Tài liệu Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung tế bào và hormone lên sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––– HỨA NGUYỆT MAI NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG BỔ SUNG TẾ BÀO VÀ HORMONE LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI LỢN THỤ TINH ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Bùi Xuân Nguyên Thái Nguyên, 2012 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày 30 tháng 7 năm 2012 Tác giả Hứa Nguyệt Mai Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Bùi Xuân Nguyên - nguyên Trưởng phòng Công nghệ phôi - Viện công nghệ sinh học đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến tập thể cán bộ phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt là TS. Nguyễn Thị Ước đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý cho tôi trong quá trình thực hiện những thí nghiệm liên quan đến luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn những tình cảm quý báu đó. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô trong ban chủ nhiệm Khoa, các anh chị trong Khoa Khoa học Sự sống - trường Đại học Khoa học đã luôn tạo điều kiện, quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình tôi học tập, nghiên cứu. Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình, đồng nghiệp và các bạn bè của tôi đã có những khích lệ tinh thần và những quan tâm sâu sắc trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Tác giả Hứa Nguyệt Mai Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................ii MỤC LỤC ............................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN ................................................ vi DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................vii MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. Sự hình thành và phát triển phôi in vivo ............................................................. 3 1.1.1. Sự thụ tinh ................................................................................................ 3 1.1.2. Quá trình thụ tinh ...................................................................................... 4 1.1.3. Những yếu tố đảm bảo xảy ra sự thụ tinh ................................................... 5 1.1.4. Sự phát triển của phôi in vivo ..................................................................... 6 1.1.5. Sự làm tổ của phôi .................................................................................... 8 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của phôi in vitro ................................... 9 1.2.1. Thụ tinh trong ống nghiệm............................................................................... 9 1.2.2. Buồng trứng ............................................................................................ 10 1.2.3. Loại nang trứng ....................................................................................... 11 1.2.4. Quá trình nuôi thành thục trứng và các hormone bổ sung .......................... 12 1.2.5. Hệ thống nuôi phôi .................................................................................. 13 1.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................................... 19 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 21 2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 21 2.2. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................................... 21 2.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 2.3.1. Dụng cụ, thiết bị ...................................................................................... 21 2.3.2. Hóa chất, môi trường .............................................................................. 22 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 23 2.4.1. Phương pháp thu, bảo quản và vận chuyển buồng trứng ............................ 23 2.4.1.2. Phương pháp phân loại phẩm chất trứng ................................................ 23 2.4.2. Phương pháp thu tế bào nguyên bào sợi phôi chuột (Mouse Embryonic Fibroblast- MEF) .................................................................................... 25 2.4.3. Phương pháp thu cụm tế bào màng trong ống dẫn trứng ........................... 27 2.4.4. Phương pháp nuôi phôi và đánh giá sự phát triển của phôi ........................ 28 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 30 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 31 3.1. Kết quả nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi từ bào thai chuột ............................. 31 3.2. Nghiên cứu phân lập, nhân nuôi tế bào màng trong ống dẫn trứng .................. 34 3.2.1. Kết quả thu tế bào màng trong ống dẫn trứng............................................... 34 3.2.2. So sánh ảnh hưởng thời gian quay của cụm tế bào lên chất lượng của cụm tế bào thu được và cụm tế bào sau giải đông ...................................... 36 3.3. Kết quả bổ sung hormone lên tỷ lệ trứng thành thục ........................................ 37 3.4. Kết quả nuôi phôi từ các hệ thống môi trường ................................................. 39 3.4.1. Hệ thống 1 (HT1) .................................................................................... 39 3.4.2. Hệ thống 2 (HT2) .................................................................................... 40 3.4.3. Hệ thống 3 (HT3) .................................................................................... 41 3.4.4. Hệ thống 4 (HT4) .................................................................................... 43 3.5. So sánh kết quả tạo phôi từ các hệ thống .......................................................... 44 3.5.1. So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 1, hệ thống 2 và hệ thống 3 ................... 44 3.5.2. So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 2 và hệ thống 4 ..................................... 45 3.5.3. So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 1, 2, 3 và hệ thống 4 ............................. 46 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 49 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 51 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ........ 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium Môi trường DM FPP Fertilization promoting peptide Peptide thúc đẩy sự thụ tinh FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh bò FSH Follicle stimulating hormone Hormon kích thích nang phát triển IVC In Vitro Culture Nuôi cấy trong ống nghiệm IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh trong ống nghệm IVP In Vitro Production Sản xuất trong ống nghiệm IVM In Vitro Maturation Sự thành thục trong ống nghiệm LH Luteinsing Stimulating Hormone Hormon tăng trưởng MAT Maturation Thành thục NCSU - 23 North Carolina State University 23 Đại học phía Bắc bang Carolina 23 NCSU - 37 North california state university 37 Đại học phía Bắc bang Carolina 37 PBS Phosphate Buffer Saline Dung dịch đệm POSP Porcine oviductal secretory protein Ống dẫn trứng lợn tiết ra protêin PMSG Pregnant mare’s serum gonadotropin Huyết thanh ngựa chửa TCM Tissue Culture Medium Môi trường nuôi cấy ZP Zone Pellucide Màng trong suốt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Tên bảng Trang 2.1 Các dụng cụ, thiết bị dùng trong thí nghiệm 21 2.2 Nội dung và chi tiết thí nghiệm 29 3.1 Kết quả thu tế bào nguyên bào sợi thai chuột từ các bào thai chuột 31 3.2 Kết quả tốc độ nhân nuôi tế bào tươi và tế bào sau giải đông 32 3.3 3.4 Ảnh hưởng chất lượng vòi trứng đến tỷ lệ các cụm tế bào màng trong vòi trứng thu được Kết quả theo dõi thời gian quay của các cụm tế bào thu được và cụm tế bào sau giải đông 34 36 3.5 Kết quả nuôi trứng thành thục 38 3.6 Kết quả tạo phôi trong môi trường cơ bản 40 3.7 3.8 3.9 Kết quả tạo phôi trong môi trường có bổ sung tế bào nguyên bào sợi thai chuột Kết quả tạo phôi trong môi trường có bổ sung tế bào màng trong vòi trứng Nuôi phôi trong môi trường bổ sung tế bào nguyên bào sợi thai chuột và tế bào màng vòi trứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 41 42 43 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Sự phát triển của hợp tử giai đoạn 2 phôi bào đến giai đoạn phôi dâu 7 1.2 Cơ quan sinh sản của lợn cái 8 2.1 Buồng trứng lợn và phân loại các tế bào trứng 25 2.2 Các bước thu cụm tế bào màng trong vòi trứng 28 3.1 Kết quả nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi thai chuột 33 3.2 Biểu đồ tỷ lệ cụm tế bào màng trong vòi trứng ở các nhóm thí nghiệm 35 3.3 Kết quả nhân nuôi tế bào màng trong vòi trứng 37 3.4 Trứng MAT II và thể cực 39 3.5 Biểu đồ so sánh tỷ lệ phôi phát triển từ HT1, HT2, HT3 44 3.6 Biểu đồ so sánh tỷ lệ phôi phát triển từ HT2 và HT4 45 3.7 Biểu đồ so sánh tỷ lệ phôi phát triển từ HT1, HT2, HT3 và HT4 46 3.8 Kết quả tạo phôi từ các hệ thống nuôi phôi 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay, công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học sinh sản nói riêng đã rất phát triển và đạt nhiều thành tựu quan trọng, đem lại nhiều ý nghĩa và lợi ích thiết thực trong cuộc sống. Một trong những thành tựu nổi bật nhất của công nghệ sinh học là sự kiện nhân bản vô tính thành công (1997) với sự ra đời của cừu Dolly. Còn trong sinh sản hữu tính thành tựu quan trọng nhất là tạo phôi trong ống nghiệm, phôi là nguồn vật liệu quan trọng trong chuyển cấy phôi tạo nguồn động vật đồng loạt, phục vụ cho các thử nghiệm trong y học, hoặc nhằm mục đích nâng cao năng suất vật nuôi trong chăn nuôi. Nước ta là nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển, song cũng là một điểm nóng về bảo vệ đa dạng sinh học nói chung và nguồn gen các giống lợn nói riêng. Trong vòng đời sinh sản của một con vật, chu kỳ sống của chúng có loài chỉ sinh ra 4-5 con cái thông qua sinh sản bình thường, trong khi thông qua thụ tinh ống nghiệm có thể tạo ra 50-80 con cái trong chu kỳ sống của chúng. Vì vậy thụ tinh ống nghiệm giữ vai trò quan trọng trong việc tạo ra nhiều động vật với số lượng lớn và đặc tính gen cũng sẽ được cải thiện đáng kể. Kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trên động vật nói chung và kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trên lợn nói riêng đã có nhiều nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển phôi, nhưng vấn đề quan tâm nhiều nhất đó là việc nghiên cứu bổ sung, thay thế các chất khác nhau vào các môi trường cơ bản ban đầu. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng có lợi của đồng nuôi cấy đến sự phát triển của phôi như cải thiện chất lượng phôi, tăng tỷ lệ phát triển của phôi vào giai đoạn phôi nang [32], [64]. Bổ sung môi trường nuôi cấy với tế bào đệm như tế bào màng trong ống dẫn trứng là yếu tố tăng cường sự phát triển của phôi lợn trong ống nghiệm [14], [48]. Các nguyên bào sợi phôi chuột đã được sử dụng trong đồng nuôi cấy, nguyên bào sợi phôi chuột tiết ra các yếu tố nhằm nâng cao sự phát triển của phôi, cho kết quả tốt đối với sự phát triển của phôi bò và cừu [36], [47]. Cho đến nay các vấn đề về việc nghiên cứu môi trường tối ưu để có chất lượng phôi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 phát triển tốt đã được cải thiện phần nào. Ở Việt Nam, việc nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm các trứng lợn đã được thực hiện từ những năm đầu của thế kỷ 21 [3], [6]. Một số nghiên cứu đã được tiến hành trên đối tượng trứng và phôi lợn in vitro [4] [7], [9]. Tuy nhiên tỷ lệ thành thục của trứng và tỷ lệ tạo phôi vẫn còn thấp so với tỷ lệ chung trên thế giới. Nguyên nhân của hiện tượng này vẫn chưa được làm sáng tỏ. Việc nghiên cứu cải thiện hệ thống nuôi phôi in vitro bằng cách bổ sung các loại tế bào đệm như nguyên bào sợi thai chuột hay tế bào màng trong ống dẫn trứng nhằm nâng cao chất lượng phát triển cho các phôi động vật nói chung và phôi lợn nói riêng là cần thiết cho việc ứng dụng công nghệ này trong nghiên cứu và sản xuất. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung tế bào và hormone lên sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm’’. 2. Mục tiêu của đề tài - Đánh giá được ảnh hưởng của việc bổ sung hormone, bổ sung tế bào màng trong ống dẫn trứng và nguyên bào sợi thai chuột vào môi trường nuôi phôi lên kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn. - Thu nhận được các kết quả thí nghiệm cần thiết về sản xuất và bảo quản tế bào, chế độ bổ sung tế bào nhằm góp phần nâng cao hiệu quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn. 3. Nội dung nghiên cứu - Thu trứng, nuôi thành thục trứng in vitro trong môi trường cơ bản và môi trường có bổ sung hormone. - Thu và nhân nuôi tế bào màng trong ống dẫn trứng từ ống dẫn trứng lợn. - Thu và nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi từ bào thai chuột. - Nuôi phôi trong môi trường cơ bản, môi trường có bổ sung tế bào màng vòi trứng và nguyên bào sợi phôi chuột. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN PHÔI IN VIVO Phôi lợn bắt đầu phát triển sau khi thụ thai - thời điểm của tinh trùng lợn đực thâm nhập vào các bức tường tế bào trứng của lợn cái. Trong thời gian từ 14 đến 16 giờ, các tế bào thụ tinh đã bắt đầu chia tách vào trong tế bào nhỏ hơn (blastomeres) bởi nguyên phân. Vào ngày thứ hai hoặc thứ ba của thai kỳ, túi phôi nguyên thủy này đã thông qua từ màng ống dẫn trứng vào một trong hai vòi trứng của lợn nái, nơi mà nó sẽ tiếp tục phát triển cho đến khi nó bắt đầu để gắn vào niêm mạc tử cung vào ngày 11 hoặc 12 [1]. 1.1.1. Sự thụ tinh Sự tạo ra cá thể mới bắt đầu bằng sự thụ tinh. Sự thụ tinh là sự kết hợp giữa noãn (giao tử cái) và tinh trùng (giao tử đực) để tạo hợp tử. Hợp tử là cá thể mới phát sinh và phát triển ở giai đoạn sớm nhất. Ở động vật, bình thường sự thụ tinh xảy ra ở 1/3 phần đầu vòi trứng [1]. Noãn trước khi thụ tinh: Khi được phóng thích ra khỏi buồng trứng, noãn được bọc từ trong ra ngoài bởi màng trong suốt và các lớp tế bào nang (tế bào vòng tia) của gò noãn. Lúc này, noãn đang ở kỳ đầu lần phân chia thứ 2 của quá trình giảm phân, tức là noãn bào 2. Nếu không gặp tinh trùng, sự thụ tinh không xảy ra, noãn sẽ bị thoái hóa và bị thực bào bởi các đại thực bào. Noãn bào 2 không tự chuyển động được, sự di chuyển của nó trong vòi trứng nhờ 3 yếu tố: sự co bóp của lớp cơ vòi trứng, sự nhu động của các lớp vi lông của lớp tế bào niêm mạc vòi trứng và sự vận chuyển cuốn theo dòng dịch trong vòi trứng [5]. Tinh trùng trước khi thụ tinh: Sau khi được hình thành trong ống sinh tinh, lúc này tinh trùng có hình dạng đặc trưng nhưng chưa có khả năng di động. Từ ống sinh tinh, tinh trùng tới mào tinh. Sự trưởng thành của tinh trùng chủ yếu xảy ra trong mào tinh: sự loại bớt bào tương và các bào quan không cần thiết để giúp tinh trùng chuyển động nhanh, ít tốn năng lượng. Ðầu tinh trùng cũng thay đổi, đặc biệt là hình dạng và kích thước cực đầu. Tinh trùng tăng dần khả năng di động khi di chuyển từ phần đầu đến phần đuôi mào tinh. Nhờ có đuôi, tinh trùng có thể tự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 chuyển động trong đường sinh dục cùng với sự trợ giúp do sự co thắt của tầng cơ đường sinh dục. *Sự tương tác trước khi kết hợp trứng và tinh trùng: Nhiều cơ chế đã được phát hiện cho thấy có sự đảm bảo để các tế bào sinh dục gặp nhau đúng lúc và đúng vị trí trong điều kiện thuận lợi khi thụ tinh ở động vật. Như vậy, có một sự sắp xếp hoàn hảo trong sự tương tác giữa cá thể đực và cá thể cái và giữa trứng và tinh trùng. Ở nhiều loài sinh vật, trứng tiết ra một chất hóa học nhằm thu hút tinh trùng về phía trứng. Ở động vật có vú và các loài động vật khác, tinh trùng phải xảy ra một loạt các biến đổi sinh hóa trước khi thụ tinh với trứng. Tinh trùng muốn xuyên thủng màng sáng của trứng đòi hỏi phải trải qua quá trình biến đổi gọi là tiềm năng hóa (capacitation) [2], [5]. 1.1.2. Quá trình thụ tinh Với cấu trúc của noãn sau rụng trứng, muốn lọt vào bào tương của noãn để kết hợp với noãn tạo ra hợp tử (cá thể mới), tinh trùng phải lần lượt vượt qua 3 chướng ngại vật, từ ngoài vào trong gồm: lớp tế bào nang, màng trong suốt, màng tế bào của noãn [1]. Sau khi tinh trùng dính chặt vào trứng, tinh trùng xuyên thủng vỏ trứng nhờ một loại men phân giải vỏ trứng gọi là enzym lytic nằm trên lớp vỏ của thể đỉnh. Màng sinh chất của tinh trùng tiếp xúc với màng sinh chất của trứng. Sau khi màng sinh chất tiếp xúc xảy ra, trứng và tinh trùng kết hợp nhau tạo màng sinh chất hỗn hợp là một hiện tượng của sự thụ tinh. * Tinh trùng vượt qua màng trong suốt: Một số tinh trùng có thể tiếp xúc với màng trong suốt. Khi tiếp xúc với các thụ thể trên bề mặt màng trong suốt, phản ứng cực đầu xảy ra, các enzym bên trong túi cực đầu của tinh trùng được phóng thích. Các enzym này làm tiêu hủy protein của màng trong suốt tại chỗ tiếp xúc cùng với tác động xuyên phá của đầu tinh trùng giúp tinh trùng xuyên thủng được màng trong suốt đi vào khoang quanh noãn và tiếp xúc với màng noãn [5]. *Tinh trùng lọt vào bào tương của noãn: Khi tinh trùng vượt qua màng trong suốt tới tiếp xúc với màng noãn, màng tế bào bọc tinh trùng sáp nhập với Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 màng tế bào bọc noãn. Ở nơi tiếp xúc, màng tế bào của noãn và tinh trùng bị tiêu đi, nhân và bào tương của tinh trùng lọt vào bào tương của noãn để lại màng tế bào nằm bên ngoài noãn[5]. Sự xâm nhập của một tinh trùng đầu tiên vào noãn kích thích hàng loạt các phản ứng sinh học từ noãn gọi là phản ứng vỏ của noãn. Noãn sẽ tiết vào khoang quanh noãn một chất làm thay đổi cấu trúc màng trong suốt, do đó ngăn cản sự xâm nhập của các tinh trùng khác, những thay đổi này gọi là phản ứng màng trong suốt. Những thay đổi của màng trong suốt được xem như để tạo ra sự phóng bế thứ phát (sự phóng bế muộn) hiện tượng đa thụ tinh. Khi tinh trùng lọt vào bào tương của noãn, noãn bào 2 tiếp tục hoàn tất lần phân chia thứ hai của quá trình giảm phân để sinh ra noãn chín, còn gọi là tiền nhân cái và cực cầu 2. Bào tương của tinh trùng hòa lẫn với bào tương của noãn, nhân của tinh trùng gọi là tiền nhân đực. Tiền nhân đực và tiền nhân cái tiến lại gần nhau, lượng DNA trong mỗi tiền nhân tăng lên gấp đôi và ngay sau đó màng của các tiền nhân biến đi, các thể nhiễm sắc xoắn lại, ngắn đi và dày lên và được phóng thích vào bào tương. Một thoi không màu xuất hiện, thể nhiễm sắc được sắp xếp trên thoi không màu [1], [2]. Mỗi thể nhiễm sắc con tiến về một cực tế bào, một rãnh phân chia ngày càng sâu xuất hiện trên mặt trứng. Kết quả trứng thụ tinh đã phân làm 2 phôi bào. * Kết quả của thụ tinh: - Sự kết hợp giữa 2 tế bào sinh dục đực và cái đã biệt hóa cao độ tạo ra tế bào sinh dưỡng kém biệt hóa, có khả năng phân chia tích cực. - Sự thụ tinh khôi phục lại ở tế bào sinh dưỡng ấy bộ thể nhiễm sắc lưỡng bội đặc trưng cho loài. - Nhờ thụ tinh, cá thể mới sinh ra mang đặc tính di truyền của cả cha lẫn mẹ. - Sự thụ tinh khơi mào cho hàng loạt quá trình gián phân liên tiếp xảy ra. 1.1.3. Những yếu tố đảm bảo xảy ra sự thụ tinh - Yếu tố thời gian: nói chung, ở mọi loài động vật, noãn và tinh trùng có đời sống rất ngắn. Nếu không gặp trứng, tinh trùng sẽ tự thoái hóa. Trứng khi vào vòi trứng thường có khả năng thụ tinh trong vòng 24 giờ. Nếu không gặp tinh trùng, trứng sẽ tự thoái hóa [5]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 - Số lượng tinh trùng ở lợn trong mỗi lần giao phối: + Tối đa là 680ml, tối thiểu là 50ml + 80 - 180 triệu tinh trùng là tinh dịch bình thường. + < 80 triệu tinh trùng là tinh dịch xấu, khả năng thụ tinh cho noãn kém. - Tỷ lệ tinh trùng bất thường trong tinh dịch: + Tinh dịch được coi là bình thường nếu chứa không quá 20% tinh trùng bất thường. + Tinh trùng bất thường chiếm 20 - 40%, khả năng thụ tinh kém. >40%, khả năng thụ tinh rất kém. Sức sống và khả năng hoạt động của tinh trùng: sức sống và năng lực hoạt động của tinh trùng được biểu lộ bằng sự chuyển động nhờ cái đuôi của nó. Ở người, tinh trùng còn chuyển động được 50 giờ sau khi phóng thích vào âm đạo là tinh trùng khỏe, những tinh trùng yếu thường chết sau 15 phút. Tinh dịch tốt phải chứa 80% tinh trùng chuyển động sau khi phóng thích vào âm đạo 1 giờ hoặc 50% sau 12 giờ hoặc 25% sau 28 giờ. Nếu tỷ lệ % đó giảm nhiều, khả năng thụ tinh rất kém [1], [5]. Những yếu tố ảnh hưởng đến sức sống và năng lực của tinh trùng: PH môi trường, nồng độ CO2 trong môi trường, nhiệt độ,…. 1.1.4. Sự phát triển của phôi in vivo Quá trình thụ tinh hoàn tất dẫn đến quá trình hình thành phôi ở dạng một tế bào. Sau đó, phôi bắt đầu phân chia thành dạng 2, 4, 8, và 16 tế bào. Các blastomer này ngày càng được phân chia nhiều hơn, nhỏ hơn và kết hợp lại thành khối rắn chắc được gọi là phôi dâu (morula), lúc này rất khó nhìn thấy từng tế bào trong phôi, khối tế bào chiếm gần hết không gian của trứng. Sau đó, phôi tiếp tục phát triển hình thành dạng phôi nang (blastocyst) và có sự tích lũy chất dịch bên trong tạo khối cầu rỗng. Tiếp đó, blastocyst qua giai đoạn phôi nang trương nở, và thoát khỏi màng trong suốt ở giai đoạn thoát nang rồi bắt đầu làm tổ trong tử cung [1]. Sự phân chia trứng thụ tinh: Khi hợp tử đạt tới giai đoạn 2 phôi bào, khoảng 30 giờ sau thụ tinh, trứng thụ tinh tiến hành hàng loạt quá trình gián phân nối tiếp nhau liên tục làm cho số lượng phôi bào tăng lên nhanh chóng. Qua mỗi lần gián phân, kích thước mỗi phôi bào sinh ra trở nên nhỏ hơn. Vào khoảng cuối ngày thứ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 3 hoặc đầu ngày thứ 4 sau thụ tinh, trứng thụ tinh gồm 12 - 16 phôi bào, mặt ngoài xù xì giống quả dâu nên gọi là phôi dâu. Cấu tạo của phôi dâu gồm: một nhóm tế bào nằm ở vị trí trung tâm có kích thước lớn hơn gọi là đại phôi bào, còn những tế bào tạo thành một lớp bao quanh phía ngoài có kích thước nhỏ hơn gọi là tiểu phôi bào [1], [5]. Những đại phôi bào sau này sẽ tạo phôi và một số bộ phận phụ của phôi như màng ối, túi noãn hoàng, niệu nang. Tiểu phôi bào sẽ tạo lá nuôi, sau này sẽ phát triển thành rau thai và màng bọc thai. (Nguồn: Drost, 1983) Hình 1.1. Sự phát triển của hợp tử giai đoạn 2 phôi bào đến giai đoạn phôi dâu Sự phân chia trứng thụ tinh xảy ra trong quá trình trứng di chuyển từ vòi trứng đến tử cung. Các tế bào nang vây quanh noãn bị thoái hóa dần dần, màng trong suốt vẫn tồn tại trong thời gian phân chia trứng và giai đoạn phôi dâu rồi cuối cùng biến mất. Giai đoạn phôi nang: Ở động vật, vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh, trứng (ở giai đoạn phôi dâu) đã lọt vào khoang tử cung và bị vùi trong chất dịch do nội mạc tử cung tiết ra. Chất dịch thấm qua màng trong suốt vào các khoảng gian bào của đại phôi bào để nuôi trứng. Dần dần các khoảng gian bào hợp lại và cuối cùng tạo thành một khoang xen giữa lớp tiểu phôi bào và khối đại phôi bào, khoang này dần dần lớn lên và gọi là khoang phôi nang hay khoang dưới mầm vì mầm phôi được tạo ra nằm phía trên nó. Màng trong suốt hoàn toàn biến mất, khối tế bào trung tâm của phôi dâu, các đại phôi bào bị khoang phôi nang đẩy dần về một cực của trứng và lồi vào khoang dưới mầm được gọi là cực phôi. Cực phôi chính là mầm của phôi và cực đó gọi là cực phôi vì ở đó phôi sẽ phát triển. Còn cực đối lập gọi là cực đối phôi. Tiểu phôi bào của lớp ngoại vi của phôi dâu dẹt lại tạo nên thành của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 khoang phôi nang, trứng thụ tinh ở giai đoạn này giống như một cái túi nên gọi là phôi nang và giai đoạn phát triển này của trứng gọi là giai đoạn phôi nang [2]. 1.1.5. Sự làm tổ của phôi Phôi lọt vào khoang tử cung vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh và phôi ở vào giai đoạn cuối phôi dâu hoặc đầu phôi nang. Khi phôi vào đến khoang tử cung, phôi tiếp tục sống và phân chia trong môi trường dịch tiết của nội mạc tử cung vài ngày trước khi làm tổ. Màng trong suốt có tác dụng bảo vệ phôi trong giai đoạn đầu sẽ tự tiêu. Phôi lọt vào nội mạc tử cung rồi bám vào đó để phát triển, người ta nói trứng làm tổ trong nội mạc tử cung [1]. Phôi làm tổ vào khoảng ngày thứ 6 sau thụ tinh, lúc bấy giờ trứng đang ở giai đoạn phôi nang và niêm mạc tử cung đang ở giai đoạn trước kinh và sẽ tiếp tục phát triển. Ở cực phôi của trứng, lá nuôi được tạo ra từ các tiểu phôi bào sẽ bám vào nội mạc tử cung, vượt qua lớp biểu mô tử cung tiến vào lớp đệm, phá hủy mô tử cung xung quanh để toàn bộ trứng lọt dần vào niêm mạc tử cung. Sự phá hủy mô tử cung là do những enzym tiêu protein được tiết ra bởi những tế bào lá nuôi [5]. (Theo Wittingham, 1979) Hình 1.2. Cơ quan sinh sản của lợn cái Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 Bình thường trứng làm tổ ở thành sau hoặc thành trước tử cung. Trong trường hợp bất thường, trứng có thể làm tổ ở gần lỗ trong ống tử cung hoặc ở ngoài tử cung (chửa ngoài tử cung) như: trong khoang bụng (thường gặp ở túi cùng Douglas, mạc nối lớn, các quai ruột), trên bề mặt buồng trứng, trong vòi trứng. Trứng làm tổ lạc chỗ ít khi có thể phát triển tới đúng kỳ hạn, phôi thường chết và mẹ thường xuất huyết nghiêm trọng. Trong các trường hợp chửa ngoài tử cung, chửa ở vòi trứng hay gặp nhất, vòi trứng sẽ vỡ trong khoảng tháng thứ 2 của thời kỳ phôi gây xuất huyết nghiêm trọng cho mẹ [5]. Thời gian mang thai ở lợn là 112- 115 ngày và mỗi lợn nái có thể đẻ 1 lứa là 7-12 con. Cũng như sự phát triển của các loài động vật mang thai, phôi lợn phát triển trong thời gian dài, do đó độ tuổi của phôi có thể được tính gần đúng theo chiều dài: 11mm - 21 ngày, 17mm - 35 ngày, 2,8cm - 49 ngày, 4.0cm - 56 ngày, 22 cm - 100 ngày, 30 cm - sinh [1]. 1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI IN VITRO 1.2.1. Thụ tinh trong ống nghiệm Thụ tinh trong ống nghiệm là quá trình do con người tiến hành kết hợp giữa tinh trùng với trứng để tạo ra hợp tử, được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ. Sau đó, hợp tử được chuyển vào tử cung để phát triển thành cá thể. Sau khi IVM thành công trên một số loài thì các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục nghiên cứu về kỹ thuật IVF. IVF đã thành công trên rất nhiều loài động vật như chó, lợn, bò, thỏ,… Thụ tinh trong ống nghiệm bắt đầu vào những năm 1930 với tế bào trứng thỏ, những nỗ lực đầu tiên để thụ tinh trong ống nghiệm đã không thành công, sau đó những nghiên cứu vào cuối những năm 1950 đã thành công khi ra đời con thỏ. Năm 1959, Chang lần đầu tiên thành công trong việc cho thụ tinh giữa tinh trùng và trứng động vật có vú (thỏ) trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đây được xem là thành tựu quan trọng nhất trong lịch sử phát triển của thụ tinh trong ống nghiệm. Nó chứng tỏ trứng và tinh trùng của động vật có thể thụ tinh được bên ngoài cơ thể [24]. Từ sau thí nghiệm này thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu trên nhiều loại động vật khác nhau. Trong cuối những năm 1960, bằng những tế bào trứng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 của con người, lần đầu tiên trong lịch sử nhân loại bé gái Louise Brown ra đời bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh vào năm 1978 [60]. Năm 1982, bé gái thứ hai Amadine ra đời bằng công nghệ này ở Pháp, những năm 80 của thế kỷ XX, kỹ thuật IVF phát triển mạnh. Singapore là nơi thực hiện thành công thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ở châu Á vào năm 1983. Kể từ đó, kỹ thuật IVF là kỹ thuật phổ biến để điều trị vô sinh trên đối tượng người. Người ta ước tính rằng 4 triệu trẻ em đã được sinh ra bằng cách sử dụng kỹ thuật thụ này trên thế giới [16]. Lợn là động vật được quan tâm đặc biệt vì trong buồng trứng của chúng có chứa số lượng lớn (hơn 200.000) các nang trứng sơ cấp. Trong những năm đầu thập kỷ 1980, người ta đã thu được các phôi in vitro từ các con lợn ở dạng “động vật cho” và các phôi trên có thể nuôi phát triển từ giai đoạn 4 tế bào đến giai đoạn phôi nang. Sau đó, những hiểu biết về đặc điểm phát triển của trứng lợn đã giúp hình thành các loại môi trường nuôi trứng chín trong điều kiện in vitro [26]. Năm 1986, Cheng và đồng tác giả đã thành công trong việc tạo phôi cừu và lợn bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm vào đầu những năm 1986 [25]. Trong năm 1990 những phát triển mới đã có những thành công trong điều kiện nuôi cấy cải thiện sự phát triển phôi đến giai đoạn túi phôi. Và sau đó số lượng phôi trâu, bò trong ống nghiệm được tạo ra hàng loạt, đặc biệt ở lợn và ngựa, đã có những thành công và những nghiên cứu được áp dụng hiệu quả [21]. Đến nay, khả năng tạo được động vật con từ quá trình thụ tinh trong ống nghiệm của trứng nuôi chín in vitro đã thành công. Tuy nhiên, khả năng nuôi phôi in vitro đến giai đoạn túi phôi phục vụ quy trình tạo phôi với số lượng nhiều vẫn chưa hoàn chỉnh. Do đó, mục tiêu chính của thập kỷ qua là tập trung vào nghiên cứu nhiều loại môi trường nuôi phôi in vitro. 1.2.2. Buồng trứng Nhìn chung, buồng trứng của lợn trước thành thục về tính được thu ở lò mổ là nguồn tế bào trứng chính cho các kỹ thuật IVP. Buồng trứng được chuyển về Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 phòng thí nghiệm trong 0,9% nước sinh lý hay PBS có bổ sung kháng sinh trong vài giờ. Nhiệt độ vận chuyển và thời gian từ khi buồng trứng được thu đến khi hút tế bào trứng có thể ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng. Vì thế, duy trì khả năng sống của tế bào trứng trong quá trình này là cực kỳ quan trọng để đạt được việc nuôi chín tế bào trứng thành công. Walterss và Graves (1998) đã kiểm tra các nhiệt độ bảo quản buồng trứng khác nhau (5, 16, 25, và 370C) và thời gian bảo quản khác nhau (2, 6, 10, 14 và 26 giờ) đến việc nuôi chín tế bào trứng sau đó. Ở tất cả các mức nhiệt độ đã kiểm tra, tế bào trứng chín đã giảm đáng kể khi thời gian bảo quản kéo dài [62]. Hơn 75% tế bào trứng chín hoàn toàn khi bảo quản đến 5 giờ ở 250C. Bảo quản 5 giờ ở nhiệt độ cao hơn hay thấp hơn 250C có ảnh hưởng xấu đến khả năng chín hoàn toàn của tế bào trứng và dường như nó có tác động xấu đến khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng. Tế bào trứng bò thu từ buồng trứng bảo quản 8 giờ ở 370C tạo ra một số lượng phôi ít hơn so với buồng trứng bảo quản ở 250C sau khi IVM và IVF [65]. Vì thế, dường như có thể chấp nhận việc vận chuyển buồng trứng ở 250C và thu tế bào trứng trong vòng 5 giờ có khả năng chín hoàn toàn và có khả năng phát triển sau khi thụ tinh. 1.2.3. Loại nang trứng Buồng trứng lợn có nang trứng có các đường kính khác nhau với những dao động được phân loại là nhỏ (<3mm), trung bình (3-6mm), hay lớn (>6mm). Nhìn chung, tế bào trứng được hút từ những nang trứng có kích thước trung bình cho các kỹ thuật IVM. Ở lợn, nang trứng biệt hoá hoàn toàn ở những nang trứng có đường kính 0,5mm đi kèm với tế bào trứng chỉ đạt 3/4 kích thước cuối cùng của nó [43]. Những tế bào này bị hạn chế khi nuôi chín nhân trong ống nghiệm. Các tế bào trứng đạt tới kích thước đầy đủ của chúng ở những nang trứng nhỏ có đường kính 2-3mm. Hầu hết các tế bào trứng của những nang trứng này bắt đầu chín nhưng dừng lại ở pha giữa I (metaphase 1-M 1) của sự phân bào giảm nhiễm. Khả năng hoàn thành chuyển tiếp M 1 thành M 2 có thể đạt được ở những tế bào trứng đã đạt tới kích thước đầy đủ của chúng và đã chặt hạch nhân[44]. Khả năng của các tế bào trứng hồi phục lại và hoàn thành phân bào giảm nhiễm không đạt tới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 cùng một thời điểm của sự phát triển noãn nang nhưng đạt được từng bước. Trong số những tế bào trứng có mặt trong nang trứng, chỉ những tế bào trứng phát triển đầy đủ sẽ phản ứng với những kích thích gây chín và gây ra những thay đổi về chức năng và hình thái, bao gồm cả việc tiếp tục lại phân bào giảm nhiễm. Một tỷ lệ thấp các tế bào trứng lợn (62%) lấy từ những nang trứng < 3mm sẽ đạt tới giai đoạn M 2 [12]. Tuy nhiên, 82 và 94% tế bào trứng lợn chín hoàn toàn khi lấy từ những nang trứng từ 3-6mm và >6mm tương ứng. Có điều thú vị là chỉ 16 và 38% tế bào trứng lấy từ những nang trứng có đường kính <3mm và 3-6mm, tương ứng, có tế bào cumulus dãn nở, nhưng tất cả tế bào trứng từ những nang trứng có đường kính >6mm có tế bào cumulus dãn nở. Tế bào trứng bò từ những nang trứng lớn hơn có khả năng phát triển tốt hơn so với những nang trứng nhỏ hơn. Những kết quả này đã gợi ý rằng khả năng phân bào giảm nhiễm hoàn toàn và khả năng phát triển sau đó có thể đạt được với sự phát triển của nang trứng. Tuy nhiên, sự không đồng nhất của các tế bào trứng lấy được từ những nang trứng có kích thước khác nhau trong phạm trù kích thước trung bình cũng có thể ảnh hưởng đến quá trình phân bào giảm nhiễm, sự chín tế bào chất và khả năng phát triển sau đó của chúng [41]. Vì thế, một thời gian nuôi cấy trước lúc chín là cần thiết để cho phép những tế bào trứng từ những nang trứng nhỏ hơn đạt tới giai đoạn có thể so sánh với những tế bào trứng từ những nang trứng lớn hơn. 1.2.4. Quá trình nuôi thành thục trứng và các hormone bổ sung Sự thành thục trong ống nghiệm của trứng lợn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: kích thước nang trứng, chất lượng trứng đem nuôi, môi trương nuôi thành thục, điều kiện nuôi, thời gian nuôi, giống lợn khác nhau, mùa vụ…Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới sự thành thục của trứng lợn trong ống nghiệm. Quá trình nuôi thành thục trong ống nghiệm đòi hỏi phải có môi trường nuôi thích hợp, giàu chất dinh dưỡng để trứng phát triển một cách bình thường. Môi trường phổ biến thường dùng là TCM - 199, có bổ xung các protein, hormone (FSH, LH, Estrogen, HCG) là cần thiết nhằm đảm bảo sự phát triển bình thường và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn