Tài liệu Một số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc adn và những ứng dụng trong nghiên cứu vi khuẩn

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự bùng nổ của các bệnh nhiễm trùng thường do kết quả của tình trạng phơi nhiễm với nguồn lõy. Nhìn chung, những căn nguyên gõy ra sự bùng nổ của bệnh nhiễm trùng hay bắt nguồn từ một loại tế bào vi sinh vật riêng lẻ. Vì vậy, các thế hệ sau của chúng giống nhau về gen hoặc có quan hệ gần với vi sinh vật bắt nguồn gõy bệnh (source organism). Trong nghiên cứu về các giai đoạn dịch tễ học, những vi sinh vật có liên quan đến sự bùng nổ dịch đều có mối liên quan về dòng tế bào, tức là có nguồn gốc chung. Vi sinh vật có liên quan về dòng tế bào, là thành viên của cùng một loài giống nhau nên có chung yếu tố độc lực, những đặc điểm sinh hóa và đặc điểm về gen. Tuy nhiên, nếu những chủng vi sinh vật được phõn lập từ các nguồn khác nhau ở thời điểm và địa lý khác nhau thì có thể đủ sự khác biệt ở mức độ loài hoặc phõn loại dưới typ (subtype) hay chủng (strain). Quy trình phõn loại dưới typ rất quan trọng trong dịch tễ học để xác định sự bùng nổ của các bệnh nhiễm trùng, phát hiện sự lõy truyền chéo của các nguồn bệnh trong bệnh viện, xác định nguồn gốc của nhiễm trùng, phát hiện những chủng vi sinh vật độc lực cụ thể và kiểm soát chương trình tiêm chủng vacxin [32]. Phõn loại dưới loài (subtyping) hoặc phõn loại các chủng đã được thực hiện bởi nhiều phương pháp khác nhau, những phương pháp này phải có khả năng đưa ra tiêu chuẩn chung để dễ dàng sử dụng rộng rói. Trong phõn loại dưới loài, tất cả các vi khuẩn trong một loài phải được phõn loại bởi nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng. Tuy nhiên, với những phương pháp phõn loại dựa theo đặc điểm kiểu hình (phenotype), chẳng hạn như: phương pháp dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể hoặc sự xuất hiện receptor của bacteriophage hoặc bằng các đặc điểm sinh học cụ thể không xuất hiện ở tất cả những chủng vi khuẩn trong cùng một loài. Typ huyết thanh (serotype) 2 có thể chỉ xác định được bằng sự xuất hiện của dấu ấn huyết thanh học (serological marker). Ví dụ: 10 – 15% chủng Mycobacterium avium không có khả năng định typ huyết thanh bởi vì những chủng này không ngưng kết với bất kỳ kháng huyết thanh mẫu. Tương tự, phương pháp phõn loại theo bacteriopgage thường được áp dụng để đánh giá đặc điểm của Staphylococcus aureus, trong đó một số chủng S. aureus phõn lập được thiếu receptor của bacteriophage, do đó không thể phõn được loại theo phương pháp này [25]. Một số phương pháp phõn loại dưới loài có khả năng phõn biệt (differentiation power) cao nên phõn loại rừ ràng được các chủng vi khuẩn không có mối liên quan với nhau, chẳng hạn do sự khác biệt về địa lý và nguồn gõy nhiễm trùng [36]. Vấn đề rất quan trọng đối với những phương pháp phõn loại dưới loài là phải có độ tái lặp (reproducibility) [36]. Độ tái lặp của một kỹ thuật là khả năng tạo ra những kết quả lặp lại giống nhau với một chủng cụ thể sau nhiều lần thực hiện. Độ tái lặp đặc biệt quan trọng để giải thích cơ sở số liệu một cách tin cậy trong phõn loại vi khuẩn, bao gồm các chủng chưa biết trong cùng một loài hay đối với những chủng chưa biết rừ loài đều có thể được so sánh để phõn loại. Phối hợp với những phương pháp xác định sự khác nhau của đặc điểm kiểu hình (phenotypic characteristics), cũng như sự biểu hiện lác đác (sporadic) của các gen độc lực hoặc đặc điểm kháng nguyên cũng có thể góp phần vào việc nõng cao mức đánh giá độ tái lặp [36]. Nhiều kỹ thuật sinh học phõn tử được dùng hiện nay để phõn loại (genotype) vi khuẩn dựa trên phõn tích các đoạn ADN với những độ dài khác nhau trên thạch điện di, kết quả được thể hiện bởi tớnh đa dạng của các mẫu (pattern) băng (band) điện di trên thạch (gel). Mỗi mẫu băng này rất phức tạp, do đó để thuận tiện cho phõn tích các mẫu băng cần phải dựa trên cơ sở giải thích và xác định mối liên hệ. Đõy là một yếu tố hữu ích trong đánh giá từng 3 phương pháp phõn loại cụ thể [25][36]. Vì vậy, cùng với việc đánh giá mức độ thuận tiện của những phương pháp phõn loại cụ thể, khả năng giải thích kết quả và sự thuận tiện trong tiến hành kỹ thuật cũng rất quan trọng. Những khó khăn về kỹ thuật, giá cả và thời gian thực hiện cũng phải được đánh giá trong việc lựa chọn của mỗi phương pháp phõn loại cụ thể [24][36]. Nhược điểm của phương pháp phõn loại dựa trên kiểu hình là nguồn gốc cho sự phát triển của các phương pháp phõn loại dựa trên kiểu gen hoặc trình tự ADN. Những phương pháp phõn loại dựa trên cấu trúc ADN có khả năng giảm tối đa hạn chế có liên quan đến khả năng phõn loại (typeability) và độ tái lặp (reproducibility). Ngoài ra, trong một số trường hợp những phương pháp phõn loại dựa vào cấu trúc ADN có thể thiết lập được một số lượng lớn cơ sở dữ liệu về đặc điểm của các vi khuẩn. Vì vậy, tôi thực hiện chuyên đề: "Một số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc ADN và những ứng dụng trong nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae" nhằm giải quyết 2 mục tiêu: 1. Xác định nguyên lý, ứng dụng của một số phương pháp phõn loại vi khuẩn dựa trên cấu trúc ADN và so sánh ưu điểm, nhược điểm của từng phương pháp. 2. Ứng dụng của các phương pháp phõn loại sinh học phõn tử trong nghiên cứu vi khuẩn Haemophilus influenzae. 4 Chương I NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG VI KHUẨN 1.1. Nguyên lý và ứng dụng của một số kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phân loại vi khuẩn 1.1.1. PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): Kỹ thuật điện di trong trường xung điện (điện di trong trường điện thay đổi) [1], [2], [3], [25], [35] PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) thường được xem là "tiêu chuẩn vàng - gold standard" của các phương pháp sinh học phõn tử dùng trong phõn loại vi khuẩn. Đối với kỹ thuật PFGE, các chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường thạch, sau đó sẽ hòa vi khuẩn vào thạch agarose lỏng rồi đổ vào những khuôn nhỏ (small molds), kết quả miếng thạch sau khi đổ được cắt và tạo ra các nút thạch (plugs) nhỏ có chứa toàn bộ tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn được cố định trong thạch sẽ chịu tác dụng của enzym ly giải tế bào để giải phóng toàn bộ ADN, tiếp theo ADN của vi khuẩn sẽ bị giáng hóa dưới tác dụng phõn cắt tại những vị trí đặc hiệu bởi enzym giới hạn. Các nút thạch (plugs) chứa ADN sau khi đã được phõn cắt được đặt vào những giếng (wells) tương ứng trên khuôn thạch agarose và tiến hành điện di. Trong đó, bộ điện di được đặt với dòng điện thay đổi ở các khoảng được xác định trước sao cho điện trường phải cho phép các đoạn ADN có kích thước lớn khoảng 10 - 800 kb phõn tách rời được với nhau. Mẫu thạch sau điện di sẽ được nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang như ethidium bromide và quan sát dưới đốn cực tớm (UV light). Kết quả phõn tích ADN trên thạch được chụp ảnh và số liệu có thể được lưu giữ bằng một trong các hệ thống kỹ thuật số thương mại, như sản phẩm của Alpha-Innotech, Bio-Rad, 5 Hitachi hoặc Molecular Dyamics. Phõn tích số liệu có thể được thực hiện bởi sử dụng một số phần mềm thương mại sẵn có ở Applied Math, Bio-Rad, BioSystematics, Bio-numerics, Media Cybernetics hoặc Scanalytics. Bảng 1.1: Tiêu chuẩn phân loại các mức độ liên quan về gen giữa các chủng vi khuẩn của bằng kỹ thuật PFGE [35]. Số đoạn ADN (band) khác nhau 0 Mối liên quan Không thể phân biệt được (Indistinguishabble) 2-3 Có mối liên quan gần (Closely related) 4-6 Có thể có liên quan (Possbly related) ≥7 Khác nhau hoàn toàn (Different) Tenover và cộng sự [35] đã đưa ra một hệ thống tiêu chuẩn để giải thích những mẫu PFGE trong mối tương quan để xác định sự liên quan giữa các chủng vi khuẩn phân lập được. Trong đó, những chủng vi khuẩn này tương ứng sẽ tạo ra các mẫu PFGE hoàn toàn giống nhau được xem là có nguồn gốc từ một chủng (Indistinguishabble). Những chủng vi khuẩn phân lập được khác nhau bởi xảy ra một biến cố về gen, sẽ phản ánh bởi sự khác nhau 2 – 3 băng trên thạch điện di và được xem là có mối liên quan gần (Closely related). Những chủng phân lập được khác nhau bởi 4 – 6 băng trên thạch điện di do xuất hiện 2 biến cố độc lập của gen, được xem là có thể có liên quan với nhau (Possbly related). Những chủng phân lập được khác nhau bởi 6 băng hoặc nhiều hơn trên thạch điện di, do xuất hiện sự thay đổi bởi 3 hoặc nhiều hơn biến cố độc lập của gen, được xem là không có mối liên quan với nhau (Different). Tiờu chuẩn này có thể áp dụng được đối những nghiên 6 cứu ở địa phương nhỏ, trong đó sự khác biệt về gen được xem là có giới hạn (bảng 1.1). Đối với những nghiên cứu lớn, xác định các mẫu băng khác nhau trên thạch điện di của vi khuẩn dựa trên sự phõn cắt phõn tử ADN bởi enzym giới hạn trong kỹ thuật PFGE được chứng minh là tốt hơn so với hầu hết các phương pháp dùng trong phõn loại vi khuẩn dựa trên tớnh chất sinh hóa hay kỹ thuật sinh học phõn tử khác. Kỹ thuật này có độ tách biệt (discriminatory) và độ tái lặp (reproducibility) tốt hơn cả so với các phương pháp khác dùng để phõn loại vi khuẩn, cụ thể, với các loài vi khuẩn: Escherichia coli, Entercocci kháng vancomycin, Staphylococcus aureus, loài Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa và Mycobacterium avium [25]. Ngoài ra, PFGE có hiệu quả hơn đối với khả năng phân biệt (differentiate) các chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin so với các phương pháp khác. PFGE cũng có khả năng tách biệt tốt hơn so với kỹ thuật Repetitive Element Sequence-base PCR (Rep – PCR) được dùng để phõn biệt phức hợp Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter baumannii, Entercocci kháng vancomycin, Neisseria gonnorhoeae và Pseudomonas aeruginosa [25] Hiện nay, với sự giúp đỡ của máy tính và phần mềm phõn tích kết quả điện di trên thạch, PFGE có thể tạo ra ngõn hàng số liệu về những mẫu phõn tớch ADN với hầu hết tất cả các loại vi khuẩn. Vì vậy, những mẫu này có thể tạo ra cơ sở dữ liệu tham khảo, so sánh đối với một số chủng mới để xác định quan hệ phát sinh loài (phylogenetic relationship). Khả năng này được phản ánh bởi một số báo cáo về an toàn thực phẩm, các nghiên cứu đưa ra 2 sự chấp nhận đối với kỹ thuật này, đó là: (I) để nõng cao khả năng giám sát sự bùng nổ ngộ độc thức ăn do vi khuẩn, cần thiết phải thực hiện kỹ thuật ADN fingerprinting (trong đó, PFGE là tiêu chuẩn vàng) để xác định nguồn gốc của yếu tố gõy nhiễm trùng và (II) để thiết lập một mạng lưới giúp cho việc so 7 sánh ADN fingerprinting thuận tiện, cho phép lưu giữ ở những trang web thường trực để chia sẻ số liệu một cách nhanh chóng [25], [32], [36] Tuy nhiên, một trong những yếu tố làm giới hạn việc sử dụng phương pháp PFGE là thời gian có liên quan đến hoàn thành quá trình phõn tích. Mặc dù các bước thực hiện không phức tạp, nhưng thời gian để hoàn thành là 2 đến 3 ngày. Điều này làm giảm khả năng phõn tích một lượng lớn mẫu chủng vi khuẩn. 1.1.2. Kỹ thuật Southern blotting và RFLP (Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt ngẫu nhiên bới các enzym giới hạn) Southern blotting do Edward Southern phát minh ra năm 1975. Kỹ thuật này đã được sử dụng nhiều năm để phát hiện và xác định sự có mặt một gen (một trình tự gen) nào đó trong bộ gen của tế bào sinh vật Eukaryote và Prokaryote. Để phát hiện gen này, trước hết cần tách chiết ADN bộ gen của tế bào, toàn bộ phõn tử ADN được phõn cắt bởi enzym giới hạn thành các đoạn nhỏ, và các đoạn ADN nhỏ này được phõn tách bởi quá trình điện di trên thạch agarose. Những đoạn ADN sau khi phõn tách sẽ được di chuyển từ thạch agarose tới màng nitrocellulose hoặc nylon bằng kỹ thuật Southern blotting (Gây biến tính ADN trên gel bằng dung dịch kiềm, thông thường là NaOH 0,5N; NaCl 1,5N. Sau đó, chuyển các đoạn ADN từ bản gel lên màng lai bằng sức mao dẫn). Vị trí của các đoạn ADN trên gel được giữ nguyên khi chuyển lên màng lai [1], [2], [3]. Acid nucleic gắn trên màng sau đó được lai với một hoặc nhiều mẫu dò được đánh dấu (labelled probes) có trình tự tương đồng với đoạn gen được nghiên cứu, tạo nên các phõn tử ADN lai (các mẫu dò có thể được đánh dấu với một nửa mẫu dò, bao gồm: chất phóng xạ hoặc cơ chất có màu với hoạt tớnh enzym hoặc cơ chất huỳnh quang với hoạt tớnh enzym). Sau đó, rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò thừa, thấm khô và thực hiện ghi hình phóng xạ bằng phim X-quang với chất đánh dấu là phóng xạ 8 hoặc đo huỳnh quang hay phát hiện sự xuất hiện màu trên màng lai tùy theo phương pháp gắn chất đánh dấu đã được sử dụng. Phương pháp cổ điển trên hiện nay đã được điều chỉnh phù hợp với khả năng phõn biệt các chủng vi khuẩn dựa trên cơ sở quan sát tớnh đa dạng của những băng ADN được tạo ra do sự phõn cắt bởi enzym giới hạn tại những vị trí nhận dạng đặc hiệu trên gen cụ thể từ chủng này tới chủng khác. Kết quả những băng ADN được tạo ra trên thạch sẽ khác nhau về kích thước giữa các chủng vi khuẩn khác nhau. Vì vậy, kỹ thuật với tên RFLP (restriction fragment length polymorphism) ra đời với bản chất xác định sự đa dạng tự nhiên của các vị trí có trình tự đặc hiệu nằm trên gen mà enzym giới hạn có khả năng nhận diện và cắt. Kỹ thuật này tạo nên các đoạn ADN khác nhau được phõn biệt bằng điện di đồ, những đoạn cắt này cũn được gọi là các “dấu võn tay” đặc trưng cho từng phõn tử ADN. Xử lý những mẫu ADN bằng cùng một cặp enzym giới hạn, các bộ gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, cũn những bộ gen hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau. Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tớnh chớnh xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu định loại nguồn gốc và mức độ tiến hóa của các loài sinh vật [1], [2]. Trong kỹ thuật RFLP, chỉ có những đoạn gen (ADN) được lai hóa với mẫu dò mới có thể thấy được qua phõn tích bằng RFLP, điều này làm đơn giản hóa cho quá trình phõn tích các mẫu ADN fingerprinting rất nhiều [25]. Những mẫu dò đặc hiệu với gen đã được sử dụng để phõn loại dưới loài đối với các vi khuẩn như Brucella, Legionella pneumophila và Pseudomonas aeruginosa. Hơn thế nữa, ribotyping, một dạng khác của RFLP – Southern blotting sử dụng những mẫu dò bắt nguồn từ gen rARN 16S và 23S được áp dụng thành công ở nhiều nghiên cứu để phõn biệt các chủng vi khuẩn [25]. Kết quả phõn tích ribotyping chỉ cho một số lượng nhỏ các băng, do đó đơn 9 giản cho phõn tích. Tuy nhiên, điều này cũng hạn chế khả năng của kỹ thuật trong việc phõn biệt giữa các chủng có mối liên quan gần. Tác dụng lên nhiều vị trí gen của kỹ thuật Southern blotting cũng có thể được áp dụng trong các nghiên cứu phõn loại dưới loài của vi khuẩn. Grundmann và cộng sự [25] sử dụng phối hợp mẫu dò gen toxA với các mẫu dò của gen rARN 23S và 16S để phõn loại dưới loài Pseudomonas aeruginosa. Cả hai bộ mẫu dò sử dụng trong kỹ thuật RFLP – Southern blotting đều mang lại những thông tin về mối liên quan về tiến hóa của các chủng vi khuẩn được nghiên cứu. Tuy nhiên, không có kỹ thuật nào có khả năng tách biệt giữa các chủng vi khuẩn hiệu quả bằng kỹ thuật PFGE. RFLP – Southern blotting là một kỹ thuật hữu ích cho nghiên cứu giới hạn về phõn loại dưới loài của các chủng vi khuẩn, các kỹ thuật blotting cồng kềnh đã được thay thế rộng rói bởi kỹ thuật PCR based locus – specific RFLP [25]. 1.1.3. Phương pháp PCR based locus – specific RFLP (Kỹ thuật RFLP dựa trên khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu) PCR có khả năng khuếch đại một cách thông thường những đoạn gen đặc hiệu để nghiên cứu sự khác nhau giữa các chủng vi khuẩn và khả năng đề kháng kháng sinh. Đoạn gen đặc hiệu nào đó sử dụng trong nghiên cứu sẽ được khuếch đại bởi các primer đặc hiệu và sau đó được phõn tích bằng kỹ thuật RFLP. Những đoạn ADN sau khi bị phõn cắt sẽ được tách biệt trên thạch agarose hoặc gel nhỏ polyacrylamide và các mẫu gen này sẽ được quan sát, phõn tích sau khi nhuộm bằng ethilium bromide [1], [2]. Kỹ thuật RFLP dựa trên khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu (locusspecific RFLP) đã được áp dụng ở rất nhiều nghiên cứu khác nhau. Shortrige và cộng sự đã sử dụng RFLP để phõn tích gen ureC để chứng tỏ sự khác nhau giữa các chủng Helicobacter pylori ở Mỹ. Vùng gen 16S, 23S và vùng đệm 16S-23S cũng đã được sử dụng là đích tác dụng của kỹ thuật RFLP dựa trên 10 đoạn gen đặc hiệu (locus-specific RFLP) [25]. Trong đó, sự thay đổi này của ribotyping, đó là ADN ribosom được khuếch đại và bị cắt bởi enzym giới hạn. Những đoạn ADN bị cắt bởi enzym giới hạn sẽ được quan sát sau khi điện di trên gel thạch. Vì vậy, làm giảm bớt nhu cầu về kỹ thuật Southern blotting. Ribotyping được áp dụng rất thành công cho phõn biệt các chủng vi khuẩn và thể hiện độ tương đồng cao với operon rARN Một áp dụng mới của kỹ thuật RFLP dựa trên khuếch đại PCR đoạn gen đặc hiệu (locus-specific RFLP), Cockerill và cộng sự đã xác định được đột biến điểm xảy ra ở gen katG của Mycobacterium tuberculosis dẫn đến mức độ đề kháng khác nhau với isoniazid giữa các chủng vi khuẩn này phõn lập được, thể hiện qua những mẫu RFLP của gen được khuếch đại sử dụng trong nghiên cứu. Tuy nhiên, khả năng tách biệt (discriminatory power) của kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu (locus-specific PCR) nhìn chung không tốt bằng các phương pháp khác, trước hết bởi vì trong nghiên cứu, kỹ thuật này chỉ phõn tích một vùng giới hạn của hệ gen nó có thể khuếch đại được. Ví dụ nghiên cứu của Kỹhn và cộng sự cho thấy PCR – ribotyping có khả năng tách biệt nghèo nàn khi so sánh với kỹ thuật PFGE và các phương pháp phõn loại theo sinh hóa [25]. Tuy nhiên, kỹ thuật RFLP dựa trên đoạn khuếch đại PCR gen đặc hiệu cho thấy hiệu quả áp dụng đáng tin cậy ở một số nghiên cứu dịch tễ học của virus viêm gan C (HCV). Bằng kỹ thuật này, HCV được chia thành 6 genotype chớnh, đánh số từ 1 đến 6. Davison và cộng sự đã phát triển một kỹ thuật đơn giản để xác định genotype của HCV dựa trên sự khuếch đại PCR và phõn tích RFLP đoạn ADN không mã hóa nằm trên bộ gen của virus này. Kỹ thuật sử dụng phương pháp cắt ADN bằng nhiều hoặc một enzym riêng lẻ HaeIII – RSAI, MvaI - HinfI, BstI và ScrFI cho phép tách biệt các chủng virus phõn lập được vào các nhúm 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5 và 6. RFLP của các 11 vùng 5’ không mã hóa cũng thuận lợi cho một số nghiên cứu về các genotyp virus theo phõn bố địa lý, lịch sử tự nhiên của bệnh và mối liên quan của các genotyp với đáp ứng của interferon [25]. 1.1.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA assay): Kỹ thuật đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên Đõy là phương pháp cũng dựa theo kỹ thuật PCR với đoạn mồi ngẫu nhiên (AP-PCR: Arbitrary Primed PCR) lần đầu tiên được Williams cùng cộng sự và Welsh cùng MacClelland mô tả. Kỹ thuật RAPD được thiết kế dựa trên việc sử dụng một số đoạn mồi có trình tự ngẫu nhiên ngắn (độ dài khoảng 9 – 10 base) có khả năng lai với trình tự của đoạn ADN trên phõn tử ADN bằng ái lực vừa đủ ở nhiệt độ gắn mồi thấp. Những đoạn mồi này sẽ được sử dụng để bắt đầu khuếch đại những vùng ADN của bộ gen vi khuẩn. Nếu hai mồi của RAPD gắn ở giữa một đoạn ADN có kích thước vài kilobase theo hướng thích hợp với nhau, sản phẩm PCR thu được với các phõn tử ADN có độ dài tương ứng với khoảng cách của hai primer. Số lượng và vị trí gắn của những primer có sự khác nhau giữa các chủng của mỗi loài vi khuẩn. Vì vậy, sau khi tách biệt các sản phẩm khuếch đại PCR trên thạch điện di agarose, mỗi mẫu băng “band” điện di sẽ thể hiện kết quả về đặc điểm của mỗi chủng vi khuẩn cụ thể [25]. Tức là, những sinh vật có bộ gen giống nhau hoàn toàn khi nhõn gen bằng máy PCR với các mồi ngẫu nhiên, kết quả thu được các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc. Điện di kết quả nhõn gen, thu được điện di đồ gồm những băng (vạch) ADN ở những vị trí giống nhau trên bản gel. Khi bộ gen của các mẫu được kiểm tra có sự khác nhau (có đa dạng sinh học) sẽ cho kết quả khác nhau trên điện di đồ [1], [2]. Hầu hết các trường hợp, trình tự của một số primer RAPD được sử dụng để tạo ra những mẫu băng ADN tốt nhất cho sự phõn biệt giữa các chủng vi khuẩn phải được xác định theo kinh nghiệm. Gần đõy, một primer 12 có trình tự được thống nhất với tên là M13 đã được sử dụng cho kỹ thuật “dấu võn tay” RAPD, primer này cho phép tiêu chuẩn hoá quy trình RAPD [25]. Một số nghiên cứu đã cho thấy sự thành công khi sử dụng kỹ thuật RAPD trong phõn biệt những chủng vi khuẩn ở các loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm: A. baumannii, Candida albicans, H. pylori, Proteus mirabilis, Histoplasma capsulatum, Haemophilus sommus, các loài Leptospira, S. aureus, và L. pneumophilia [25]. So sánh với những phương pháp phõn loại khác, Villa và cộng sự cho thấy kỹ thuật RAPD có độ tách biệt cao hơn phương pháp phõn tích bộ gen vi khuẩn dựa trên RFLP hoặc 16S rARN hay vùng đệm 16S – 23S, nhưng khả năng tách biệt thấp hơn kỹ thuật REP-PCR. Tuy nhiên, vẫn cũn nhiều nhược điểm được đưa ra với kỹ thuật RAPD làm mất đi độ tái lặp và chuẩn hóa của phương pháp. Bởi vì, các mồi không đối mã trực tiếp với bất kỳ vị trí gen cụ thể nào, trong đó một số hiện tượng gắn mồi là kết quả của sự lai không hoàn hảo giữa mồi và vị trí đích. Vì vậy, quá trình khuếch đại vô cùng nhạy cảm với những thay đổi nhẹ về nhiệt độ ở giai đoạn gắn mồi, do đó có thể dẫn đến sự khác nhau về những băng ở mỗi mẫu sau nhiều lần phõn tớch. Sử dụng mồi thiết kế theo kinh nghiệm, mỗi một loại mồi đòi hỏi một dạng hóa chất và điều kiện tối ưu cho phản ứng, do đó cũng làm cho sự chuẩn hoá của kỹ thuật này rất khó khăn [25]. 1.1.5. Kỹ thuật Rep – PCR (Repetitive extragenic palindromic PCR: REPPCR) Một kỹ thuật trực tiếp cho kết quả “dấu võn tay-fingerprinting” không cần sử dụng enzym cắt hạn chế là rep - PCR dựa trờn nguyên tắc nhõn cỏc đoạn gen lặp lại. Thuật ngữ rep - PCR là chỉ phương pháp sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân những chuỗi lặp lại phổ biến nằm trên phõn tử ADN của các vi sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ. Versalovic và cộng sự mô tả một kỹ thuật 13 xác định “dấu võn tay” bộ gen của vi khuẩn bằng cách phõn tích các mẫu ADN đặc hiệu của mỗi chủng vi khuẩn thu được từ quá trình khuếch đại PCR những đoạn ADN lặp lại nằm trên bộ gen của vi khuẩn. Sản phẩm khuếch đại PCR được phõn tách bởi quá trình điện di trên thạch agarose và thu được các mẫu phõn tích ADN đặc hiệu. Mẫu ADN đặc trưng cho mỗi chủng vi khuẩn có thể được phõn tích dựa trên các phần mềm chuyên dụng như: BioNumerics. Những chủng cho các mẫu phõn tích giống nhau (nghĩa là cùng một loài) sẽ được xếp vào cùng một nhúm. Điện di mẫu Rep-PCR Hình 1.1: Phương pháp Rep – PCR. Dưới điều kiện của PCR, primer khuếch đại vùng giới hạn nằm giữa hai yếu tố lặp lại bằng sự kéo dài của ADN Taq polymerase. Sản phẩm PCR được điện di và hình ảnh các band thu được tạo ra mẫu fingerprinting. Sự khác biệt về kích thước các band thể hiện đa dạng về khoảng cách giữa các yếu tố lặp lại. Đối với ADN của các loài Eukaryote hay Prokaryote đều có chứa các đoạn ADN được gọi là lặp lại, phõn bố nhiều hoặc ít trong bộ gen một cách ngẫu nhiên. Có hai dạng của đoạn gen lặp lại được sử dụng với mục đích phõn loại. Những đoạn ADN ngược xuôi giống nhau nằm ngoài gen có tớnh lặp lại (Repetitive extragenic palindromic: REP) là trình tự gồm 38 base với 6 14 vị trí thoái hóa và một cấu trúc thòng lọng gồm có 5 base khác nhau giữa mỗi đầu của vùng ngược xuôi bảo tồn. Trình tự REP là dạng đoạn gen lặp lại thứ nhất được mô tả phần lớn đối với những nghiên cứu về vi khuẩn đường ruột. Tớnh tự nhiên ngược xuôi của các đoạn REP và khả năng chúng tạo ra cấu trúc thòng lọng (stem-loop structure) dẫn đến có nhiều chức năng của các yếu tố với tớnh bảo tồn, phõn tán cao này. Trình tự ERIC (Enterobacterial repetitive intergeneic concensus sequence) là dạng đoạn gen lặp lại thứ hai đã sử dụng thành công để phõn loại vi khuẩn dựa vào ADN. Trình tự ERIC là đoạn có kích thước 126 bp có chứa đoạn lặp lại ngược chiều có tớnh bảo tồn cao và được xác định nằm ở những vùng ngoài của hệ gen của vi khuẩn. Chúng lần đầu tiên được xác định rừ dựa trên số liệu trình tự thu được từ E. coli, Salmonella typhimurium [25]. Trong khi các trình tự Rep và ERIC thường được sử dụng nhất với mục đích để phõn loại vi khuẩn theo ADN, một đoạn ADN lặp lại khác, trình tự BOX đã được sử dụng để phõn biệt các chủng Streptococcus pneumoniae. Trình tự BOX nằm trong các vùng gen và cũng có thể tạo ra cấu trúc thòng lọng (stem-loop structure) bởi vì sự cặp đôi đối xứng của chúng. Chúng là các “đoạn lặp lại khảm” bao gồm sự gắn kết khác nhau của 3 đơn vị nhỏ trình tự được cho là boxA, boxB và boxC. Ba đơn vị nhỏ trình tự có độ dài lần lượt là 59, 45 và 50 nucleotide. Yếu tố BOX không có mối liên quan về trình tự đối với cả hai yếu tố Rep và ERIC. Yếu tố BOX ban đầu được xem là duy nhất sử dụng đối với Streptococcus pneumoniae, nhưng sau này được sử dụng ở nhiều loài vi khuẩn khác [25]. Rep – PCR có thể được thực hiện với các mẫu ADN tách chiết từ những khuẩn lạc vi khuẩn hoặc bằng một số phương pháp cải tiến sử dụng toàn bộ tế bào chưa qua xử lý. Phản ứng khuếch đại Rep và ERIC có thể thực hiện với một mồi đơn, một hệ thống mồi đơn hoặc đa hệ thống mồi. Các mẫu 15 ERIC nhìn chung ít phức tạp hơn so với những mẫu Rep, nhưng cả hai đều cho khả năng độ tách biệt cao trong phõn loại ở mức độ chủng vi khuẩn. Áp dụng cả hai phương pháp Rep và ERIC PCR để định typ các chủng vi khuẩn sẽ làm tăng khả năng tách biệt so với sử dụng riêng lẻ từng kỹ thuật. Rep – PCR nhanh chóng trở thành một trong các phương pháp được sử dụng rộng rói nhất trong phõn loại dựa trên cấu trúc ADN. Rep – PCR với các đoạn mồi dựa trên cơ sở trình tự Rep và ERIC đã rất thành công sử dụng để phõn biệt các chủng Bartonella, Bacillus subtilis, Citrobacter diversus, S. aureus kháng methicillin, S. pneumoniae, A. baumanii, Burkholderia cepacia, L. pneumophilia, H. pylori, Neisseria gonorrhoeae và Neisseria meningitidis. Kỹ thuật này dễ dàng thực hiện và áp dụng với một số lượng lớn hoặc nhỏ chủng vi khuẩn phõn lập được [25]. Rep – PCR cho thấy có thể áp dụng rộng rói và có khả năng tách biệt cao hơn so với cả phương pháp phõn tích plasmid và một số kỹ thuật “dấu võn tay” khác. Rep – PCR được xem là có khả năng phõn biệt mạnh hơn so với phương pháp phõn tích bằng enzym giới hạn những gen rARN 16S và vùng đệm 16S-23S. Hơn thế nữa các phương pháp nghiên cứu đã so sánh Rep – PCR với các phương pháp phõn loại khác như “Multilocus enzym electrophoresis”, đặc điểm sinh hóa, ribotyping cho thấy đõy là phương pháp này tốt hơn so với các phương pháp trên. Cuối cùng, một số nghiên cứu cho rằng Rep–PCR có sự tương quan rất tốt với kết quả của PFGE, nhưng khả năng tách biệt thì thấp hơn PFGE một chút [25]. 1.1.6. Kỹ thuật AFLP (Amplified fragment length polymorphism): Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn ADN được khuếch đại chọn lọc. Kỹ thuật AFLP do Vos và cộng sự phát minh năm 1975. Đõy là phương pháp sinh học phõn tử “dấu võn tay” dựa trên sự khuếch đại chọn lọc một tập hợp con những đoạn ADN được tạo ra bởi enzym giới hạn [1], [3]. 16 Khởi đầu phương pháp này được sử dụng để xác định đặc điểm bộ gen của thực vật, nhưng gần đõy AFLP được áp dụng cho phõn loại vi khuẩn [25]. Có hai dạng khác nhau của AFLP đã được mô tả. Một là sử dụng hai enzym giới hạn và hai primer cho sự khuếch đại; thứ hai là sử dụng một primer đơn và một enzym giới hạn [25], [32]. Trong một dạng chung nhất của kỹ thuật này, ADN vi khuẩn được tách chiết, làm sạch và phõn cắt bằng hai enzym giới hạn khác nhau, như EcoRI và MseI. Những đoạn ADN giới hạn thu được, sau đó được gắn với đoạn ADN có trình tự tương đồng (adaptor) với PCR primer bằng một cầu nối tại các đầu mút. PCR primer sử dụng cho quá trình khuếch đại có chứa trình tự tương đồng với trình tự của đoạn adaptor được nối và có chứa một đến hai base chọn lọc ở điểm kết thúc 3’ của chúng. Ví dụ, một primer chọn lọc đối mã trực tiếp với một vị trí EcoRI có thể có trình tự 5’GAATTCAA-3’, tại đõy 6 base đầu tiên được bổ sung với vị trí của EcoRI trong khi hai nucleotid A cũn lại ở vị trí kết thúc 3’ được chọn lọc và chỉ cho phép khuếch đại khi các vị trí EcoRI đó có trình tự 3’-CTTAATT-5’. Không cho phép khuếch đại vị trí EcoRI với trình tự 3’-CTTAATC-5’. Vì vậy, các nucleotid chọn lọc cho phép khuếch đại chỉ tập hợp nhỏ của các đoạn gen giới hạn. Để quan sát các mẫu phõn tích, một trong các PCR primer có gắn chất đánh dấu phóng xạ hoặc chất huỳnh quang, hoặc có thể chọn cách nhuộm bằng ethidium bromide, các mẫu ADN có thể được quan sát trên gel thạch dưới ánh sáng tia cực tớm (UV) [1], [3], [25]. Một số nghiên cứu chứng minh cho thấy AFLP là phương pháp có độ lặp lại [22], [36], [39] và khả năng tách biệt tốt đối với chủng bắt nguồn từ các dòng khác nhau. Khả năng phõn biệt của AFLP giữa các chủng vi khuẩn lớn hơn so với phương pháp PCR-based ribotyping; tuy nhiên vẫn chưa thể được so sánh với Rep-PCR và PFGE. Quy trình thực hiện AFLP là xét 17 nghiệm chuyên sõu hơn Rep-PCR, nhưng kết quả thu được nhanh hơn PFGE [25], [32]. 1.1.7. Kỹ thuật giải trình tự gen (ADN Sequencing) Nền tảng cơ bản của các phương pháp sinh học phõn tử được sử dụng để phõn biệt những phõn nhúm nhỏ vi sinh vật đều dựa trên sự khác biệt về cấu trúc của phõn tử ADN. Do đó, giải trình tự gen được xem là phương pháp tốt nhất về khả năng phõn biệt trong những phõn loại nhỏ hơn ở mỗi loài vi sinh vật. Phương pháp giải trình tự ADN được thực hiện dựa nguyên tắc tạo ra những mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Những mảnh ADN chứa những base đã đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid. Trong đó, mỗi mảnh ADN này được phân biệt với nhau bằng vị trí khác nhau trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu, đọc kết quả tùy theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Tuy nhiên, ban đầu quy trình giải trình tự gen có sử dụng chất đánh dấu phóng xạ để phát hiện sản phẩm của phản ứng, một kỹ thuật không phù hợp với việc sử dụng trên lõm sàng hiện nay. Vì vậy, quy trình giải trình tự gen hiện nay sử dụng các nucleotid có gắn chất huỳnh quang để đánh dấu ADN. Trình tự ADN sẽ được đọc bởi một thiết bị tự động. Quá trình tạo ra những mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Frederick Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả [2], [3], [25]. Quá trình giải trình tự gen nhìn chung bắt đầu từ sự khuếch đại PCR trực tiếp của đoạn gen được quan tõm nằm trên phõn tử ADN, tiếp sau là các phản ứng giải trình tự của sản phẩm PCR vừa khuếch đại. Cải tiến của quy trình này có thể được áp dụng được đối với cả giải trình tự ARN. Trong đó, những thiết bị được sử dụng để phõn tích tự động trình tự ADN trên gel dựa 18 vào sự phát hiện chất huỳnh quang được đánh dấu trình tự của các sản phẩm thu được từ phản ứng. Nguyên lý cơ bản của phương pháp giải trình tự ADN dựa vào hoạt động của enzym ADN polymerase (dideoxy) trong quá trình tổng hợp ADN, đó là: ADN polymerase xúc tác gắn những nucleotide vào mạch đơn ADN đang tổng hợp ở vị trí 3' có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotide không có nhóm 3'-OH thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN một cách ngẫu nhiên. Trong phản ứng giải trình tự, sử dụng đoạn ADN mồi là đoạn ADN mạch đơn có kích thước 20 nucleotide, bốn loại dideoxynucleotide (ddNTP) được gắn với bốn loại thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau. Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ, thành phần bao gồm: ADN khuôn, ADN mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzym ADN Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích hợp, đồng thời có bổ sung thêm khoảng 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotide) cho mỗi phản ứng khác nhau. Dideoxynucleotide là loại nucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở carbon thứ 3 và carbon thứ 4. Do đó khi mạch ADN đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP không có nhóm 3'-OH ở nucleotide cuối cùng nên quá trình tổng hợp không được kéo dài tiếp tục và phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại [2], [3]. Trong phản ứng, ddNTP được đưa vào với một lượng nhỏ so với lượng dNTP nên thỉnh thoảng mới có một ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên làm phản ứng tổng hợp ADN dừng lại. Khi phản ứng giải trình tự gen hoàn tất, bốn hệ thống của sản phẩm phản ứng được kết hợp lại, tập trung và cho vào một giếng (well) trên thạch polyacrylamide. Trong suốt quá trình điện di, sản phẩm gồm các đoạn nucleotide với kích thước dài ngắn khác nhau có gắn chất 19 huỳnh quang này được phát hiện tự động. Kết quả dữ liệu được lưu ở dạng kỹ thuật số để tiếp tục quá trình phân tích sau đó mới cho kết quả về trình tự ADN với sự trợ giúp của các phần mềm chuyên dụng. Tổng hợp kết quả sẽ thu được trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn gen [1], [3], [25]. Trên thực tế, cần thiết phải cân nhắc và đỏnh giá trước khi quyết định sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen cho quá trình phân loại nhỏ các loài vi sinh vật. Trước hết, đối với mục đích thực tế trong phòng xét nghiệm, giải trình tự ADN phải được hướng vào một vùng giới hạn (rất nhỏ) của chromosome vi khuẩn. Một điều không thực tế, đó là thực hiện giải trình tự nhiều vùng hoặc một vùng lớn ADN trên chromosome của vi khuẩn. Vì vậy, trái ngược lại với phương pháp phân tích ADN dựa vào các kỹ thuật như PFGE, Rep PCR hoặc RAPD có thể nghiên cứu toàn bộ chromosome, giải trình tự ADN chỉ nghiên cứu một phần rất nhỏ của những đoạn ADN có thể khác nhau giữa các chủng vi khuẩn hoặc nấm. Đõy cũng là hạn chế của kỹ thuật này khi sử dụng trong phân loại vi khuẩn [25], [32], [36]. Hơn nữa, một đoạn ngắn ADN được sử dụng phải thỏa mãn một số tiêu chuẩn trước khi được sử dụng để phân biệt các chủng vi sinh vật. Cấu trúc của vùng ADN được lựa chọn phải bao gồm một chuỗi với trình tự có thể thay đổi cấu trúc nhưng kế bên là những vựng cú độ bảo tồn cao. Vùng ADN này cho phép quá trình khuếch đại PCR và phân loại được tất cả các thành viên của một loài. Sự khác nhau về trình tự ở trong chuỗi ADN được lựa chọn phải đủ khả năng phân biệt giữa các chủng khác nhau của một loài cụ thể. Cuối cùng, chuỗi ADN được lựa chọn không thể truyền ngang cho các chủng khác của một loài [25]. Đáng tiếc, đối với vi khuẩn hoặc nấm, có rất ít những chuỗi ADN thoả mãn những tiêu chuẩn này. Trong khi gen 16S rARN đã được sử dụng để xác định những loài mới của vi khuẩn, cho thấy sự khác biệt rất ít giữa các chủng 20 của cùng một loài vi khuẩn. Vùng gen nằm giữa hai gen 16S và 23S rARN cũng được sử dụng với các kết quả khác nhau. Về cơ bản các locus gen đặc hiệu loài phải được xác định và kiểm tra một cách có kinh nghiệm để xem xét một locus gen có khả năng đưa ra được sự khác biệt giữa các chủng. Hạn chế chính của phương pháp giải trình tự ADN đối được sử dụng để phân loại nhỏ các loài vi khuẩn hoặc nấm là kích thước của đoạn ADN dùng trong nghiên cứu bắt buộc phải có thể giải trình tự được trên thực tế [25]. Ngược lại, giải trình tự ADN được xem là “tiờu chuẩn vàng” trong phân loại virus. Giải trình tự acid nucleic có khả năng tách biệt rất lớn đối với xác định các genotype của HCV và là kỹ thuật sinh học phân tử duy nhất có thể dễ dàng xác định được mỗi đột biến có liên quan đến sự kháng thuốc của HIV. Vùng acid nucleic được sử dụng để phân loại virus theo genotype và phát hiện các đột biến kháng thuốc cú kích thước ngắn, các chuỗi acid nucleic rõ ràng, có thể đáp ứng được các tiêu chuẩn cần thiết cho áp dụng phương pháp giải trình tự acid nucleic. 1.2. So sánh ưu điểm, nhược điểm của các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phân loại vi khuẩn và hướng lựa chọn kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu [25], [36] Tonover và cộng sự đó xác định tiêu chuẩn giúp cho việc lựa chọn và giải thích các phương pháp phân loại sinh học phân tử dùng trong các nghiên cứu dịch tễ học [36]. Cho dù một phương pháp phân loại cụ thể có độ tách biệt cao, độ lặp lại tốt, nhưng sự phức tạp của phương pháp và cách giải thích kết quả cũng như giá cả đều liên quan đến việc cú xõy dựng hay sử dụng phương pháp đó hay không tùy theo khả năng của mỗi phòng xét nghiệm. Vì vậy, lựa chọn phương pháp phân loại sinh học phân tử phụ thuộc vào mức độ cần thiết, khả năng – trình độ kỹ thuật và nguồn tài chính của mỗi phòng xét nghiệm [25].