Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Mô hình thử nghiệm in vitro trong sàng lọc dược liệu tiềm năng...

Tài liệu Mô hình thử nghiệm in vitro trong sàng lọc dược liệu tiềm năng

.DOC
13
691
135

Mô tả:

MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM IN VITRO TRONG SÀNG LỌC DƯỢC LIỆU TIỀM NĂNG Nghiên cứu và phát triển thuốc mới là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm. Nhìn chung, có 3 con đường để phát triển thuốc mới bao gồm: từ nguồn tự nhiên, thông qua con đường tổng hợp hóa học và thông qua con đường sinh học phân tử. Ba con đường này bổ sung, hỗ trợ cho nhau. Hiện nay, việc phát triển thuốc mới dựa trên việc xác định các đích tác dụng đang là phương pháp lý tưởng. Các đích tác dụng có thể là thụ thể (receptor), enzym, acid nucleid hay các protein khác nhau... đóng vai trò khởi động các quá trình trong cơ chế bệnh sinh. Nhiệm vụ của các nhà khoa học phải tìm được đích tác dụng đối với mỗi bệnh lý và trên cơ sở đó thiết kế hoặc tìm kiếm thuốc có tác dụng đặc hiệu tại đích. Vì vậy, trước hết là phải xác định đích tác dụng, sau đó tiến hành sàng lọc các hợp chất tự nhiên và các chất tổng hợp với mục đích tìm ra các chất có tác dụng tại đích. Quá trình sàng lọc này có thể thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên hoặc tuân theo một số nguyên tắc nhất định. Hiện nay có 2 cách tiếp cận chính trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới là sàng lọc để tìm kiếm những hợp chất tác dụng trên một đích đặc hiệu đã được xác định và sử dụng các test sàng lọc chung. Mặc dù việc sàng lọc trên đích tác dụng có nhiều ưu điểm nhưng vẫn còn tồn tại một số vấn đề: Nhiều đích tác dụng chưa được xác định. Một số bệnh lý có nhiều đích tác dụng hoặc chưa tìm ra đích tác dụng cụ thể… Trong khi đó, việc sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học dựa trên các test sàng lọc chung có thể giúp tìm ra các “lead compound” và từ đó có thể tìm được các đích tác dụng mới. 1. Vấn đề sàng lọc dược liệu Trãi qua một thời gian dài trong công cuộc tìm kiếm thuốc mới, người ta nhận thấy rằng hóa tổ hợp chỉ giúp cải thiện được một số tính chất, không hoàn toàn đáp ứng được tiêu chí cung cấp các dẫn chất tổng hợp hợp là ứng cử viên cho việc ra đời các thuốc mới. Bên cạnh đó, vai trò của hợp chất tự nhiên không thể thay thế được, đặc biệt là sự phức tạo về cấu trúc, cấu hình… Ngoài ra, sự phong phú và đa dạng sinh học nguồn tài nguyên động thực vật cùng với những kinh nghiệm sử dụng dược liệu của các dân tộc, đặc biệt là vẫn còn một khối lượng lớn dược liệu chưa được nghiên cứu sâu đã thúc đẩy cho việc nghiên cứu phát triển thuốc mới từ dược liệu. Ngày nay, những khó khăn gặp phải trong việc nghiên cứu các hợp chất tự nhiên (đặc biệt về mặt thời gian) đang được giải quyết với những tiến bộ về kỹ thuật phân lập chất cũng như xác định cấu trúc (tốc độ, độ nhạy… tăng lên). Nhiều năm gần đây, thế giới đang có xu hướng định hình lại phương pháp nghiên cứu tìm ra các thuốc mới. Thay vì chỉ chú trọng đến việc tổng hợp hóa học trong phòng thí nghiệm với nhiều khó khăn và nhiều độc tính, các nhà khoa học, các tập đoàn dược phẩm lớn hiện đang chú trọng vào sàng lọc từ thiên nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học mới. Hiện nay, có 2 phương pháp sàng lọc chính: - Phương pháp kinh điển: Tiến hành chiết phân đoạn theo định hướng tác dụng sinh học. - Phương pháp sàng lọc tốc độ cao (High throughput screening): Hay còn gọi là phương pháp on-line. Tại thời điểm ban đầu chưa quan tâm đến tác dụng sinh học của hợp chất, tách tối đa các chất có thể, đánh giá tác dụng sinh học của các chất này trong giai đoạn tiếp theo. 1.1. Lựa chọn đối tượng: Việc lựa chọn đối tượng nghiên cứu có thể dựa trên dược lý dân tộc học có sự kết hợp chặt chẽ với các nhà thực vật học dân tộc, các đồng nghiệp bản địa, các lương y… Tuy nhiên số lượng mẫu đem sàng lọc trong trường hợp này thường nhỏ. Ngoài ra, ta có thể chọn đối tượng trên cở sở chemotaxonomy… hoặc dựa trên nguồn thông tin trong sách và các tạp chí khoa học hoặc trên các cơ sở dữ liệu: NAPRALERT (Natural Products Alert, University of Illinois-Chicago): lưu trữ các thông báo về tác dụng sinh học, thực vật dân tộc học, các dữ liệu về hóa thực vật; DNP (Dictionary of Natural Products): thông tin của hơn 199000 hợp chất tự nhiên, bao gồm: nguồn gốc, đặc điểm về cấu trúc, tính chất lý hóa, tài liệu tham khảo… Dược liệu tiến hành nghiên cứu có thể là các dược liệu đã biết rõ về tác dụng (bộ phận dùng, liều dùng) được ghi lại trong các sách y văn. Tiến hành nghiên cứu hoạt tính sinh học trên bộ phận dùng khác hoặc hướng tới tác dụng mới mà ta nghi ngờ. Dược liệu đem sàng lọc ở đây cũng có thể là dược liệu mới, chưa hoặc ít được biết đến, được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, có tác dụng liên quan đến hoạt tính sinh học ta muốn sàng lọc. Tiến hành sàng lọc người ta thường có sự định hướng về mặt hóa học hoặc về tác dụng dược lý. Tập trung vào một tác dụng dược lý nhất định, có mục tiêu rõ ràng. Ví dụ: tìm các kháng sinh mới, tìm các thuốc chống ung thư… Định hướng về mặt hóa học như tập trung vào một nhóm chất cụ thể. Ví dụ: các alkaloid, saponin… Để lựa chọn các cây thuốc đưa vào thử nghiệm, có thể dựa trên “chemotaxonomy”. Ví dụ: việc tìm kiếm các alcaloid được ưu tiên cho các loài trong những họ đã được biết đến là có các cây chứa alkaloid. Chú ý: Các thông tin lưu trữ cần thiết của đối tượng nghiên cứu như: - Định tên, lưu mẫu - Nơi thu hái - Thời điểm thu hái - Thông tin về cây thuốc 1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu: Sàng lọc thường được thực hiện với các dịch chiết toàn phần, dịch chiết phân đoạn hoặc các chất tinh khiết được phân lập từ dược liệu. - Đối với dịch chiết toàn phần: mục đích tìm kiếm dược liệu tiềm năng làm đối tượng cho nghiên cứu tiếp theo. - Đối với dịch chiết phân đoạn: mục tiêu lựa chọn phân đoạn cho hoạt tính tối ưu, định hướng quá trình chiết tách phân lập theo hoạt tính sinh học… - Đối với hợp chất tinh khiết: tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng, mức liều tác dụng… Sàng lọc ban đầu nhằm lựa chọn dược liệu tiềm năng: Các nhà khoa học tiếp cận việc khám phá thuốc mới bằng con đường sàng lọc có hệ thống các chiết xuất dược liệu nhằm lựa chọn dược liệu tiềm năng. Từ đó, tiến hành quá trình chiết xuất phân lập các hợp chất tinh khiết từ các dược liệu tiềm năng, hướng đến việc tìm kiếm chất hoạt tính sinh học mạnh hoặc chất dẫn đường (lead compound). Từ các hợp chất dẫn đường dựa trên mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng sinh học kết hợp với mô hình máy tính đồ họa nhằm thu được kết quả về phân tử hoạt chất có hoạt tính tối ưu, sinh khả dụng tốt hơn, ít tác dụng phụ để làm thuốc. Việc sàng lọc có thể thực hiện trên các bộ phận khác nhau do thành phần hóa học và hàm lượng có thể khác nhau, điều này có thể dẫn đến tác dụng của các bộ phận trên cùng một cây là khác nhau. Có thể lựa chọn bộ phận nghiên cứu theo tri thức dân tộc học. Ngoài ra, khối lượng mẫu đem chiết xuất cũng như dung môi chiết xuất là khá quan trọng. Việc lựa chọn dung môi chiết xuất phụ thuộc vào nhóm hợp chất cần sàng lọc; thường lựa chọn dung môi có khả năng hòa tan tối đa các hợp chất (EtOH, MeOH) 1.3. Lựa chọn thử nghiệm sàng lọc: Các thử nghiệm sinh học là giai đoạn quan trọng trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc mới từ dược liệu, có thể tác động ở các mức độ khác nhau: Để lựa chọn dược liệu tiềm năng đối với dịch chiết toàn phần như thử tác dụng các dịch chiết phân đoạn nhằm định hướng phân lập theo hoạt tính sinh học hoặc thử tác dụng, thử độc tính đối với các chất phân lập được... Mô hình thử nghiệm sinh học thích hợp là một yếu tố quan trọng cho sự thành công trong nghiên cứu. Lựa chọn mô hình và phương pháp nghiên cứu nhằm có thể thực hiện với số lượng lớn mẫu trong thời gian ngắn với chi phí thấp, lượng mẫu sử dụng nhỏ và kết quả có độ lặp lại cao, độ đặc hiệu tương đối để có thể loại trừ được các kết quả dương tính giả, đủ nhạy để có thể xác định các hoạt chất có mặt ở nồng độ thấp… Các phép thử sinh học trong giai đoạn sàng lọc ban đầu thường không tiến hành trên người mà chỉ tiến hành trong ống nghiệm (in vitro), dùng tế bào, mô phân lập, enzym, thụ thể hoặc trên mô hình động một vật (in vivo) như chuột, chó, thỏ hay trên cơ quan, tổ chức của cơ thể sống (ex vivo). Vấn đề quan trọng ở đây là xác định ngưỡng tác dụng, nếu chỉ số này quá thấp thì số lượng mẫu được lựa chọn quá nhiều, phải qua test sàng lọc lần 2 sẽ mất thời gian và chi phí, nếu ngưỡng tác dụng quá cao thì số lượng mẫu đạt tiêu chuẩn quá ít, có thể sẽ bỏ qua các mẫu có tiềm năng. Thông thường, đối với sàng lọc ban đầu người ta thường tiến hành các phép thử in vitro. Tuy nhiên vẫn có những trường hợp sàng lọc lựa chọn dược liệu phải tiến hành trên mô hình thử nghiệm in vivo hoặc ex vivo. Có thể áp dụng kỹ thuật sàng lọc hiệu năng cao để tiết kiệm thời gian. Yêu cầu của một thử nghiệm sàng lọc là phải sàng lọc được số lượng lớn mẫu trong thời gian ngắn với chi phí thấp, lượng mẫu sử dụng nhỏ và kết quả có độ lặp lại cao, độ đặc hiệu tương đối để có thể loại trừ được các kết quả dương tính giả, đủ nhạy để có thể xác định các hoạt chất có mặt ở nồng độ thấp… Hầu hết các yêu cầu này được đáp ứng bởi các thử nghiệm in vitro. Do đó, trong hầu hết các nghiên cứu sàng lọc, thử nghiệm in vitro được sử dụng như bước đi ban đầu cần thiết cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo. Phương pháp sàng lọc và mô hình thử nghiệm được lựa chọn phải phù hợp với các yếu tố thuộc về dược liệu như: Thành phần hóa học phức tạp, thường có màu, ít tan trong nước. 1.4. Sàng lọc tốc độ cao (High throughpup screening-HTS) Tuy kỹ thuật và phương tiện hỗ trợ quá trình phân lập các hợp chất ngày càng hiện đại nhưng số lượng các hợp chất tự nhiên có cấu trúc hoàn toàn mới được tìm ra đang ngày càng giảm đi. Nguyên nhân là do tốn nhiều thời gian và chi phí cao khi sử dụng các phương pháp kinh điển trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên. Xu hướng hiện nay của các công ty cũng như các trung tâm nghiên cứu là tiếp cận phương pháp sàng lọc tốc độ cao trong nghiên cứu phát triển thuốc mới. HTS được biết là công cụ hữu hiệu trong việc tìm ra các “lead compound”. HTS sử dụng hệ thống máy tự động, cho phép sàng lọc hàng trăm nghìn mẫu trên một đích tác dụng cần nghiên cứu. Thực chất, HTS là một quá trình phức tạp, đòi hỏi nhiều yếu tố: Những hiểu biết sâu sắc về đích tác dụng (vai trò trong quá trình bệnh lý, cấu trúc phân tử). Thiết kế hệ thống tự động hóa: thường sử dụng các bản với nhiều giếng nhỏ kết hợp với công nghệ robot.Bên cạnh đó là vấn đề bảo quản mẫu. Ngoài ra, HTS đòi hỏi phải có một thư viện các hợp chất để đưa vào thử nghiệm bao gồm: các hợp chất tự nhiên, các dẫn chất thu được bằng con đường tổng hợp hóa dược. Nhược điểm lớn của phương pháp này là các thử nghiệm HTS ban đầu thường mang tính định lượng kém hơn so với các thử nghiệm sinh học “kinh điển”: mỗi mẫu thường chỉ được thử 2 lần ở một nồng độ nhất định. Các hợp chất có tác dụng sẽ được thử lần 2. Các test thử nghiệm thường là các test kinh điển (ELISA, độc tế bào) phải được thiết kế cho phù hợp với HTS. Ngoài ra, HTS được hỗ trợ bởi các kỹ thuật chiết tách phân đoạn, phân lập chất (HPLC-MS) và xác định cấu trúc hiện đại (NMR). 2. Nghiên cứu dược lý thực nghiệm trong con đường nghiên cứu và phát triển thuốc mới Thuốc mới ra đời trong quá trình nghiên cứu và phát triển phải trải qua rất nhiều giai đoạn khác nhau. Nghiên cứu dược lý thực nghiệm là giai đoạn được tiến hành nhằm đánh giá, thăm dò tác dụng sinh học của thuốc/dịch chiết và độ an toàn cũng như triển vọng trong điều trị; gồm 3 nội dung chính: tác dụng, cơ chế tác dụng và độc tính. Nghiên cứu tác dụng có nhiều mức độ khác nhau, cao nhất là nghiên cứu trên cơ thể sống; tiếp đến là nghiên cứu trên cơ quan cô lập, rồi đến nghiên cứu trên tế bào, và nhỏ nhất là nghiên cứu trên phân tử. Các mô hình dược lý thường đi từ nhỏ nhất (trên phân tử) đến cao nhất (trên cơ thể). Trên thực tế, đối với 1 dược liệu ta có thể đi theo cả 2 chiều. Có những nghiên cứu tiến hành chứng minh tác dụng sinh học của dược liệu, liều dùng (trên cơ thể) sau đó tìm hiểu cơ chế tác dụng (trên phân tử). Thông thường khi biết đích tác dụng của thuốc/dịch chiết mà ta muốn sàng lọc, hoặc khi có nhiều mẫu nghiên cứu, ta thường bắt đầu với mô hình đơn giản tiến hành nghiên cứu trên đích tác dụng (phân tử), áp dụng sàng lọc dược liệu, các phân đoạn dịch chiết, với số lượng mẫu nghiên cứu lớn. Ví dụ như sàng lọc tác dụng ức chế enzyme xanthin oxidase (XO) với các dược liệu được sử dụng theo kinh nghiệm trong điều trị gout hoặc có tác dụng liên quan như chống viêm, giảm đau, chống oxy hóa. Tiến hành thử trên đích tác dụng trực tiếp: ủ với xanthine oxidase. Tuy nhiên cần chú ý: Thuốc/ dịch chiết có tác dụng ức chế XO thì chưa chắc đã có tác dụng hạ acid uric máu (nhằm ứng dụng trong điều trị Gout), lúc này cần tiến hành mô hình nghiên cứu trên cơ thể (in vivo). 3. Thử nghiệm in vitro Thử nghiệm in vitro là phép thử thường được tiến hành trong ống nghiệm, đĩa peptri… và không liên quan đến động vật sống mà chỉ sử dụng tế bào, enzym hoặc mô cô lập… Phạm vi ứng dụng trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới từ dược liệu: Sàng lọc dược liệu hoặc nghiên cứu tác dụng/cơ chế tác dụng ở mức độ tế bào và phân tử. Thử trên các môi trường nuôi cấy - Vi sinh vật (vi khuẩn, nấm…) - Ký sinh trùng (amib, Plasmodium…) - Tế bào (TB ung thư, kháng hoặc không kháng thuốc) hoặc một tác dụng đặc hiệu (VD: mức độ chống kết tập tiểu cầu) - Virus Thử trên các đích tác dụng - Enzyme - Receptor - Cảm ứng gen - Tubulin, AND… Ưu điểm của thử nghiệm in vitro thường ít tốn kém, dễ thiết lập, có thể tiến hành trong các hệ thống thử nghiệm ít phức tạp, tính toán kết quả nhanh, dễ kiểm soát chất lượng thí nghiệm, có thể sử dụng tế bào người nên hạn chế được yếu điểm phải ngoại suy từ động vật sang người. Tuy nhiên còn nhiều hạn chế: nghiên cứu thường được đánh giá trên các đích độc lập, không cung cấp được các yếu tố thể hiện được sự đáp ứng của cơ thể sống với thuốc, không thể hiện tác dụng trên cơ thể nguyên vẹn nên kết quả nghiên cứu thường mang tính chất gợi ý, tham khảo nhiều hơn là để chứng minh đánh giá tác dụng thuốc. Do đó, thường tiến hành nghiên cứu in vitro trước để thăm dò, sàng lọc tác dụng rồi chuyển sang in vivo. Ngày nay, với sự phát triển của di truyền học phân tử, nhiều phương pháp thử in vitro đã được xây dựng bằng cách sử dụng các gen mã hóa cho enzym hoặc thụ thể cấy vào tế bào phân chia nhanh như men, vi khuẩn hay tế bào ung thư làm cho các tế bào này biểu thị các enzym hoặc thụ thể cần thiết cho phép thử. Bên cạnh đó, phương pháp sàng lọc hiệu năng cao (high-throughput screening) ra đời đã nâng cao hiệu quả và rút ngắn thời gian của quá trình sàng lọc. Đây là một phương pháp thử sinh học thông thường, song sử dụng robot và hoàn toàn tự động hóa. Xu hướng hiện nay là sử dụng các thử nghiệm sinh học đặc hiệu hơn để đưa ra định hướng về tác dụng dược lý cho quá trình sàng lọc. Các test sàng lọc được tự động hóa. Tuy nhiên, khi nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, sử dụng các thử nghiệm sinh học quá đặc hiệu không phải luôn là một sự lựa chọn tốt (nguy cơ để mất các hợp chất có tác dụng…). Do đó trong sàng lọc các hợp chất tự nhiên, trong giai đoạn đầu nên sử dụng các thử nghiệm chung, không quá đặc hiệu. Sau khi lựa chọn các dịch chiết có tác dụng thông qua các test sàng lọc chung, các dịch chiết này tiếp tục được nghiên cứu sâu hơn dựa trên các test đặc hiệu hơn. Điều cần chú ý là không thể sàng lọc tất cả các dược liệu cũng như tất cả các hợp chất trên tất cả các tác dụng dẫn đến nguy cơ bỏ qua dược liệu tiềm năng. Một chất hiện tại không có tác dụng trên mô hình thử nghiệm này nhưng 10 hay 20 năm sau thì có thể cho tác dụng trên các mô hình thử nghiệm khác. Quy mô các chương trình sàng lọc khác nhau phụ thuộc vào sự kết hợp giữa các phòng nghiên cứu, các hãng dược phẩm, sự liên kết trong nước cũng như các đơn vị nghiên cứu nước ngoài. 3.1. IC50 và EC50 IC50 (Inhibitory Concentration at 50%): Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm. IC50 cho biết nồng độ của thuốc/dịch chiết cần thiết để ức chế 50% một quá trình sinh học nhất định (hoặc thành phần của một quá trình, tức là một enzyme, tế bào, thụ thể tế bào hoặc vi sinh vật…). Giá trị này là một thước đo về hiệu quả của một chất ức chế, thường được sử dụng để xem xét hiệu lực ức chế trong nghiên cứu dược lý. Theo FDA, IC50 đại diện cho nồng độ của một loại thuốc ức chế được 50% đối tượng thử nghiệm in vitro. IC50 được so sánh với EC50 của thuốc chủ vận. Giá trị IC50 có thể được sử dụng để so sánh hiệu lực của hai chất đối kháng. EC50 (Effective Concentration at 50%): Nồng độ gây ra tác động sinh học cho 50% đối tượng thử nghiệm. EC50 đại diện cho nồng độ thuốc/dịch chiết cần thiết để đạt được 50% hiệu quả tác dụng. Giá trị EC50 có thể được sử dụng để so sánh hiệu lực tác dụng của hai thuốc/dịch chiết. IC50 và EC50 của một thuốc/dịch chiết có thể được xác định bằng cách xây dựng một đường cong đáp ứng liều: Thử nghiệm bắt đầu với liều nhỏ nhất. Xác định liều lớn nhất (Imin hay Emin) bắt đầu có khả năng ức chế hay bắt đầu có tác dụng hoạt hóa và liều nhỏ nhất (Imax hay Emax) mà sự ức chế hay hoạt hóa không tăng lên khi tăng nồng độ thuốc/dịch chiết. IC50 hay EC50 là nồng độ hay liều mà tại đó tạo ra đáp ứng bằng 50% liều nhỏ nhất (Imax hay Emax). 3.2. Thử nghiệm in vitro trên các đích tác dụng Các đích tác dụng của thuốc có thể là enzyme, receptor màng tế bào, receptor nhân, hormone và các yếu tố tăng trưởng, kênh vận chuyển ion, ADN và một số đích tác dụng chưa xác định được. Đánh giá tác dụng trên receptor, enzyme hay đích tác dụng còn nhiều hạn chế trong vấn đề ngoại suy con người, nhưng thuốc không có tác dụng nếu không có tương tác với đích tác dụng. Tính đặc hiệu và chọn lọc trên đích tác dụng (mục tiêu phân tử) là yếu tố cực kỳ quan trọng một khi đích tác dụng được sử dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc. Một thuốc càng có tác dụng chọn lọc lên một mục tiêu phân tử nhất định thì có nghĩa là càng ít tương tác với các mục tiêu phân tử khác trong cơ thể và do đó thuốc sẽ càng có ít tác dụng không mong muốn hơn. Sự hiểu biết rõ về enzym, thụ thể hay protein cụ thể nào liên quan đến bệnh sinh là vô cùng quan trọng. Điều này cho phép các nhà nghiên cứu và phát triển thuốc quyết định dùng chất chủ vận hay chất đối kháng của thụ thể, dùng chất ức chế hay hoạt hóa enzym để can thiệp cơ chế bệnh sinh. 3.2.1. Tương tác thuốc và receptor a. Điều kiện “gắn”: Muốn nghiên cứu tương tác của thuốc và đích tác dụng, điều đầu tiên là chất/ dịch chiết phải “gắn” với đích tác dụng. Đo lường khả năng gắn của thuốc và đích tác dụng đó hay xác định ái lực gắn của thuốc và đích tác dụng. Tuy nhiên cần xem xét thuốc là chất ức chế hay chất chủ vận của đích tác dụng. R + L*  RL* R: Tế bào/ màng sinh học có gắn receptor L*: Thuốc gắn thêm đồng vị phóng xạ Ligant RL*: Phức hợp thuốc-Ligant Thuốc gắn thêm đồng vị phóng xạ (dịch chiết dược liệu thì không) nhằm giúp máy dễ đo, dễ đếm cường độ nhấp nháy. Nguyên tắc: Thuốc và receptor được ủ trong ống nghiệm, tiến hành lọc và rửa qua màng lọc với cấu trúc đường kính nhỏ, giữ lại các phức hợp thuốc-Ligant (RL *), những phân tử tự do mới có thể xuyên qua màng lọc, đi xuống dịch rửa. Tiến hành đo nồng độ dịch rửa. Tổng nồng độ ban đầu – Nồng độ dịch rửa = Nồng độ gắn Gắn là điều kiện cần nhưng chưa phải là điều kiện đủ để tạo ra tác dụng. Trường hợp thuốc gắn receptor thì phải hoạt hóa receptor, khi đó mới tạo được đáp ứng, mới thu được tác dụng mong muốn. Sau khi thử nghiệm gắn xong, tiến hành đánh giá hiệu quả gắn: kích thích, ức chế hay không thay đổi. Gắn mạnh chưa chắc đồng nghĩa với hiệu lực cao. Cimetidin là thuốc kháng Histamin trên thụ thể H2 của thành dạ dày, Cimetidin có khả năng gắn mạnh với thụ thể H2 đẩy Histamin ra ngoài, tuy nhiên hoạt tính trên thụ thể này lại yếu. Trong một bệnh lý có thể có nhiều đích tác dụng (receptor hay enzyme…) tham gia vào cơ chế. Nếu thuốc không đáp ứng, không phải không có tác dụng, mà cần thử trên các receptor khác. b. Thăm dò chức năng: Ủ thuốc với receptor, tiến hành đo sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối cùng mà quá trình tương tác thuốc/dịch chiết và receptor tạo ra. Giả thuyết là nồng độ sản phẩm tạo ra tỉ lệ thuận với khả năng tương tác thuốc với receptor. Quá trình này giúp ta xác định 2 biến số EC50 và Emax. Mục đích của thăm dò chức năng là xác định thuốc là chất chủ vận/đối vận hay chủ vận từng phần của receptor. Chất chủ vận toàn phần sẽ cho giá trị E max cao nhất. Chất chủ vận từng phần, gắn với receptor nhưng yếu hơn nên sẽ cho giá trị E max thấp hơn. Nếu thu được đường cong nằm ngang, chất đem thử nghiệm là chất ức chế hay đối vận. c. Những yếu tố cần cân nhắc khi xây dựng phương pháp thử - Nguồn receptor: tế bào, màng tế bào (trên màng có nhiều loại receptor), receptor tái tổ hợp. Nguồn receptor khác nhau cho khả năng gắn thuốc với receptor cũng khác nhau. Dễ nhất là thực hiện với receptor tái tổ hợp vì không có yếu tố cản trở, màng tế bào và tế bào có nhiều yếu tố ảnh hưởng, phải vượt qua nhiều quá trình thuốc mới đến và gắn được vào receptor. - Chất (thuốc/dịch chiết) nghiên cứu: Khả năng gắn phụ thuộc vào liều hay nồng độ làm việc. - Lựa chọn điều kiện ủ: thời gian, nhiệt độ - Lựa chọn hệ đệm cho thử nghiệm: pH - Lựa chọn thể tích làm việc: 50-200 µl - Lựa chọn phương pháp tách phần tự do/phần gắn: màng, điều kiện rửa. d. Ý nghĩa: Sàng lọc thuốc theo đích tác dụng: Thuốc có ái lực gắn cao với thụ thể sẽ cho tác dụng chọn lọc, ít tác dụng phụ. Thuốc có tác dụng trên nhiều đích, thuốc có thể tác dụng trong nhiều bệnh lý, chỉ định của thuốc sẽ tăng lên. Tuy nhiên tính chọn lọc giảm, khả năng xuất hiện tác dụng phụ cũng tăng lên và nguy cơ độc tính nhiều hơn. Ái lực này phải được đánh giá trên nhiều đích tác dụng thì mới đưa ra kết quả thuốc/dịch chiết có tác dụng chọn lọc hay không. 3.2.2. Tương tác thuốc và enzyme Những yếu tố cần lưu ý khi xây dựng phương pháp - Nguồn enzym - Lựa chọn nồng độ enzyme - Lựa chọn cơ chất và nồng độ cơ chất - Lựa chọn nồng độ của các đồng yếu tố (cofactor) - Lựa chọn phương pháp phát hiện: huỳnh quang, phóng xa, đo màu - Lựa chọn pH - Lựa chọn nhiệt độ - Khả năng tương hợp với DMSO Dược liệu nghiên cứu thường được đem chiết với dung môi rồi cô quay ở áp suất thấp lấy cắn. Cắn được hòa tan để tiến hành ủ với enzyme (hoặc receptor) thông thường sử dụng DMSO để hòa tan cắn, đây là dung môi hòa tan vạn năng. Nhưng nồng độ DMSO không được vượt quá 0,1%, với nồng độ cao hơn sẽ ảnh hưởng đến enzyme/receptor, nên sử dụng nồng độ DMSO thấp nhất có thể. - Khả năng tương hợp với dịch chiết cần thử Lưu ý nếu bước sóng hấp thụ dịch chiết trùng với bước sóng cần đo thì sẽ gây ảnh hưởng nhiều đến kết quả đo quang, hiệu quả đo không chính xác, lúc này cần sử dụng phương pháp khác. Nếu bước sóng không trùng, ta sử dụng mẫu trắng (dịch chiết mà không có enzyme hay receptor…) trong quá trình đo. - Phát hiện khả năng ức chế enzyme: cạnh tranh và không cạnh tranh. 3.3. Nghiên cứu ở mức độ tế bào/ cơ quan Mô hình này gần với sinh lý bệnh, cho ta thêm thông tin về tác dụng của thuốc/ dịch chiết. Nghiên cứu trên tế bào, thuốc thâm nhập vào bên trong tế bào, tác dụng tại chỗ trên enzym. Ngoài ra thử nghiệm này còn cho ta biết tại nồng độ tác dụng đó thì thuốc có độc hay không (biểu hiện ở tế bào vẫn sống hay chết). Đối với cơ quan (ex vivo), cao hơn mức tế bào và thừa hưởng các ưu điểm của các mô hình đơn giản phía dưới. Ở mức độ này, có sự phối hợp các loại tế bào khác nhau cùng cho đáp ứng. Có đầy đủ sự toàn vẹn của tế bào và đầy đủ các yếu tố tham gia đáp ứng. 4. Xử lý số liệu Đánh giá kết quả và xử lý thống kê: Dùng phần mềm Excel, SPSS… Chuyển tải thông tin vào máy, mã hóa thông tin dạng số để dễ xử lý. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bohlin L., Bruhn Jan G. (Eds.) (1999), Bioassay Methods in Natural Product Research and Drug Development, Springer Science + Business Media. 2. Jose V. Castell, Maria Jose Gmez-Lechn (1996), In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press. 3. Eisenbrand G., Pool-Zobel B., Baker V., Balls M, Blaauboer BJ., Boobis A., Carere A., Kevekordes S., Lhuguenot JC., Pieters R., Kleiner J. (2002), Methods of in vitro toxicology, Food and Chemical Toxicology, 40(2-3), 193236. 4. Mon M. M., Maw S. S., and Oo Z. K. (2011), Screening of Antioxidant, Antitumor and Antimicrobial Herbal Drugs/Diets from Some Myanmar Traditional Herbs, International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics, 1(2), 142-147.
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

Tài liệu vừa đăng