Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất benzen, toluen, ethylbenzen và xylen lên biểu hiện của gen cyp2e1 ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI . TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -------***------- NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHÓM CHẤT BENZEN, TOLUEN, ETHYLBENZEN VÀ XYLEN LÊN BIỂU HIỆN CỦA GEN CYP2E1 Ở NGƯỜI LAO ĐỘNG CÓ TIẾP XÚC NGHỀ NGHIỆP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHÓM CHẤT BENZEN, TOLUEN, ETHYLBENZEN VÀ XYLEN LÊN BIỂU HIỆN CỦA GEN CYP2E1 Ở NGƯỜI LAO ĐỘNG CÓ TIẾP XÚC NGHỀ NGHIỆP Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS. BÙI PHƯƠNG THUẬN 2. PGS. TS. NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, khách quan, một phần đã công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành khác. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Hà Nội, ngày 6 tháng 11 năm 2020 Tác giả NCS. Nguyễn Thị Hiền i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện luận án Tôi đã nhận được sự dạy dỗ tận tình của các thầy cô, sự giúp đỡ động viên của đồng nghiệp gia đình và bạn bè. Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc Tôi xin chân thành cảm ơn: PGS. TS. Bùi Phương Thuận và PGS. TS. Nguyễn Quang Huy là những người Thầy hướng dẫn khoa học đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm để tôi có thể hoàn thành luận án. Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, nơi có những thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp đã tận tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, Bộ môn Di truyền học, Trung tâm nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Lãnh đạo Công ty TNHH Sơn Công nghiệp Hòa Phát, Công ty TNHH Công nghệ cao Việt Tiệp, Công ty cổ phần Sơn Tổng hợp Hà Nội và các công nhân của công ty đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Khoa học an toàn và Vệ sinh lao động, Lãnh đạo Trung tâm Sức khỏe nghề nghiệp và các đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ, ủng hộ tôi trong quá trình học tập và công tác. Cuối cùng, con xin cảm ơn bố mẹ, cảm ơn các thành viên đại gia đình yêu quý, xin gửi lời cảm ơn đến các anh em, bạn bè đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ động viên tôi trong quá trình học tập vừa qua. Hà Nội, ngày 6 tháng 11 năm 2020 NCS. Nguyễn Thị Hiền ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Chữ viết tắt ACGIH American conference of governmental industrial hygienists - Hội nghị các nhà vệ sinh công nghiệp của Chính phủ Hoa Kỳ BEI Biological exposure index - Chỉ số tiếp xúc sinh học BNN Bệnh nghề nghiệp BYT Bộ Y tế BTEX Benzen, Toluen, Ethylbenzen, Xylen Cre Creatinin CI Confidence interval - Khoảng tin cậy cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid ĐTNC Đối tượng nghiên cứu dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid KTX Không tiếp xúc HA Axit hippuric HP Công ty TNHH Sơn công nghiệp Hòa phát HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng hiệu năng cao GHCP Giới hạn cho phép GC/FID GC/MS IARC Gas Chromatography - Flame Ionization Detector - Sắc ký ion hóa ngọn lửa Chromatography Mass Spectrometry - Sắc ký khí khối phổ International Agency for Research on Cancer - Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế L Lít LC/MS Liquid chromatography - Mass spectrometry - Sắc ký lỏng khối phổ iii Tên đầy đủ Chữ viết tắt NIOSH National Institute for Occupational Safety and Health - Viện An toàn và Sức khoẻ nghề nghiệp Quốc gia Mỹ NLĐ Người lao động NAD(P)H Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate OSHA PCR qPCR Occupational safety and health administration - Cục an toàn và Sức khỏe nghề nghiệp Mỹ Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp Quantitative Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp định lượng TX Tiếp xúc TAE Tris-acetate-EDTA TNHH Trách nhiệm hữu hạn TCYT Tổ chức y tế TCCP Tiêu chuẩn cho phép TTMA Axit t,t-muconic RE Restriction enzym - Enzym cắt giới hạn SNPs Đa hình đơn nucleotide STH Công ty cổ phần Sơn Tổng hợp S Styren SD Độ lệch chuẩn VOCs Volatile organic compounds - Hợp chất hữu cơ dễ bay hơi VT Công Ty TNHH Công nghệ cao Việt Tiệp iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ..................................................................................................................v DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ix DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ xii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của luận án ................................................................................. 1 2. Mục tiêu..................................................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu luận án ............................................................................ 2 4. Những đóng góp mới của luận án ..................................................................... 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ....................................................... 3 6. Địa điểm thực hiện luận án ............................................................................... 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................................4 1.1. KHÁI NIỆM DUNG MÔI HỮU CƠ, TÍNH CHẤT CỦA BENZEN, TOLUEN, ETHYLBENZEN VÀ XYLEN .....................................................4 1.1.1. Dung môi hữu cơ ......................................................................................... 4 1.1.2. Tính chất lý – hóa của benzen, toluen, ethylbenzen, xylen ........................ 4 1.2. GIÁM SÁT SINH HỌC .....................................................................................7 1.3. ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI HỮU CƠ ĐẾN SỨC KHỎE CON NGƯỜI ..............................................................................................................8 1.3.1. Ảnh hưởng của benzen ................................................................................ 9 1.3.2. Ảnh hưởng của toluen ................................................................................. 9 1.3.3. Ảnh hưởng của ethylbenzen ...................................................................... 10 1.3.4. Ảnh hưởng của xylen ................................................................................ 10 1.3.5. Ảnh hưởng của nhóm BTEX..................................................................... 11 v 1.4. ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE, ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN CYP2E1 VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN...................................................................13 1.4.1. Đa hình đơn nucleotide (SNP) .................................................................. 13 1.4.2. Đặc điểm của gen CYP2E1 và một số nghiên cứu liên quan .................... 14 1.5. Nghiên cứu liên quan đến mức độ biểu hiện mRNA và đa hình của CYP2E1 ...................................................................................................... 18 1.6. Một số nghiên cứu có liên quan tại Việt Nam ............................................. 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................24 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .........................................................................24 2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ...................................................................................25 2.2.1. Hóa chất..................................................................................................... 25 2.2.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu ..................................................................... 26 2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG .................................................................26 2.3.1. Cách chọn mẫu nghiên cứu và cỡ mẫu ..................................................... 26 2.3.2. Phương pháp phân tích nồng độ BTEX trong mẫu cá nhân ..................... 28 2.3.3. Lấy mẫu, bảo quản mẫu ............................................................................ 30 2.3.4. Phương pháp phân tích nồng độ BTEX trong máu, nước tiểu của đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 31 2.3.5. Phương pháp phân tích sản phẩm chuyển hóa của BTEX trong nước tiểu ............................................................................................................. 32 2.3.6. Phương pháp phân tích công thức máu ..................................................... 34 2.3.7. Tách chiết DNA tổng số ............................................................................ 34 2.3.8. Phương pháp khuếch đại gen bằng phương pháp PCR ............................. 35 2.3.9. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự.................................................. 36 2.3.10. Tách chiết RNA tổng số .......................................................................... 36 2.3.11. Tổng hợp cDNA ...................................................................................... 37 vi 2.3.12. Phương pháp xác định mức độ biểu hiện mRNA bằng kỹ thuật Realtime PCR ............................................................................................................. 37 2.3.13. Phân tích thống kê sinh học .................................................................... 39 2.4. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU..............................................................................40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...............................41 3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..........................................41 3.2. NỒNG ĐỘ BTEX TRONG MẪU CÁ NHÂN ...............................................42 3.2.1. Nồng độ benzen tại cơ sở nghiên cứu ....................................................... 42 3.2.2. Nồng độ toluen tại cơ sở nghiên cứu ........................................................ 45 3.2.3. Nồng độ ethylbenzen tại cơ sở nghiên cứu ............................................... 47 3.2.4. Nồng độ xylen tại cơ sở nghiên cứu.......................................................... 49 3.2.5. Giới hạn nồng độ tiếp xúc với BTEX của nhóm tiếp xúc......................... 50 3.3. NỒNG ĐỘ BTEX TRONG MÁU VÀ NƯỚC TIỂU ....................................53 3.3.1. Nồng độ BTEX trong máu của đối tượng nghiên cứu .............................. 53 3.3.2. Nồng độ BTEX niệu của đối tượng nghiên cứu........................................ 55 3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SẢN PHẨM CHUYỂN HÓA CỦA BTEX ........ 56 3.4.1. Sản phẩm chuyển hóa của benzen niệu ..................................................... 56 3.4.2. Sản phẩm chuyển hóa của toluen niệu ...................................................... 57 3.4.3. Sản phẩm chuyển hóa của xylen niệu ....................................................... 59 3.4.4. Sản phẩm chuyển hóa của ethylbenzen niệu ............................................. 60 3.5. ẢNH HƯỞNG CỦA BTEX ĐẾN BIỂU HIỆN mRNA CỦA CYP2E1 ........64 3.5.1. Ảnh hưởng của BTEX đến mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 ......... 65 3.5.2. Mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 chia theo tuổi đời ....................... 67 3.5.3. Mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 chia theo tuổi nghề ..................... 73 3.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện mRNA của CYP2E1 qua mô hình hồi quy logistic.................................................................................................. 79 vii 3.6. MỐI TƯƠNG QUAN CỦA NỒNG ĐỘ BTEX TRONG MẪU CÁ NHÂN VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC TRONG CƠ THỂ ............................. 83 3.6.1. Mối tương quan của nồng độ benzen trong mẫu cá nhân với nồng độ benzen trong máu, nước tiểu, TTMA và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1.. 83 3.6.2. Mối tương quan của nồng độ toluen trong môi trường với nồng độ toluen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của toluen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 ................................................................................... 85 3.6.3. Mối tương quan của nồng độ xylen trong môi trường với nồng độ xylen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của xylen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 ................................................................................... 87 3.6.4. Mối tương quan của nồng độ ethylbenzen trong mẫu cá nhân với nồng độ ethylbenzen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của ethylbenzen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 ...................................................... 89 3.6.5. Mối tương quan giữa nồng độ giới hạn tiếp xúc của BTEX với sản phẩm chuyển hóa của từng chất trong nhóm BTEX và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 ................................................................................................ 91 3.6.6. Mối tương quan giữa nồng độ giới hạn tiếp xúc của BTEX và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 chia theo vị trí làm việc .................................... 95 3.7. XÁC ĐỊNH SỰ BIẾN ĐỔI CỦA GEN CYP2E1 ...........................................96 3.7.1. Khuếch đại và tinh sạch đoạn promoter của CYP2E1 .............................. 96 3.7.2. Giải trình tự và phân tích đa hình đoạn promoter của gen CYP2E1 ......... 97 3.8. TÌNH TRẠNG THIẾU MÁU DO TIẾP XÚC VỚI BTEX ..........................109 KẾT LUẬN ............................................................................................................117 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................118 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ................119 ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...................................................119 PHỤ LỤC .............................................................................................................. - 1 - viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu ........................................................ 24 Bảng 2.2. Các cặp mồi được dùng cho nghiên cứu .............................................. 25 Bảng 3.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu .................................................... 41 Bảng 3.2. Nồng độ benzen trong môi trường theo vị trí làm việc ........................ 42 Bảng 3.3. Nồng độ toluen trong môi trường chia theo vị trí làm việc ................. 46 Bảng 3.4. Nồng độ ethylbenzen ở nhóm tiếp xúc chia theo vị trí làm việc ......... 48 Bảng 3.5. Nồng độ xylen trong môi trường chia theo vị trí làm việc................... 49 Bảng 3.6. Giới hạn nồng độ tiếp xúc với BTEX của nhóm tiếp xúc theo vị trí ... 51 Bảng 3.7. Tổng hợp kết quả phân tích nồng độ BTEX và giới hạn nồng độ BTEX cho phép tại cơ sở nghiên cứu............................................................... 52 Bảng 3.8. Nồng độ BTEX trong máu ................................................................... 53 Bảng 3.9. Nồng độ benzen, toluen, ethylbenzen, xylen trong nước tiểu.............. 55 Bảng 3.10. Kết quả phân tích nồng độ TTMA trong nước tiểu ........................... 56 Bảng 3.11. Kết quả phân tích nồng độ O-cresol trong nước tiểu ......................... 58 Bảng 3.12. Kết quả phân tích nồng độ mHA trong nước tiểu .............................. 59 Bảng 3.13. Kết quả phân tích nồng độ MA, PGA trong nước tiểu ...................... 61 Bảng 3.14. Kết quả phân tích sản phẩm chuyển hóa của BTEX trong nước tiểu 62 Bảng 3.15. Số đối tượng có chỉ số giám sát sinh học vượt tiêu chuẩn ................. 63 Bảng 3.16. Kết quả phân tích biểu hiện mRNA của CYP2E1.............................. 65 Bảng 3.17. Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm tuổi đời 20 - 30 tuổi ............ 68 Bảng 3.18. Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm tuổi đời 31 - 40 tuổi ............ 69 Bảng 3.19. Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm tuổi đời từ 41 - 50 tuổi........ 70 Bảng 3.20. Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm tuổi đời trên 50 tuổi ............ 71 Bảng 3.21. Mức biểu hiện mRNA của CYP2E1 theo tuổi đời ở nhóm tiếp xúc .. 72 Bảng 3.22. Mức biểu hiện mRNA của CYP2E1 theo tuổi đời nhóm không tiếp xúc ............................................................................................................... 73 ix Bảng 3.23. Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề 3 - 10 năm ...... 74 Bảng 3.24. Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề 11 - 20 năm .... 75 Bảng 3.25. Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề 21 - 30 năm .... 76 Bảng 3.26. Biểu hiện mRNA của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề trên 30 năm .... 77 Bảng 3.27. Mức biểu hiện mRNA của CYP2E1 theo tuổi nghề nhóm tiếp xúc... 78 Bảng 3.28. Mức biểu hiện mRNA của CYP2E1 theo tuổi nghề nhóm không tiếp xúc ......................................................................................................... 78 Bảng 3.29. Phân tích hồi quy logistic đơn biến mối liên quan giữa mức độ biểu hiện mARN của gen CYP2E1 với một số yếu tố .................................. 81 Bảng 3.30. Mối tương quan của nồng độ benzen trong mẫu cá nhân với nồng độ benzen trong máu, nước tiểu, TTMA ................................................... 84 Bảng 3.31. Mối tương quan của nồng độ toluen trong môi trường với nồng độ toluen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của toluen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 .............................................................. 86 Bảng 3.32. Mối tương quan của nồng độ xylen trong môi trường với nồng độ xylen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của xylen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 ...................................................................... 88 Bảng 3.33. Mối tương quan của nồng độ ethylbenzen trong mẫu cá nhân với nồng độ ethylbenzen trong máu, nước tiểu, sản phẩm chuyển hóa của ethylbenzen và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1........................ 90 Bảng 3.34. Mối tương quan giữa nồng độ giới hạn tiếp xúc của BTEX với sản phẩm chuyển hóa của từng chất trong nhóm BTEX và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 .............................................................................. 92 Bảng 3.35. Mối tương quan giữa nồng độ giới hạn tiếp xúc của BTEX và mức độ biểu hiện mRNA của CYP2E1 .............................................................. 95 Bảng 3.36. Tần số các đa hình, tần số các alen trong quần thể nghiên cứu ......... 99 x Bảng 3.37. Kết quả phân tích biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở điểm đa hình 3739 G>C ở nhóm tiếp xúc ................................................................. 107 Bảng 3.38. Kết quả phân tích biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở điểm đa hình 3468 T>A ở nhóm tiếp xúc ................................................................. 107 Bảng 3.39. Kết quả phân tích biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở điểm đa hình 3519 T>G ở nhóm tiếp xúc ................................................................. 108 Bảng 3.40. Số lượng đối tượng nghiên cứu suy giảm các dòng tế bào máu ...... 110 Bảng 3.41. Ảnh hưởng của BTEX đến một trong ba dòng tế bào máu .............. 111 Bảng 3.42. Mối liên quan của tần số alen của các đa hình được phát hiện với tình trạng thiếu máu do ảnh hưởng của dung môi hữu cơ ......................... 113 Bảng 3.43. Mối liên quan của tần số kiểu gen của các đa hình được phát hiện với tình trạng thiếu máu do ảnh hưởng của dung môi hữu cơ .................. 114 xi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu ....................................................................................... 29 Hình 3.1. Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở các đối tượng nghiên cứu .......................... 66 Hình 3.2. Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi đời ≤ 30 tuổi ........................ 69 Hình 3.3. Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi đời từ 31 - 40 tuổi ............... 70 Hình 3.4. Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi đời từ 41 - 50 tuổi ............... 71 Hình 3.5. Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi đời trên 50 tuổi .................... 72 Hình 3.6. Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề từ 3 đến 10 năm .......... 74 Hình 3.7. Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề từ 11 - 20 năm ............ 75 Hình 3.8. Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề từ 21 - 30 năm ............ 76 Hình 3.9. Mức độ biểu hiện của CYP2E1 ở nhóm có tuổi nghề trên 30 năm ................. 77 Hình 3.10. Sản phẩm PCR được tinh sạch ...................................................................... 97 Hình 3.11. Alen G của chuỗi CYP2E1 ở mẫu được giải trình tự với mồi ngược, tương ứng với alen C của CYP2E1 3739 G> C ...................................................... 100 Hình 3.12. Các alen A của chuỗi CYP2E1 của mẫu được giải trình tự với mồi ngược, tương ứng với alen T của CYP2E1 3620 C> T ............................................ 101 Hình 3.13. Alen C của chuỗi CYP2E1 của mẫu được giải trình tự với mồi ngược lại, tương ứng với alen G của CYP2E1 3519 T> G ........................................... 102 Hình 3.14. Các alen T của chuỗi CYP2E1 của mẫu được giải trình tự với mồi ngược lại, tương ứng với alen A của CYP2E1 3468 T> A ........................................... 103 xii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Dung môi hữu cơ là một nhóm các chất hữu cơ có khả năng hòa tan các chất khác nhau. Dung môi này chứa nhiều loại hydrocarbon kích thước nhỏ, bay hơi vào môi trường không khí tạo thành các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi (Volatile organic compounds VOCs). VOCs nói chung, một số chất như benzen, toluen, ethylbenzen, xylen (nhóm BTEX) nói riêng với đặc điểm về khả năng hòa tan và độ bay hơi cao, được sử dụng trong sản xuất nhựa tổng hợp, sản xuất sơn, keo dán. Đặc biệt, đối với ngành sản xuất sơn việc sử dụng dung môi hữu cơ nhóm BTEX là rất phổ biến. Nhóm chất này có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người lao động như giảm sức nghe, gây bệnh điếc nghề nghiệp, giảm chức năng hô hấp, một số bệnh về da,… Đặc biệt benzen, toluen là những chất có thể gây ung thư. Mặc dù, benzen đã được hạn chế sử dụng và thay thế bằng nhóm toluen, ethylbenzen, xylen (TEX) có độ độc thấp hơn, nhưng trong các ngành công nghiệp có sử dụng dung môi hữu cơ nói chung, đặc biệt đối với ngành sản xuất sơn có nguồn nguyên liệu chính là nhóm TEX vẫn còn một lượng benzen nhất định. Chính vì thế, người lao động trong ngành sơn vẫn thường xuyên phải tiếp xúc với nhóm BTEX, những chất này khi thấm nhiễm vào cơ thể gây ảnh hưởng đến biểu hiện của gen mã hóa cho cytochrome P450 2E1 là gen CYP2E1. Gen CYP2E1 mã hoá cho enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa của VOCs [74], styren [44], vinyl chloride monomer [114] và nhiều chất độc khác bao gồm cả các tiền chất gây ung thư. Mối liên quan giữa phơi nhiễm BTEX trong môi trường và mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 là hướng nghiên cứu đang được quan tâm. Mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở người lao động làm việc trong môi trường có BTEX được coi là chỉ dấu sinh học mới để giám sát người lao động có tiếp xúc với dung môi hữu cơ [74]. Nhiễm độc benzen và các đồng đẳng của benzen (nhóm BTEX) đã được Việt Nam công nhận là bệnh nghề nghiệp. Giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với 1 trong 4 dung môi trên đã được xác định, nhưng mỗi chỉ số giám sát sinh học chỉ được sử dụng cho từng dung môi riêng rẽ; trong khi đó, người lao động khi 1 tiếp xúc với dung môi hữu cơ thường là một nhóm chất. Ở Việt Nam, số lượng người lao động thường xuyên phải tiếp xúc với BTEX ở các ngành như da giày, điện tử, in ấn là khá cao, đặc biệt cao trong ngành sản xuất sơn. Tuy nhiên việc nghiên cứu chỉ số giám sát sinh học cho người lao động tiếp xúc với nhóm chất như BTEX chưa được quan tâm. Nghiên cứu về ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp đã có nhưng chưa nhiều, chưa sâu, đa phần các nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc khảo sát: nồng độ ô nhiễm, hiện trạng sức khỏe của công nhân. Để nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của dung môi hữu cơ nói chung và ảnh hưởng của BTEX nói riêng đến người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp, đặc biệt mong muốn tìm ra chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc với BTEX, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất benzen, toluen, ethylbenzen và xylen lên biểu hiện của gen CYP2E1 ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp”. 2. Mục tiêu - Xác định được mức độ thấm nhiễm của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp tại cơ sở nghiên cứu. - Xác định được ảnh hưởng của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen lên biểu hiện gen CYP2E1 ở đối tượng nghiên cứu. 3. Nội dung nghiên cứu luận án - Xác định được mức độ thấm nhiễm của BTEX ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp. + Xác định nồng độ BTEX trong môi trường lao động của đối tượng nghiên cứu. + Xác định nồng độ axit t,t muconic (TTMA), O-cresol, methylhippuric (mHA), axit mandelic (MA) và axit phenylglyoxylic (PGA) trong nước tiểu. TTMA, Ocresol, MA + PGA và mHA lần lượt là sản phẩm chuyển hóa của benzen, toluen, ethylbenzen và xylen. + Xác định nồng độ của BTEX trong máu, nước tiểu của đối tượng nghiên cứu. 2 - Xác định biểu hiện của gen CYP2E1 của người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp qua mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1. - Đánh giá ảnh hưởng của BTEX đến mức độ biểu hiện của gen CYP2E1. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu đánh giá đồng thời mức độ tiếp xúc, thấm nhiễm của một nhóm chất BTEX ở công nhân có tiếp xúc nghề nghiệp tại Việt Nam, có 82,19% đối tượng nghiên cứu có giới hạn nồng độ tiếp xúc với nhóm BTEX vượt tiêu chuẩn cho phép. Luận án là công trình nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của nhóm BTEX đến biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 ở người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp tại Việt Nam. Nhóm tiếp xúc có mức độ biểu hiện mARN của gen CYP2E1 cao hơn nhóm không tiếp xúc 10,47 lần, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Luận án đã đánh giá thực trạng tiếp xúc, thấm nhiễm của người lao động trong một số cơ sở sản xuất sơn với nhóm chất BTEX. Kết quả nghiên cứu của luận án làm cơ sở dữ liệu cho Bộ Y tế đưa ra quy định đầy đủ về các chỉ số giám sát môi trường, giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với nhóm chất này. Luận án đã phát hiện ảnh hưởng của nhóm BTEX làm tăng biểu hiện mRNA của gen CYP2E1, mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2E1 có tương quan tuyến tính với tổng giá trị tiếp xúc của nhóm BTEX. Kết quả nghiên cứu của luận án làm cơ sở khoa học cho việc đề xuất sử dụng chỉ số mRNA của gen CYP2E1 làm chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc đồng thời với nhóm chất BTEX. 6. Địa điểm thực hiện luận án Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Trung tâm Sức khỏe Nghề nghiệp, Trạm quan trắc môi trường Lao động Viện khoa học An toàn và Vệ sinh lao động. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. KHÁI NIỆM DUNG MÔI HỮU CƠ, TÍNH CHẤT CỦA BENZEN, TOLUEN, ETHYLBENZEN VÀ XYLEN 1.1.1. Dung môi hữu cơ Dung môi hữu cơ là một nhóm các chất hóa học, khác nhau về cấu trúc nhưng có chung các đặc tính quan trọng như tồn tại ở dạng lỏng và dễ bay hơi ở nhiệt độ thường, có thể gây độc đối với hệ thần kinh trung ương nếu tiếp xúc thời gian dài, trong môi trường công nghiệp với nồng độ cao [18]. Hiện nay, dung môi hữu cơ được sử dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sơn, da giày... một số dung môi như toluen (T), ethylbenzen (E), xylen (X) là những chất phổ biến. Bên cạnh đó, benzen (B) là dung môi đã bị cấm sử dụng trong công nghiệp, tuy nhiên rất khó để có thể loại trừ hoàn toàn benzen vì trong thành phần của toluen, ethylbenzen hoặc xylen thường chứa một lượng benzen nhất định. Người lao động làm việc trong các ngành công nghiệp có sử dụng VOCs thường chịu ảnh hưởng đồng thời của nhiều chất, đặc biệt là nhóm benzen, toluen, ethylbenzen và xylen (BTEX) [64, 69, 78, 111]. 1.1.2. Tính chất lý – hóa của benzen, toluen, ethylbenzen, xylen Benzen là chất lỏng không màu, khối lượng riêng 0,8786 g/cm³, điểm nóng chảy 5,5 °C, nhiệt độ sôi 80,1 °C, độ hòa tan trong nước 1,79 g/L ở 25 °C, dễ bay hơi, tan ít trong nước nhưng dễ hòa tan trong dầu khoáng cũng như trong dầu, mỡ động vật, dầu thực vật. Trong công nghiệp, benzen được dùng để tổng hợp các chất hữu cơ như nitrobenzen, anilin, phenol... và được sử dụng để hòa tan các nguyên liệu cao su, sơn, hóa chất trừ sâu hay dùng để tẩy mỡ ở xương, da, sợi vải, len, dạ và các dụng cụ có chất mỡ bám bẩn... [17, 20]. Tuy nhiên, việc sử dụng benzen hiện nay đã được hạn chế và benzen đã được thay bằng toluen – chất ít độc hơn. Mặc dù vậy, trong toluen vẫn chứa một phần benzen thường là 5% [19]. Công thức hóa học của benzen là C6H6 còn công thức cấu tạo là: 4 Toluen là chất lỏng không màu, nhẹ, dễ bay hơi, khối lượng riêng 0,8669 g/cm³, điểm nóng chảy -93 °C, nhiệt độ sôi 110,6 °C, độ hòa tan trong nước 0,053 g/100 mL (20-25 °C). Toluen được tách từ dầu mỏ, nhựa, than hoặc sản phẩm tổng hợp. Toluen được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp để tổng hợp các chất hữu cơ như clorua benzyl, benzyliden, cloramin và trinitrotoluen. Toluen hòa tan được nhiều chất nên được sử dụng trong công nghệ sơn, sản xuất dược phẩm, vecni, mực, keo, da giày... [21, 24]. Công thức hóa học của toluen là C7H8, còn công thức cấu tạo có 01 vòng benzen và 01 nhóm - CH3 Ethylbenzen là chất lỏng không màu, dễ cháy, có mùi tương tự xăng, khối lượng riêng 0,867 g/cm3, điểm nóng chảy -95 oC, nhiệt độ sôi 136 oC, độ hòa tan trong nước 0,015 g/100 mL (20 oC). Ethylbenzen là một hợp chất hữu cơ có công thức C6H5CH2CH3. Ethylbenzen có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp hóa dầu, như một chất trung gian trong sản xuất styren, tiền thân của polystyren, một chất dẻo được sử dụng phổ biến. Ethylbenzen được tiêu thụ trong sản xuất styren, sử dụng để tạo ra các hóa chất khác trong nhiên liệu ví dụ như dung môi trong mực, chất kết dính cao su, sơn dầu và sơn. Loại xylen công nghiệp có chứa khoảng 20% [23], thậm chí có thể đạt đến 40,4% ethylbenzen [22]. Ethylbenzen xuất hiện lẫn trong các dung môi hữu cơ khác, phổ biến trong môi trường của ngành sản xuất sơn [22]. Công thức hóa học của ethylbenzen là C8H10 còn công thức cấu tạo là: Xylen là chất lỏng không màu, khối lượng riêng 0,864 g/mL, điểm nóng chảy -47,4 °C, nhiệt độ sôi 138,5 °C, không tan trong nước. Xylen trong công nghiệp được dùng trong công nghệ sơn, vecni, da giày, matit, điều chế dược phẩm, làm tăng chỉ 5 số octan của xăng máy bay. Xylen là loại dung môi tốt đối với parafin, là nguyên liệu chính trong ngành sản xuất sơn [23]. Công thức hóa học là C8H10, công thức cấu tạo của xylen là: Đường xâm nhập của BTEX vào cơ thể Dung môi hữu cơ là chất lỏng dễ bay hơi nên chủ yếu xâm nhập vào cơ thể con người theo đường hô hấp. Đây là con đường gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất đến sức khỏe con người, đặc biệt đối với NLĐ có tiếp xúc nghề nghiệp [21, 28, 29, 36, 38, 69, 79, 101, 102]. Ngoài ra, BTEX còn có thể xâm nhập qua đường da, qua đường tiêu hóa (nhưng rất hiếm gặp với trường hợp qua đường tiêu hóa). Chuyển hóa và đào thải BTEX trong cơ thể Khi dung môi hữu cơ xâm nhập vào cơ thể, chúng sẽ được đào thải nhanh chóng. Nếu như ion kim loại xâm nhập vào cơ thể có thể tồn tại vài tháng, thậm chí vài năm thì dung môi hữu cơ có thể đào thải gần hết trong vài giờ. Khi xâm nhập vào cơ thể, tùy chất cụ thể sẽ được chuyển hóa thành sản phẩm khác nhau rồi đào thải ra ngoài qua đường tiết niệu. Một phần sẽ được đào thải ngay ra ngoài môi trường thông qua con đường hô hấp [20 - 23, 38]. Đối với BTEX, một phần thải ra ngoài qua đường hô hấp. Phần còn lại được chuyển hóa và thải ra ngoài qua đường nước tiểu. Trong quá trình chuyển hóa dung môi hữu cơ đặc biệt là nhóm BTEX thì cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) có vai trò đặc biệt quan trọng, mặt khác thì dung môi hữu cơ này có thể gây ảnh hưởng đến cấu trúc DNA của gen CYP2E1 [15, 74, 92]. 6