví dụ: 1ml tinh dịch cá trắm cỏ có 31,1±1,7 triệu tinh trùng; cá mè trắng có 31,6±2,8 triệu tinh trùng; cá trắm đen có 16,2±0,9 triệu tinh trùng [1].  Đặc điểm vận động: Khi còn ở trong tuyến sinh dục, tinh trùng không vận động nhưng khi rơi vào nước nó vận động mạnh. Ở cá nước ngọt, tinh trùng lao đầu về phía trước sau 1-2 phút 9 chuyển động chậm dần và sau đó chuyển sang chuyển động dao động. Khoảng 2-3 phút lượng tinh trùng chuyển động còn rất ít và cuối cùng toàn bộ ngừng hoạt động [1]. Hoạt lực của tinh trùng phụ thuộc vào đặc điểm của loài, mức độ thành thục của nó và điều kiện môi trường mà nó đang sống. Sự chuyển động và thời gian vận động của tinh trùng có thể giúp đánh giá được chất lượng tinh trùng. Persov [53] đã đề nghị một bảng để đánh giá mức độ (5 mức) chuyển động của tinh trùng sau khi cho vào dung dịch kích hoạt. Cụ thể là: Mức 5: Tất cả tinh trùng đều chuyển động tiến thẳng, mức 4: Đa số tinh trùng chuyển động tiến trong hiển vi thường thấy chỉ có một số ít tinh trùng dao động, mức 3: Số tinh trùng chuyển động ít hơn số tinh trùng dao động, đã có một số tinh trùng bất hoạt, mức 2: Rất ít tinh trùng chuyển động tiến, một số ít chuyển động dao động, ¾ số tinh không chuyển động, mức 1: Tất cả tinh trùng không chuyển động. Năng lượng cung cấp cho sự vận động của tinh trùng chủ yếu dựa vào sự phân giải glucid, năng lượng dự trữ của tinh trùng. Sự vận động là tiêu chuẩn quan trọng nhất để xác định sức sống của tinh trùng cá. Cá đực thành thục tốt thì tinh trùng khỏe mạnh và tuổi thọ kéo dài hơn so với cá đực chưa thành thục. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sống và hoạt động của tinh trùng gồm: - Nhiệt độ: Trong phạm vi nhiệt độ thích hợp thì tốc độ hoạt động của tinh trùng tăng khi nhiệt độ tăng nhưng thời gian sống của tinh trùng sẽ ngắn lại, vì nhiệt độ tăng làm tăng nhanh quá trình oxy hóa vật chất trong tinh trùng và sự tiêu hao năng lượng tăng lên. Tuy nhiên nếu nhiệt độ vượt quá giới hạn cho phép của phạm vi thích hợp thì tinh trùng nhanh chóng mất khả năng vận động và chết. Ở nhiệt độ thấp sự vận động của tinh trùng bị ức chế và tăng thời gian sống của tinh trùng. Tinh trùng có thể duy trì khả năng thụ tinh của mình khá lâu nếu được giữ ở nhiệt độ thấp 0-4oC [1]. Dựa vào những đặc điểm này người ta đã tiến hành phương pháp bảo quản tinh trùng ở nhiệt độ thấp để kéo dài tuổi thọ của tinh trùng. 10 - Áp suất thẩm thấu của môi trường: Áp suất thẩm thấu của môi trường cũng ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tinh trùng. Nếu tinh trùng được đưa vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao hơn áp suất thẩm thấu của tế bào chất tinh trùng thì nước từ trong tế bào chất đi ra ngoài, tinh trùng bị mất nước và teo lại, đuôi hoạt động không linh hoạt nữa, tinh trùng không vận động được và mất khả năng thụ tinh. Nếu đưa tinh trùng vào môi trường có áp suất thẩm thấu thấp hơn áp suất thẩm thấu của tế bào chất tinh trùng thì nước có xu hướng thấm vào tinh trùng làm cho nó bị trương phồng lên dẫn tới vỡ tế bào. Ở trong môi trường đẳng trương áp suất thẩm thấu bên ngoài bằng bên trong, tức là áp suất thẩm thấu của môi trường bằng áp suất thẩm thấu trong nguyên tinh dịch thì tinh trùng không phải tiêu hao năng lượng cho việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu, vì vậy sẽ kéo dài được tuổi thọ. Tinh trùng cá xương có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu theo một chiều nhất định. Đối với cá nước ngọt, áp suất thẩm thấu của tế bào chất tinh trùng tương đương với dung dịch nước muối NaCl 0,5% và nó có khả năng thích nghi với môi trường nước có áp suất thẩm thấu thấp hơn áp suất thẩm thấu của tế bào chất nên nó chống được sự thấm nước từ ngoài vào. Tuy nhiên tinh trùng cá nước ngọt lại không có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu ở môi trường có áp suất thẩm thấu cao. Trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao hơn, tinh trùng cá nước ngọt sống lâu hơn so với môi trường có áp suất thẩm thấu thấp hơn vì ở đó chúng tiêu tốn ít năng lượng hơn [16]. Đối với cá biển, áp suất thẩm thấu của tế bào chất tương đương với dung dịch nước muối NaCl 0,75%, thấp hơn so với áp suất thẩm thấu của nước ngọt. Khi vào nước biển tinh trùng của cá biển có khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu để tế bào chất của nó không bị mất nước, nhanh chóng thích nghi với điều kiện môi trường. Tinh trùng cá biển không có khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu khi chúng ở môi trường có áp suất thẩm thấu nhỏ hơn áp suất thẩm thấu của tế bào chất của chúng, nghĩa là không chống được sự xâm nhập của nước vào tế bào chất [16]. Tóm lại, áp suất thẩm thấu của môi trường bằng áp suất thẩm thấu trong nguyên tinh dịch là tốt nhất cho tinh trùng sống và có khả năng thụ tinh bình thường. 11 - Ánh sáng: Nếu chiếu trực tiếp ánh sáng mặt trời sẽ có tác dụng xấu đối với tuổi thọ của tinh trùng do hiệu ứng quang hợp của tia tử ngoại và hiệu ứng nhiệt quang của tia hồng ngoại làm tăng sức vận động của tinh trùng lên nhưng lại rất nhanh chết. - Tinh trùng nhạy cảm với ion kim loại hóa trị 2 và 3 hoặc acid, sự có mặt của các ion này làm cho tinh trùng kết vào nhau. Ở môi trường kiềm hóa, tinh trùng hoạt động tích cực hơn nhưng mau chóng hết năng lượng và chóng chết [1]. - Độ pH của môi trường cũng có liên quan đến sự vận động của tinh trùng: tinh trùng cá hồi vận động tốt nhất khi pH là 8,3 [16]. - Tuổi thọ của tinh trùng còn phụ thuộc vào chất lượng thành thục của cá. 1.6.5.4. Thành phần tinh dịch một số loài cá nước ngọt: Bảng 1.2: Thành phần tinh dịch của một số loài cá nước ngọt Loài Cyprinids Cyprinus carpio Ctenopharyngodon idella Tinca tinca 1 Ca2+ Na+ K+ Mg2+ (mM/l) (mM/l) (mM/l) (mM/l) 0,3–12,5 94–107 39–78 0,1–1,2 10,7±2,71 71,3±3,71 78,9±3,71 110,6±8,81 11,5±0,72 59,0±3,22 73,0±3,52 96,3±3,62 8,7±2,93 58,1±5,33 77,6±4,63 102,1±7,353 2±0,2 75±3,2 82,4±3,3 0,8±0,1 [49] 1,0 81,1 35,1 1,6 [37] 0,6±0,2 18,4±1,3 1,9±0,6 0,5±0,1 Cl- (mM/l) TLTK [19, 20] Đông, 2 Đầu xuân, 3 Cuối xuân, TLTK: tài liệu tham khảo Dựa vào những đặc điểm trên của tinh trùng và thành phần tinh dịch của cá chép, ngày nay người ta nghiên cứu ứng dụng rộng rãi biện pháp bảo quản tinh trùng ở dạng nguyên tinh dịch trong các dụng cụ khô ráo ở nhiệt độ thấp và kín đã có thể kéo dài tuổi thọ của tinh trùng một cách hiệu quả. Ngoài ra, dựa vào đặc tính [40] [4446] 12 của tinh dịch cũng có thể tạo ra chất bảo quản ứng dụng tốt nhất cho bảo quản tinh trùng ngắn hạn và dài hạn của loài cá được nghiên cứu [42]. 1.2. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh 1.2.1. Trên thế giới: Trước những năm 50 của thế kỷ XX, việc lưu giữ tinh trùng ở điều kiện nhiệt độ thấp như bảo quản trong tủ lạnh hoặc trong đá khô đã được thực hiện, tuy nhiên thời gian gần đây mới có nhiều kết quả được công bố rộng rãi: Tinh trùng cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) khi giữ ở 12oC có thể duy trì khả năng thụ tinh trong 1 ngày trong khi lưu giữ ở 0-5oC khả năng thụ tinh lên đến 8 ngày [58]. Đối với tinh trùng cá hồi, thời gian lưu giữ biến đổi giữa các loài khác nhau: ở loài Oncorhynchus masou thời gian lưu giữ 4 ngày [58], Salmo trutta fario 14 ngày [22] và đáng chú ý là đối với tinh trùng cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) thời gian lưu giữ lên đến 34 ngày [60]. Tinh trùng các loài cá nước ấm như cá rô phi sông Nile hay cá da trơn (Ictalurus punctatus) khi lưu giữ ở 0-4oC cũng cho kết quả tương tự [29, 54]. Theo các báo cáo về việc lưu giữ tinh trùng cá biển, thời gian lưu giữ lâu nhất là ở cá bơn (Scophtalmus maximus) và cá chẽm (Morone saxatilis) 6-7 ngày [28, 39] và vẫn có thể hoạt hoá sự vận động của tinh trùng cá tuyết (Gadus morhua) và cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) sau 38 ngày lưu giữ [32]. Đặc biệt đối với tinh trùng cá thìa (Polyodon spathula) vẫn có thể vận động sau 56 ngày lưu giữ [25]. Tuy nhiên, để kéo dài thời gian bảo quản tinh trùng một số nghiên cứu đã tiến hành lưu giữ tinh trùng trong các chất bảo quản. Yusuf Bozkurt và ctv [24] đã tiến hành bảo quản tinh trùng cá chép kính (Ctenopharyngodon idella) trong 3 chất bảo quản 0,3M Glucose, 1% NaCl và hỗn hợp MIS (Modified ionic solution) 75 mM NaCl, 70 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 20 mM Tris ở tỷ lệ 1:3 kết quả đạt được là tinh trùng bảo quản trong 0,3M glucose có tỷ lệ thụ tinh tốt nhất và thấp nhất trong MIS. Trong khi, tinh trùng của cá hồi Abant bảo quản trong 0,3 M glucose và Ringer solution (0,11 M NaCl, 0,04 M KCl, 0,0024 M NaHCO3 và 0,002 M CaCl2) ở tỷ lệ 1:2 thì khả năng vận động trong 0,3M glucose tốt hơn trong Ringer solution [38]. 13 Ngoài ra, tỷ lệ pha loãng cũng là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến thời gian bảo quản tinh trùng, vì khi pha loãng sẽ làm giảm được mật độ của tinh trùng so với tinh trùng ban đầu và giảm các vấn đề về ô nhiễm từ nước tiểu. Tuy nhiên cần phải có nghiên cứu về chất pha loãng sao cho phù hợp với tinh trùng của từng loài cá. Gần như khi nào kiểm tra, pha loãng tinh trùng cải thiện được thời gian lưu giữ tinh trùng từ vài giờ khi không pha loãng lên 21-28 ngày sau khi pha loãng ở cá tầm (Acipencer oxyrinchus) [52] và từ 1 ngày khi không pha loãng lên 6 ngày khi pha loãng đối với cá bơn (Scophtalmus maximus) [28]. Việc lưu giữ tinh trùng trong thời gian ngắn (vài giờ) ở cá mè (Tinca tinca) chỉ có thể thực hiện khi pha loãng tinh trùng [55] và việc pha loãng cũng cải thiện được thời gian lưu giữ đối với cá chẽm (Morone saxatilis) [39], cá tuyết (Gadus morhua), cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) và cá mướp (Osmerus mordax) [31]. Đối với tinh trùng cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua), cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) và cá mướp vân (Osmerus mordax) tỷ lệ pha loãng 1:3 tốt hơn so với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:5 và 1:10 [31, 32]. Theo Erdahl và ctv [35] thì khi pha loãng ở tỷ lệ lớn hơn tỷ lệ 1:3 sẽ làm giảm chất lượng tinh trùng so với tỷ lệ 1:1, 1:2 và 1:3 ở cá hồi nâu (Salmo trutta fario) và cá hồi Chinook (Oncorhynchus tschawytscha). Ở tinh trùng cá da trơn châu Phi-Clarias gariepinus tỷ lệ 1:5 thì tốt hơn so với 1:3 hay 1:10 [34]. Năm 1978, Stoss và ctv [59] bảo quản tinh cá hồi được 23 ngày ở nhiệt độ 2oC, khi bổ sung thêm chất kháng sinh trong quá trình bảo quản tinh. Theo báo cáo của Saad và ctv [56] thì khi bổ sung 50 IU/ml penicillin+50 µg/ml streptomycin cho tinh trùng cá chép không pha loãng có thể duy trì khả năng vận động và thụ tinh hơn 18 ngày ở 4oC trong khi đó các mẫu không được bổ sung kháng sinh thì thời gian lưu giữ ít hơn 6 ngày. Nồng độ này cũng được thực hiện cho bảo quản tinh trùng cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) và cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) [32]. Đối với cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) thì nồng độ kháng sinh cao hơn (125 IU/ml penicillin+125 µg/ml streptomycin) [61]. Việc lưu giữ tinh trùng cá thìa (Polyodon spathula) cũng được cải thiện khi bổ sung kết hợp 2 kháng sinh penicillin và streptomycin [25]. Ở cá da trơn châu Phi (Clarias gariepinus) khi