Tài liệu Nghiên cứu bán tổng hợp Troxerutin từ Rutin

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................................ 3 1.1. Rutin.................................................................................................................... 3 1.1.1. Công thức, tính chất ...................................................................................... 3 1.1.2. Nguồn nguyên liệu và phương pháp chiết..................................................... 5 1.2. Troxerutin........................................................................................................... 7 1.2.1. Công thức, tính chất ...................................................................................... 7 1.2.2. Tác dụng của troxerutin (Vitamin P4)........................................................... 8 1.2.3. Một số sản phẩm troxerutin trên thị trường ................................................ 11 1.2.4. Các phương pháp bán tổng hợp troxerutin từ rutin..................................... 13 1.3. Ethylen clorohydrin......................................................................................... 15 1.3.1. Công thức, tính chất .................................................................................... 15 1.3.2. Ảnh hưởng đến sức khỏe con người ........................................................... 16 1.3.3. Những điều cần chú ý về an toàn lao động khi làm việc với EC ................ 16 1.4. Ethylen oxyd..................................................................................................... 17 1.4.1. Công thức, tính chất .................................................................................... 17 1.4.2. Ảnh hưởng đến sức khỏe con người ........................................................... 18 1.4.3. Những điều cần chú ý về an toàn lao động khi làm việc với EO................ 19 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................................ 20 2.1. Nguyên liệu ....................................................................................................... 20 2.2. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 21 2.3. Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 22 2.3.1. Xây dựng quy trình bán tổng hợp troxerutin từ rutin.................................. 22 2.3.2. Kiểm nghiệm troxerutin .............................................................................. 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 22 2.4.1. Phương pháp tổng hợp hóa học................................................................... 22 2.4.2. Xác định các thành phần có trong sản phẩm............................................... 22 2.4.3. Xác định cấu trúc sản phẩm ........................................................................ 24 2.4.4. Định lượng................................................................................................... 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................. 25 3.1. Nghiên cứu quy trình bán tổng hợp troxerutin ............................................ 25 3.1.1. Tiến hành bán tổng hợp troxerutin với tác nhân alkyl hóa là ethylen clorohydrin trên cơ sở phương pháp của Stevens ................................................. 25 3.1.2. Tiến hành bán tổng hợp troxerutin với tác nhân alkyl hóa là ethylen oxyd trên cơ sở phương pháp của F. De carvahho................................................ 32 3.1.3. Xác định thành phần của các sản phẩm thu được ....................................... 37 3.1.4. Xác định cấu trúc sản phẩm ........................................................................ 41 3.1.5. Đề xuất quy trình bán tổng hợp troxerutin .................................................. 44 3.2. Định lượng troxerutin trong sản phẩm ......................................................... 48 3.2.1. Xác định mất khối lượng do làm khô.......................................................... 48 3.2.2. Định lượng troxerutin trong sản phẩm ........................................................ 49 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................... 51 4.1. Về quy trình bán tổng hợp troxerutin ........................................................... 51 4.1.1. Về phản ứng bán tổng hợp .......................................................................... 51 4.1.2. Về quá trình tinh chế sản phẩm sau phản ứng............................................. 56 4.2. Về xác định thành phần hỗn hợp sản phẩm bằng HPLC ............................ 57 4.3. Về xác định cấu trúc sản phẩm chính............................................................ 58 4.3.1. Về phổ hồng ngoại ...................................................................................... 58 4.3.2. Về phổ khối lượng....................................................................................... 59 4.3.3. Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân .................................................................. 60 4.4. Về xác định hàm lượng troxerutin..................................................................... 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................... 65 1. KẾT LUẬN.......................................................................................................... 65 2. ĐỀ XUẤT............................................................................................................. 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN ACGHI CDCl3 CICAD 13 C-NMR Acid desoxyribonucleic Hội nghị các tổ chức vệ sinh công nghiệp của Mĩ (American Conference of Governmental Industrial Hygienists) Cloroform – d Văn bản thẩm định hóa chất (Concise Chemical Assessment Document) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) COSY Correlation Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid EC Ethylen clorohydrin ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) EO Ethylen oxyd EtOH Ethanol h Giờ (hour) HDL Lipoprotein tỉ trọng cao (High Density Lipoprotein) HMBC Heteronuclear Multiple Bonds Correlation 1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) HPLC HSQC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) Heteronuclear Single Quantum Correlation IARC IR IUPAC Cơ quan quốc tế nghiên cứu ung thư (International Agency for Research in Cancer) Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) Hiệp hội Hóa học Quốc tế (International Union of Pure and Applied Chemistry) l Lít LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) MeOH Methannol Viện quốc gia về an toàn sức khỏe lao động Mĩ NIOSH- US (National Institute for Occupational Safety and Health- United States) NTP- US Chương trình độc chất học quốc gia Mĩ (National Toxicology Program - United States) ppm Đơn vị phần triệu (parts per million) SKLM Sắc ký lớp mỏng SN2 T0nc US-EPA US- OSHA Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (Nucleophilic Substitution) Nhiệt độ nóng chảy Cơ quan bảo vệ môi trường Mĩ (United States Environmetal Protetion Agency) Cục quản lý sức khỏe và an toàn lao động Mĩ (United States Occupational Safety and Health Administration) UV Tử ngoại (Ultraviolet) UV-VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) VLDL Lipoprotein tỉ trọng rất thấp (Very Low Density Lipoprotein) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số biệt dược có chứa troxerutin của Việt Nam .............................. 11 Bảng 1.2. Một số biệt dược có chứa troxerutin trên thế giới ................................. 12 Bảng 1.3. Các cấp độ tiếp xúc với ethylen clorohydrin ......................................... 17 Bảng 1.4. Giới hạn cho phép tiếp xúc với EO của US-OSHA .............................. 19 Bảng 2.1. Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm.............. 20 Bảng 2.2. Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm............... 21 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin với tác nhân EC............................................... 26 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin với tác nhân EC............................... 27 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ mol EC/rutin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin.......................................................... 29 Bảng 3.4. Tính chất các sản phẩm (T1-T4) thu được sau tinh chế ........................ 31 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát sư ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin với tác nhân EO .............................................. 33 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ mol EO/rutin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp troxerutin.......................................................... 34 Bảng 3.7. Tính chất các sản phẩm (T5-T8) thu được sau tinh chế ........................ 36 Bảng 3.8. Kết quả chạy HPLC của T1 ................................................................... 39 Bảng 3.9. Kết quả chạy HPLC của T9 ................................................................... 40 Bảng 3.10. Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của T1 và T9 ................. 49 Bảng 3.11. Kết quả xác định hàm lượng troxerutin ................................................. 50 DANH MỤC CÁC HÌNH   Hình 3.1. Sắc kí đồ troxerutin đối chiếu (a) .......................................................... 38  Hình 3.2. Sắc kí đồ mẫu thử T650C (EC) ............................................................. 39  Hình 3.3. Sắc kí đồ mẫu thử T1............................................................................. 39  Hình 3.4. Sắc kí đồ mẫu thử T9............................................................................. 40  Hình 4.1. Phổ ESI-MS negative của chất T9......................................................... 59  Hình 4.2. Phổ 13C-NMR và DEPT của T9 ........................................................... 60  Hình 4.3. Phổ 1H-NMR giãn rộng vùng từ 3,04 – 4,96 ppm của T9 .................... 61  Hình 4.4. Phổ 1H-NMR giãn rộng vùng từ 5,11 – 7,84 ppm của T9 .................... 62  Hình 4.5. Phổ COSY giãn rộng của T9 ................................................................. 62  Hình 4.6. Phổ HMBC của T9 ................................................................................ 63  Hình 4.7. Một số tương tác chính trên phổ COSY ( ) và HMBC () của T9 ... 63      DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. Quy trình bán tổng hợp tri(hydroxyethyl) rutin..................................... 45  Sơ đồ 2. Quy trình bán tổng hợp troxerutin ......................................................... 47  ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thông báo năm 2010 của Hội tim mạch Việt Nam, hiện nay trên toàn thế giới bệnh tim mạch đã vượt xa các bệnh ung thư, nhiễm khuẩn nói chung và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong. Mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người tử vong do bệnh tim mạch và các biến chứng của nó [9]. Nếu không có một hành động tích cực thì đến năm 2015 sẽ có 20 triệu người trên toàn thế giới chết do bệnh tim mạch, tỉ lệ này tập trung nhiều ở các nước đang phát triển (khoảng 80%). Đứng trước những thách thức đó, các nhà khoa học trên thế giới đã và đang không ngừng nghiên cứu tìm ra các thuốc đặc trị cho các bệnh tim mạch. Rutin là một flavonoid có tác dụng làm bền và làm giảm tính thấm của mao mạch, giảm trương lực cơ và chống co thắt. Rutin được dùng chủ yếu để phòng những biến cố của bệnh xơ vữa động mạch, điều trị các trường hợp suy tĩnh mạch [5]. Từ trước đến nay, rutin được biết đến như một vị thuốc chữa trị rất tốt các bệnh liên quan đến mạch máu trong Đông y cũng như trong Tây y. Tuy nhiên nhược điểm của rutin là tan kém trong nước nên khó hấp thu và khó bào chế các dạng thuốc có khả năng hấp thu tốt. Để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học đã tìm ra một dẫn chất flavonoid cùng nhóm với rutin, dễ hấp thu và tác dụng dược lí mạnh hơn – đó là troxerutin. Troxerutin có ý nghĩa quan trọng trong điều trị suy tĩnh mạch mãn tính – một bệnh lý nguy hiểm và ngày càng trở nên phổ biến hơn ở nước ta cũng như trên thế giới. Chính vì vậy, việc nghiên cứu bán tổng hợp các hoạt chất có tác dụng điều trị tốt như troxerutin hiện đang rất được quan tâm. Troxerutin được bán tổng hợp từ rutin với tác nhân alkyl hóa là ethylenoxyd, ethylen-clohydrin. Việc bán tổng hợp troxerutin từ rutin đã được thực hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới như Anh, Mĩ, Trung Quốc, Nhật 1 Bản…Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa sản xuất được troxerutin, việc sử dụng troxerutin cho sản xuất dược phẩm trong nước là từ nguồn nguyên liệu nhập khẩu. Trước nhu cầu thực tế và tình hình sản xuất dược phẩm trong nước, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu bán tổng hợp troxerutin từ rutin” với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng được quy trình bán tổng hợp troxerutin từ rutin ở quy mô phòng thí nghiệm. 2. Bán tổng hợp được troxerutin đạt tiêu chuẩn hàm lượng theo dược điển Anh 2010. Với những mục tiêu trên, chúng tôi hi vọng khóa luận này sẽ là một nghiên cứu thăm dò để có thể ứng dụng sản xuất troxerutin ở quy mô pilot và tiến tới quy mô công nghiệp tại Việt Nam.                   2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN   1.1. Rutin 1.1.1. Công thức, tính chất Công thức cấu tạo - Công thức phân tử: C17H30O19. - Khối lượng phân tử: 610,52 đvC. -Theo sự phân loại dựa vào vị trí của gốc aryl thì rutin được xếp vào nhóm flavonol thuộc nhóm Euflavonoid [5]. Công thức cấu tạo như sau: OH O Flavonol Rutin Rutin 3D Tính chất - Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng hơi lục, để ra ánh sáng có thể màu hơi sẫm lại. Kết tinh hình kim vàng nhạt trong nước. Tinh thể ngậm 3 phân tử nước, trở thành khan sau khi sấy 12h ở 110oC dưới áp suất giảm 10 mm Hg. - Rutin khan rất dễ hút ẩm, rutin khan biến màu nâu ở 125oC, dẻo ở 195-197oC và phân hủy ở 214-215 oC [3]. - Năng suất quay cực [α]23D = +13,820. 3 Bột Rutin - Độ tan: dễ tan trong pyridin, tan trong methanol và các dung dịch kiềm loãng, hơi tan trong glycerin, khó tan trong ethanol nguội và isopropanol, thực tế không tan trong nước, aceton, ether, cloroform, ether dầu hỏa, benzen. - Điểm chảy: 2100C kèm theo phân hủy. - Phổ hấp thụ tử ngoại của rutin trong ethanol có cực đại hấp thụ ở bước sóng 259 ± 1nm và 362,5 ± 1; trong methanol là 359 nm. - Rutin có cấu trúc là một glycosid nên rất dễ bị thủy phân bởi enzym có trong dược liệu là rhamnodistase hoặc môi trường acid, nhiệt độ cao, dung dịch kiềm đặc ở nhiệt độ cao [3]. - Tác dụng với FeCl3 cho màu xanh lục [5]. - Tác dụng với H2SO4 đậm đặc: Acid H2SO4 nhỏ lên rutin cho màu vàng đậm [2].  Định tính - Đo phổ IR của chế phẩm, so sánh với phổ IR của rutin chuẩn. - Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong methanol và pha loãng thành 250,0 ml với cùng dung môi, lọc nếu cần. Pha loãng 5,0 ml dung dịch này thành 50,0 ml bằng methanol . Đo phổ hấp thụ tử ngoại trong khoảng từ 210 nm đến 450nm, dung dịch phải cho hai cực đại hấp thụ ở 257nm và 358 nm. Độ hấp thụ riêng ở bước sóng cực đại 358 nm phải đạt từ 305 đến 330, tính theo chế phẩm khan. - Phương pháp sắc kí lớp mỏng + Bản mỏng: Silica gel G + Dung môi khai triển: N-butanol/acid acetic khan/nước/methyl ethyl ceton/ethyl acetat = 5/10/10/30/50). + Dung dịch thử: Hòa tan 25 mg chế phẩm trong 10,0 ml methanol. + Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 25 mg rutin chuẩn 10,0 ml methanol. 4 + Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 10 cm. Để khô bản mỏng ngoài không khí. Phun lên bản mỏng hỗn hợp gồm 7,5 ml dung dịch kali fericyanid 1% và 2,5 ml dung dịch FeCl3 10,5%. Quan sát bản mỏng trong vòng 10 phút. Vết chính trên sắc kí đồ thu được của dung dịch thử tương ứng về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu [7, 17].  Định lượng - Hòa tan 0,200 g chế phẩm trong 20 ml dimethylformamid. Chuẩn độ bằng dung dịch tetrabutylamonihydroxyd 0,1 M. - Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ điện thế. 1ml dung dịch tetrabutylamonihydroxyd 0,1M tương đương với 30,53 mg rutin. - Yêu cầu: Chế phẩm chứa 95% - 101,0% rutin tính theo chế phẩm khan [7]. Bảo quản Đựng trong lọ kín, tránh ánh sáng [7]. 1.1.2. Nguồn nguyên liệu và phương pháp chiết 1.1.2.1. Nguồn nguyên liệu - Rutin có nhiều nhất trong cây hòe (Sophora japonica.L) họ đậu (Fabaceae). Nụ hoa hòe khô – Nguyên liệu Hoa hòe tươi chiết rutin 5 - Rutin có hầu hết trong các phần xanh của cây hòe nhưng hàm lượng cao nhất vẫn là ở nụ. Bình quân trong nụ hòe có khoảng 6 - 30% rutin [10], riêng nụ hòe ở nước ta hàm lượng rutin luôn ở mức cao 30 - 34% [8] (Hungari 12%, Pháp 10% [3]). - Dược điển Việt Nam III quy định trong nụ hòe làm nguyên liệu sản xuất rutin ít nhất là có 20% rutin [7]. - Ở nước ta, cây hòe được trồng ở một số tỉnh, nhưng nhiều nhất là ở Thái Bình [5].  Ngoài cây hòe còn có một số dược liệu khác chứa rutin: - Lúa mạch 3 góc (Fagopyrum esculentum Moench = Polygonum fagopyrum L., họ rau răm – Polygonaceae). Lá khô chứa 2-3% rutin. Hiện nay đã tạo ra được những chủng có hàm lượng 5-8% rutin. Tỉ lệ rutin cao ở cây trước khi ra hoa. - Bạch đàn (Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell). Hàm lượng rutin trong lá trung bình 10% và có thể đến 19% ở những lá non. - Táo ta (Ziziphus mauritiana Lamk) họ táo ta (Rhamnaceae). Lá khô chứa 1,5% rutin [5]. 1.1.2.2. Phương pháp chiết xuất Có nhiều phương pháp đã được sử dụng để chiết xuất rutin từ hoa hòe như: chiết xuất bằng nước [8], chiết xuất bằng ethanol [8], chiết xuất bằng dung dịch kiềm, chiết xuất bằng dung dịch kiềm có kết hợp siêu âm [3]. Qua các tài liệu tham khảo cho thấy rằng chiết xuất bằng dung dịch kiềm có sử dụng siêu âm cho hiệu suất chiết rutin cao nhất. 6 1.2. Troxerutin Dược điển Anh (2010) xác định: Troxerutin là hỗn hợp các dẫn xuất rutin hydroxyethyl hóa có chứa tối thiểu 80% tri-(hydroxyethyl) rutin, ngoài ra còn có dẫn xuất mono, bis, tetra-(hydroxyethyl) rutin. 1.2.1. Công thức, tính chất 1.2.1.1. Công thức thành phần chính của troxerutin: tri-(hydroxyethyl) rutin - Công thức phân tử: C33H42O19. - Khối lượng phân tử: 742,67 đvC. - Tên khoa học: 2 – [3, 4 – bis (2 – hydroxyethoxy) phenyl] – 5 – hydroxyl – 7 – (2 – hydroxyethoxy) – 4 – oxo – 4H – chromen – 3 – yl – 6 – O – (6 – deoxy – β – D –mannopyranosyl) – β – D – glucopyranoside. 1.2.1.2. Tính chất của troxerutin - Dạng bột màu vàng. - Tính tan: + Tan trong nước, glycerol, propylen glycol. + Không tan trong ether, benzen, cloroform, ethanol, methanol lạnh. - T0nc của hỗn hợp ≥ 80% tri-(hydroxyethyl) rutin: khoảng 1560C [29]. - T0nc của tri-(hydroxyethyl) rutin 1810C [17]. 7 Bột Troxerutin Định tính - Đo phổ IR trong vùng bước sóng từ 4000 - 650 cm-1, so sánh với phổ IR của troxerutin chuẩn. - Dùng sắc kí: Pic chính trong sắc kí đồ của mẫu thử tương ứng về vị trí và kích thước với pic chính của mẫu chuẩn [17]. Xác định các thành phần hỗn hợp - Dùng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Tiêu chuẩn cho phép: + Tỉ lệ thành phần chính: (tri-(hydroxyethyl)-rutin): ≥ 80%. + Tỉ lệ các thành phần khác: (mono-, bis-, tetra-(hydroxyethyl)-rutin) mỗi thành phần không quá 5%, có thể chấp nhận một thành phần không quá 10% [17]. Định lượng - Tiến hành theo phương pháp đo quang để xác định hàm lượng mẫu thử. - Yêu cầu: Chế phẩm chứa 95–105% troxerutin tính theo chế phẩm đã làm khô [17]. Bảo quản: - Đựng trong lọ kín, tránh ánh sáng [17]. 1.2.2. Tác dụng của troxerutin (Vitamin P4) - Troxerutin có tác dụng bảo vệ tĩnh mạch và mao mạch rất tốt, nhờ có đặc tính làm giảm tính thấm thành mạch, giảm phù, cải thiện vi tuần hoàn. - Troxerutin có tác dụng khử các gốc oxy và nitơ, góp phần bảo vệ tĩnh mạch. Troxerutin có tính khử mạnh, có thể vô hiệu hóa các gốc tự do. Với bệnh nhân xuất huyết thành mạch, troxerutin có thể giúp bảo vệ được màng tế bào thoát khỏi sự phá hoại bởi các gốc tự do. Nhờ đó, tăng được tính bền của thành mao mạch, chống được sự xuất huyết [8]. 8 - Troxerutin kết hợp với Aescin trong điều trị bệnh ù tai trong. Hiệu quả của sự kết hợp này đã được thử nghiệm trên 34 bệnh nhân. Sau 44 ngày điều trị, kết quả cho thấy 23/34 bệnh nhân được thay đổi ngưỡng hơn 10 dB (việc cải thiện ngưỡng nghe hơn 10 dB được cho là một cải thiện đáng kể) [33]. - Theo B.S. Adam và đồng nghiệp, sự kết hợp coumarin và troxerutin nâng cao hiệu quả trong điều trị bệnh suy tĩnh mạch so với việc chỉ sử dụng coumarin đơn độc [14]. - Troxerutin và quercetin được nghiên cứu trên 4 thí nghiệm thử đột biến gen. Kết quả cho thấy troxerutin không gây đột biến, quercetin cho phản ứng dương tính với các thử nghiệm đột biến gen. Sự thay thế 3 nhóm hydroxyethyl vào quercetin đã triệt tiêu khả năng gây đột biến gen của quercetin [27]. - Năm 2009, Shao-hua Fan và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng của troxerutin trên mô hình gây tổn thương thận bằng D-galactose ở chuột. Kết quả nghiên cứu cho thấy: + Troxerutin có tác dụng làm tăng hoạt động của các enzym chống oxy hóa như cytosolic Cu/Zn superoxid dismutase (SOD-1), catalase (CAT) và glutathion peroxidase (GPX); đồng thời troxerutin cũng có tác dụng làm giảm nồng độ malondialdehyd (MDA – sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid). + Troxerutin có tác dụng làm giảm biểu hiện của enzym COX-2 (cyclooxygenase -2). Từ những kết quả của nghiên cứu này cho thấy troxerutin có thể làm giảm bớt tổn thương thận gây ra bởi D-galactose thông qua cơ chế chống viêm và chống oxy hóa [32]. - Troxerutin được dùng điều trị trong bệnh tắc tĩnh mạch trung tâm võng mạc. Troxerutin có tác dụng chống kết tập tiểu cầu, giảm độ quánh của máu nên 9 được dùng điều trị lâu dài và dự phòng tai biến ở mắt thứ hai. Troxerutin cải thiện rõ ràng thị lực, phù hoàng điểm và tiến triển thiếu máu của bệnh [12]. - Năm 2010, các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ thần kinh của troxerutin. Kết quả cho thấy troxerutin có khả năng cải thiện nhận thức và có tác dụng bảo vệ thần kinh [23]. - Theo nghiên cứu của F. Squadrito cùng đồng sự thì sự kết hợp 150 mg troxerutin và 1,5 mg carbazochrom cho hiệu quả điều trị tốt và an toàn ở những bệnh nhân mắc trĩ [34]. - Năm 2011, các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu về tác dụng chống phóng xạ (tia γ) của troxerutin trên chuột và độc tính của troxerutin trên dòng tế bào V79. Kết quả của nghiên cứu cho thấy: + Troxerutin không có khả năng gây độc rõ ràng ở nồng độ dưới 20mg/ml. + Troxerutin có tác dụng chống tia phóng xạ do troxerutin làm tăng đáng kể tỉ lệ sống sót sau 30 ngày bị chiếu xạ (tia gamma) ở chuột nghiên cứu [41]. - Cũng trong năm 2011, Jun Lu đã tiến hành nghiên cứu tác dụng của troxerutin trên mô hình gây đái tháo đường typ 2 bằng chế độ ăn giàu cholesterol ở chuột. Trong nghiên cứu này, tác giả đánh giá hiệu quả của troxerutin đối với hiện tượng suy giảm nhận thức do sự kháng insulin ở não chuột thực nghiệm. Kết quả thu được từ nghiên cứu cho thấy troxerutin có khả năng phòng ngừa và điều trị bệnh suy giảm nhận thức do đái tháo đường typ 2 và bệnh Alzheimer [26]. - Năm 2013, nghiên cứu của các nhà khoa học Ấn Độ cho thấy rằng troxerutin có khả năng làm giảm đáng kể lượng VLDL, LDL và tăng HDL trong máu. Vì vậy, troxerutin đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết chuyển hóa cholesterol [25]. 10 - Trong nghiên cứu của Jun Lu cùng cộng sự (2012) cho thấy troxerutin có khả năng ức chế biểu hiện của enzym cyclin – dependent kinase I, tăng cường hoạt động của enzym phosphatase α dephosphorylation I dẫn đến ức chế sự suy giảm trí nhớ ở chuột thực nghiệm. Vì vây, troxerutin được đề cử như là một ứng viên tiềm năng trong phòng ngừa và điều trị bệnh thiếu hụt nhận thức và một số rối loạn não bộ khác [24]. 1.2.3. Một số sản phẩm troxerutin trên thị trường  Ở Việt Nam, troxerutin hiện đang được sử dụng với một số dạng biệt dược và xuất xứ của các sản phẩm này được trình bày trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Một số biệt dược có chứa troxerutin của Việt Nam Stt Tên thuốc Chiona 1 Dopolys-S 2 Ginkotin 3 Thành phần Công ty sản xuất Cao G. biloba 14mg TNHH dược phẩm Heptaminol 300mg Shinpoong Daewoo Troxerutin 300mg Việt Nam Cao G. biloba 14mg Công ty cổ phần Heptaminol 300mg xuất Troxerutin 300mg Domesco Cao G. biloba 14mg Công ty liên doanh Cao gingseng BV pharma nhập Dạng bào chế Viên nén bao phim khẩu Viên nang Viên nang Troxerutin 300mg 4 5 Nebivox Troxerutin 7g Neorutin Troxerutin 7g CT liên doanh BV pharma Công ty liên doanh BV pharma 11 Thuốc cốm Thuốc cốm  Trên thế giới troxerutin được sử dụng với nhiều dạng biệt dược, các dạng biệt dược này được trình bày trong bảng 1.2. Bảng 1.2. Một số biệt dược có chứa troxerutin trên thế giới Stt 1 Tên Thuốc Flebotrat 2 Ginkor fort 3 Ronacare troxerutin Troxerutin 4 5 6 7 8 9 Troxerutin injection Troxerutin ratiopharm 300 mg Troxerutin 200mg Troxeti Eye drop Troxevasin 10 Troxivenol 11 Venalot SR 12 Venoruton Thành phần Công ty sản xuất Coumarin Troxerutin Neckerman Industria Farmaceutica Dạng bào chế Viên nén Cao ginkgo biloba Heptaminol HCl Beaufour Ipsen Viên nang Troxerutine (Pháp) EMD Chemicals Kem bôi da Inc. Troxerutin 20mg Chema Elektromet Gel Troxerutin Chengdu PingYuan Medicine Co.,Ltd Ratiopharm Medikamente zum Schutz der Gefäße Syntenda SP. Z O.O. P.F.-CH Hanlim Pharm Co., Ltd (Hàn Quốc) BalkanpharmaRazgrad AD – Bungari Rotapharm Troxerutin 300 mg Troxerutin 200 mg Troxerutin (500 mg/10ml) Troxerutin 300mg Troxerutin Carbazochrom Coumarin Troxerutin Thuốc tiêm Viên nang Viên nang Dung dịch nhỏ mắt Viên nang Thuốc tiêm Viên nén Medica; Viên giải & phóng kéo dài Asta Schaper Brummer Mono-, di-, tri, Novatis –Thụy Sĩ tetrahydroxyrutosids   12 Gel Viên nang 1.2.4. Các phương pháp bán tổng hợp troxerutin từ rutin 1.2.4.1. Với tác nhân ethylen clorohydrin - Phương trình phản ứng:    + Cl-CH2CH2OH Xúc tác                                                                                                                                       Phương pháp Stevens + Tiến hành phản ứng: Cho rutin và nước vào bình phản ứng, hỗn hợp được khuấy trộn bằng máy khuấy từ. Thêm NaOH vào hỗn hợp phản ứng với tỉ lệ mol rutin/NaOH =1/3. Nâng nhiệt độ phản ứng lên 550C và nhỏ dần EC vào, tỉ lệ rutin/EC = 1/3. Tiếp tục nâng nhiệt độ phản ứng lên 750C và duy trì trong 2h. Phản ứng được thực hiện dưới bầu khí N2. + Kết thúc phản ứng: làm lạnh hỗn hợp phản ứng xuống dưới 200C và duy trì môi trường N2, dùng HCl 10 % điều chỉnh pH = 5. Dung dịch phản ứng được giữ trong tủ lạnh 24h, rutin chưa phản ứng sẽ tủa lại. Lọc loại rutin, dịch lọc được cất quay tới khô dưới áp suất giảm, cặn thu được hòa tan nóng trong methanol để loại bỏ phần muối không tan. Cất quay dung môi đến khô. Cặn thu được hòa tan nóng trong ethanol. Lọc lấy dung dịch, để kết tinh thu được sản phẩm [35]. 13  Phương pháp Frantisek Czech Cho rutin và methanol vào bình phản ứng. Thêm acid ascorbic hoặc Na2S2O5 làm chất xúc tác. Cho ethylen clorohydrin vào bình phản ứng. Nâng nhiệt độ của khối phản ứng lên 85-1000C và duy trì trong 2 giờ. Kết thúc phản ứng, làm lạnh khối phản ứng và điều chỉnh pH = 5 bằng dung dịch HCl loãng. Hỗn hợp được đem cất loại dung môi đến khô, phần cắn thu được hòa tan với ethanol và lọc lấy dịch lọc. Dịch lọc để kết tinh thu sản phẩm [21].  Phương pháp Vladimir Crech Tạo dạng hỗn dịch của rutin trong nước, sục khí N2 liên tục. Thêm dung dịch NaOH và nâng nhiệt độ của phản ứng lên 75 - 780C. Ethylen clorohydrin được cho vào, giữ nguyên nhiệt độ và duy trì phản ứng trong thời gian 2h. Sau đó khối phản ứng được acid hóa bằng HCl loãng (đưa về pH = 5). Để lạnh, rutin chưa phản ứng được kết tủa. Lọc loại rutin và cất dịch lọc đến khô. Hòa tan cắn thu được trong ethanol sôi, lọc nóng loại muối và để kết tinh dịch lọc. Lọc thu tinh thể, sấy, thu lấy sản phẩm [40]. 1.2.4.1. Với tác nhân ethylen oxyd - Phương trình phản ứng + Xúc tác                                                                                                                               14