MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM IN VITRO TRONG SÀNG LỌC DƯỢC
LIỆU TIỀM NĂNG
Nghiên cứu và phát triển thuốc mới là lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan
tâm. Nhìn chung, có 3 con đường để phát triển thuốc mới bao gồm: từ nguồn tự nhiên,
thông qua con đường tổng hợp hóa học và thông qua con đường sinh học phân tử. Ba
con đường này bổ sung, hỗ trợ cho nhau. Hiện nay, việc phát triển thuốc mới dựa trên
việc xác định các đích tác dụng đang là phương pháp lý tưởng. Các đích tác dụng có
thể là thụ thể (receptor), enzym, acid nucleid hay các protein khác nhau... đóng vai trò
khởi động các quá trình trong cơ chế bệnh sinh. Nhiệm vụ của các nhà khoa học phải
tìm được đích tác dụng đối với mỗi bệnh lý và trên cơ sở đó thiết kế hoặc tìm kiếm
thuốc có tác dụng đặc hiệu tại đích. Vì vậy, trước hết là phải xác định đích tác dụng,
sau đó tiến hành sàng lọc các hợp chất tự nhiên và các chất tổng hợp với mục đích tìm
ra các chất có tác dụng tại đích. Quá trình sàng lọc này có thể thực hiện hoàn toàn
ngẫu nhiên hoặc tuân theo một số nguyên tắc nhất định.
Hiện nay có 2 cách tiếp cận chính trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới là
sàng lọc để tìm kiếm những hợp chất tác dụng trên một đích đặc hiệu đã được xác định
và sử dụng các test sàng lọc chung. Mặc dù việc sàng lọc trên đích tác dụng có nhiều
ưu điểm nhưng vẫn còn tồn tại một số vấn đề: Nhiều đích tác dụng chưa được xác
định. Một số bệnh lý có nhiều đích tác dụng hoặc chưa tìm ra đích tác dụng cụ thể…
Trong khi đó, việc sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học dựa trên các test sàng lọc
chung có thể giúp tìm ra các “lead compound” và từ đó có thể tìm được các đích tác
dụng mới.
1. Vấn đề sàng lọc dược liệu
Trãi qua một thời gian dài trong công cuộc tìm kiếm thuốc mới, người ta nhận
thấy rằng hóa tổ hợp chỉ giúp cải thiện được một số tính chất, không hoàn toàn đáp
ứng được tiêu chí cung cấp các dẫn chất tổng hợp hợp là ứng cử viên cho việc ra đời
các thuốc mới. Bên cạnh đó, vai trò của hợp chất tự nhiên không thể thay thế được,
đặc biệt là sự phức tạo về cấu trúc, cấu hình… Ngoài ra, sự phong phú và đa dạng sinh
học nguồn tài nguyên động thực vật cùng với những kinh nghiệm sử dụng dược liệu
của các dân tộc, đặc biệt là vẫn còn một khối lượng lớn dược liệu chưa được nghiên
cứu sâu đã thúc đẩy cho việc nghiên cứu phát triển thuốc mới từ dược liệu. Ngày nay,
những khó khăn gặp phải trong việc nghiên cứu các hợp chất tự nhiên (đặc biệt về mặt
thời gian) đang được giải quyết với những tiến bộ về kỹ thuật phân lập chất cũng như
xác định cấu trúc (tốc độ, độ nhạy… tăng lên). Nhiều năm gần đây, thế giới đang có xu
hướng định hình lại phương pháp nghiên cứu tìm ra các thuốc mới. Thay vì chỉ chú
trọng đến việc tổng hợp hóa học trong phòng thí nghiệm với nhiều khó khăn và nhiều
độc tính, các nhà khoa học, các tập đoàn dược phẩm lớn hiện đang chú trọng vào sàng
lọc từ thiên nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học mới.
Hiện nay, có 2 phương pháp sàng lọc chính:
- Phương pháp kinh điển: Tiến hành chiết phân đoạn theo định hướng tác dụng
sinh học.
- Phương pháp sàng lọc tốc độ cao (High throughput screening): Hay còn gọi là
phương pháp on-line. Tại thời điểm ban đầu chưa quan tâm đến tác dụng sinh học của
hợp chất, tách tối đa các chất có thể, đánh giá tác dụng sinh học của các chất này trong
giai đoạn tiếp theo.
1.1. Lựa chọn đối tượng:
Việc lựa chọn đối tượng nghiên cứu có thể dựa trên dược lý dân tộc học có sự
kết hợp chặt chẽ với các nhà thực vật học dân tộc, các đồng nghiệp bản địa, các lương
y… Tuy nhiên số lượng mẫu đem sàng lọc trong trường hợp này thường nhỏ. Ngoài
ra, ta có thể chọn đối tượng trên cở sở chemotaxonomy… hoặc dựa trên nguồn thông
tin trong sách và các tạp chí khoa học hoặc trên các cơ sở dữ liệu: NAPRALERT
(Natural Products Alert, University of Illinois-Chicago): lưu trữ các thông báo về tác
dụng sinh học, thực vật dân tộc học, các dữ liệu về hóa thực vật; DNP (Dictionary of
Natural Products): thông tin của hơn 199000 hợp chất tự nhiên, bao gồm: nguồn gốc,
đặc điểm về cấu trúc, tính chất lý hóa, tài liệu tham khảo…
Dược liệu tiến hành nghiên cứu có thể là các dược liệu đã biết rõ về tác dụng
(bộ phận dùng, liều dùng) được ghi lại trong các sách y văn. Tiến hành nghiên cứu
hoạt tính sinh học trên bộ phận dùng khác hoặc hướng tới tác dụng mới mà ta nghi
ngờ. Dược liệu đem sàng lọc ở đây cũng có thể là dược liệu mới, chưa hoặc ít được
biết đến, được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, có tác dụng liên quan đến hoạt tính
sinh học ta muốn sàng lọc.
Tiến hành sàng lọc người ta thường có sự định hướng về mặt hóa học hoặc về
tác dụng dược lý. Tập trung vào một tác dụng dược lý nhất định, có mục tiêu rõ ràng.
Ví dụ: tìm các kháng sinh mới, tìm các thuốc chống ung thư… Định hướng về mặt hóa
học như tập trung vào một nhóm chất cụ thể. Ví dụ: các alkaloid, saponin… Để lựa
chọn các cây thuốc đưa vào thử nghiệm, có thể dựa trên “chemotaxonomy”. Ví dụ:
việc tìm kiếm các alcaloid được ưu tiên cho các loài trong những họ đã được biết đến
là có các cây chứa alkaloid.
Chú ý: Các thông tin lưu trữ cần thiết của đối tượng nghiên cứu như:
-
Định tên, lưu mẫu
-
Nơi thu hái
-
Thời điểm thu hái
-
Thông tin về cây thuốc
1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu:
Sàng lọc thường được thực hiện với các dịch chiết toàn phần, dịch chiết phân
đoạn hoặc các chất tinh khiết được phân lập từ dược liệu.
-
Đối với dịch chiết toàn phần: mục đích tìm kiếm dược liệu tiềm năng làm đối
tượng cho nghiên cứu tiếp theo.
-
Đối với dịch chiết phân đoạn: mục tiêu lựa chọn phân đoạn cho hoạt tính tối ưu,
định hướng quá trình chiết tách phân lập theo hoạt tính sinh học…
-
Đối với hợp chất tinh khiết: tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng, mức liều tác
dụng…
Sàng lọc ban đầu nhằm lựa chọn dược liệu tiềm năng:
Các nhà khoa học tiếp cận việc khám phá thuốc mới bằng con đường sàng lọc
có hệ thống các chiết xuất dược liệu nhằm lựa chọn dược liệu tiềm năng. Từ đó, tiến
hành quá trình chiết xuất phân lập các hợp chất tinh khiết từ các dược liệu tiềm năng,
hướng đến việc tìm kiếm chất hoạt tính sinh học mạnh hoặc chất dẫn đường (lead
compound). Từ các hợp chất dẫn đường dựa trên mối liên quan giữa cấu trúc và tác
dụng sinh học kết hợp với mô hình máy tính đồ họa nhằm thu được kết quả về phân tử
hoạt chất có hoạt tính tối ưu, sinh khả dụng tốt hơn, ít tác dụng phụ để làm thuốc.
Việc sàng lọc có thể thực hiện trên các bộ phận khác nhau do thành phần hóa
học và hàm lượng có thể khác nhau, điều này có thể dẫn đến tác dụng của các bộ phận
trên cùng một cây là khác nhau. Có thể lựa chọn bộ phận nghiên cứu theo tri thức dân
tộc học. Ngoài ra, khối lượng mẫu đem chiết xuất cũng như dung môi chiết xuất là khá
quan trọng. Việc lựa chọn dung môi chiết xuất phụ thuộc vào nhóm hợp chất cần sàng
lọc; thường lựa chọn dung môi có khả năng hòa tan tối đa các hợp chất (EtOH,
MeOH)
1.3. Lựa chọn thử nghiệm sàng lọc:
Các thử nghiệm sinh học là giai đoạn quan trọng trong quá trình nghiên cứu
phát triển thuốc mới từ dược liệu, có thể tác động ở các mức độ khác nhau: Để lựa
chọn dược liệu tiềm năng đối với dịch chiết toàn phần như thử tác dụng các dịch chiết
phân đoạn nhằm định hướng phân lập theo hoạt tính sinh học hoặc thử tác dụng, thử
độc tính đối với các chất phân lập được...
Mô hình thử nghiệm sinh học thích hợp là một yếu tố quan trọng cho sự thành
công trong nghiên cứu. Lựa chọn mô hình và phương pháp nghiên cứu nhằm có thể
thực hiện với số lượng lớn mẫu trong thời gian ngắn với chi phí thấp, lượng mẫu sử
dụng nhỏ và kết quả có độ lặp lại cao, độ đặc hiệu tương đối để có thể loại trừ được
các kết quả dương tính giả, đủ nhạy để có thể xác định các hoạt chất có mặt ở nồng độ
thấp…
Các phép thử sinh học trong giai đoạn sàng lọc ban đầu thường không tiến hành
trên người mà chỉ tiến hành trong ống nghiệm (in vitro), dùng tế bào, mô phân lập,
enzym, thụ thể hoặc trên mô hình động một vật (in vivo) như chuột, chó, thỏ hay trên
cơ quan, tổ chức của cơ thể sống (ex vivo).
Vấn đề quan trọng ở đây là xác định ngưỡng tác dụng, nếu chỉ số này quá thấp
thì số lượng mẫu được lựa chọn quá nhiều, phải qua test sàng lọc lần 2 sẽ mất thời gian
và chi phí, nếu ngưỡng tác dụng quá cao thì số lượng mẫu đạt tiêu chuẩn quá ít, có thể
sẽ bỏ qua các mẫu có tiềm năng.
Thông thường, đối với sàng lọc ban đầu người ta thường tiến hành các phép thử
in vitro. Tuy nhiên vẫn có những trường hợp sàng lọc lựa chọn dược liệu phải tiến
hành trên mô hình thử nghiệm in vivo hoặc ex vivo. Có thể áp dụng kỹ thuật sàng lọc
hiệu năng cao để tiết kiệm thời gian.
Yêu cầu của một thử nghiệm sàng lọc là phải sàng lọc được số lượng lớn mẫu
trong thời gian ngắn với chi phí thấp, lượng mẫu sử dụng nhỏ và kết quả có độ lặp lại
cao, độ đặc hiệu tương đối để có thể loại trừ được các kết quả dương tính giả, đủ nhạy
để có thể xác định các hoạt chất có mặt ở nồng độ thấp… Hầu hết các yêu cầu này
được đáp ứng bởi các thử nghiệm in vitro. Do đó, trong hầu hết các nghiên cứu sàng
lọc, thử nghiệm in vitro được sử dụng như bước đi ban đầu cần thiết cho các quá trình
nghiên cứu tiếp theo.
Phương pháp sàng lọc và mô hình thử nghiệm được lựa chọn phải phù hợp với
các yếu tố thuộc về dược liệu như: Thành phần hóa học phức tạp, thường có màu, ít
tan trong nước.
1.4. Sàng lọc tốc độ cao (High throughpup screening-HTS)
Tuy kỹ thuật và phương tiện hỗ trợ quá trình phân lập các hợp chất ngày càng
hiện đại nhưng số lượng các hợp chất tự nhiên có cấu trúc hoàn toàn mới được tìm ra
đang ngày càng giảm đi. Nguyên nhân là do tốn nhiều thời gian và chi phí cao khi sử
dụng các phương pháp kinh điển trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên. Xu hướng
hiện nay của các công ty cũng như các trung tâm nghiên cứu là tiếp cận phương pháp
sàng lọc tốc độ cao trong nghiên cứu phát triển thuốc mới.
HTS được biết là công cụ hữu hiệu trong việc tìm ra các “lead compound”.
HTS sử dụng hệ thống máy tự động, cho phép sàng lọc hàng trăm nghìn mẫu trên một
đích tác dụng cần nghiên cứu. Thực chất, HTS là một quá trình phức tạp, đòi hỏi nhiều
yếu tố: Những hiểu biết sâu sắc về đích tác dụng (vai trò trong quá trình bệnh lý, cấu
trúc phân tử). Thiết kế hệ thống tự động hóa: thường sử dụng các bản với nhiều giếng
nhỏ kết hợp với công nghệ robot.Bên cạnh đó là vấn đề bảo quản mẫu. Ngoài ra, HTS
đòi hỏi phải có một thư viện các hợp chất để đưa vào thử nghiệm bao gồm: các hợp
chất tự nhiên, các dẫn chất thu được bằng con đường tổng hợp hóa dược.
Nhược điểm lớn của phương pháp này là các thử nghiệm HTS ban đầu thường
mang tính định lượng kém hơn so với các thử nghiệm sinh học “kinh điển”: mỗi mẫu
thường chỉ được thử 2 lần ở một nồng độ nhất định. Các hợp chất có tác dụng sẽ được
thử lần 2.
Các test thử nghiệm thường là các test kinh điển (ELISA, độc tế bào) phải được
thiết kế cho phù hợp với HTS. Ngoài ra, HTS được hỗ trợ bởi các kỹ thuật chiết tách
phân đoạn, phân lập chất (HPLC-MS) và xác định cấu trúc hiện đại (NMR).
2. Nghiên cứu dược lý thực nghiệm trong con đường nghiên cứu và phát triển
thuốc mới
Thuốc mới ra đời trong quá trình nghiên cứu và phát triển phải trải qua rất nhiều
giai đoạn khác nhau. Nghiên cứu dược lý thực nghiệm là giai đoạn được tiến hành
nhằm đánh giá, thăm dò tác dụng sinh học của thuốc/dịch chiết và độ an toàn cũng như
triển vọng trong điều trị; gồm 3 nội dung chính: tác dụng, cơ chế tác dụng và độc tính.
Nghiên cứu tác dụng có nhiều mức độ khác nhau, cao nhất là nghiên cứu trên cơ
thể sống; tiếp đến là nghiên cứu trên cơ quan cô lập, rồi đến nghiên cứu trên tế bào, và
nhỏ nhất là nghiên cứu trên phân tử. Các mô hình dược lý thường đi từ nhỏ nhất (trên
phân tử) đến cao nhất (trên cơ thể). Trên thực tế, đối với 1 dược liệu ta có thể đi theo
cả 2 chiều. Có những nghiên cứu tiến hành chứng minh tác dụng sinh học của dược
liệu, liều dùng (trên cơ thể) sau đó tìm hiểu cơ chế tác dụng (trên phân tử).
Thông thường khi biết đích tác dụng của thuốc/dịch chiết mà ta muốn sàng lọc,
hoặc khi có nhiều mẫu nghiên cứu, ta thường bắt đầu với mô hình đơn giản tiến hành
nghiên cứu trên đích tác dụng (phân tử), áp dụng sàng lọc dược liệu, các phân đoạn
dịch chiết, với số lượng mẫu nghiên cứu lớn. Ví dụ như sàng lọc tác dụng ức chế
enzyme xanthin oxidase (XO) với các dược liệu được sử dụng theo kinh nghiệm trong
điều trị gout hoặc có tác dụng liên quan như chống viêm, giảm đau, chống oxy hóa.
Tiến hành thử trên đích tác dụng trực tiếp: ủ với xanthine oxidase. Tuy nhiên cần chú
ý: Thuốc/ dịch chiết có tác dụng ức chế XO thì chưa chắc đã có tác dụng hạ acid uric
máu (nhằm ứng dụng trong điều trị Gout), lúc này cần tiến hành mô hình nghiên cứu
trên cơ thể (in vivo).
3. Thử nghiệm in vitro
Thử nghiệm in vitro là phép thử thường được tiến hành trong ống nghiệm, đĩa
peptri… và không liên quan đến động vật sống mà chỉ sử dụng tế bào, enzym hoặc mô
cô lập… Phạm vi ứng dụng trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới từ dược
liệu: Sàng lọc dược liệu hoặc nghiên cứu tác dụng/cơ chế tác dụng ở mức độ tế bào và
phân tử.
Thử trên các môi trường nuôi cấy
-
Vi sinh vật (vi khuẩn, nấm…)
-
Ký sinh trùng (amib, Plasmodium…)
-
Tế bào (TB ung thư, kháng hoặc không kháng thuốc) hoặc một tác dụng đặc
hiệu (VD: mức độ chống kết tập tiểu cầu)
-
Virus
Thử trên các đích tác dụng
-
Enzyme
-
Receptor
-
Cảm ứng gen
-
Tubulin, AND…
Ưu điểm của thử nghiệm in vitro thường ít tốn kém, dễ thiết lập, có thể tiến
hành trong các hệ thống thử nghiệm ít phức tạp, tính toán kết quả nhanh, dễ kiểm soát
chất lượng thí nghiệm, có thể sử dụng tế bào người nên hạn chế được yếu điểm phải
ngoại suy từ động vật sang người. Tuy nhiên còn nhiều hạn chế: nghiên cứu thường
được đánh giá trên các đích độc lập, không cung cấp được các yếu tố thể hiện được sự
đáp ứng của cơ thể sống với thuốc, không thể hiện tác dụng trên cơ thể nguyên vẹn
nên kết quả nghiên cứu thường mang tính chất gợi ý, tham khảo nhiều hơn là để chứng
minh đánh giá tác dụng thuốc. Do đó, thường tiến hành nghiên cứu in vitro trước để
thăm dò, sàng lọc tác dụng rồi chuyển sang in vivo.
Ngày nay, với sự phát triển của di truyền học phân tử, nhiều phương pháp thử
in vitro đã được xây dựng bằng cách sử dụng các gen mã hóa cho enzym hoặc thụ thể
cấy vào tế bào phân chia nhanh như men, vi khuẩn hay tế bào ung thư làm cho các tế
bào này biểu thị các enzym hoặc thụ thể cần thiết cho phép thử. Bên cạnh đó, phương
pháp sàng lọc hiệu năng cao (high-throughput screening) ra đời đã nâng cao hiệu quả
và rút ngắn thời gian của quá trình sàng lọc. Đây là một phương pháp thử sinh học
thông thường, song sử dụng robot và hoàn toàn tự động hóa.
Xu hướng hiện nay là sử dụng các thử nghiệm sinh học đặc hiệu hơn để đưa ra
định hướng về tác dụng dược lý cho quá trình sàng lọc. Các test sàng lọc được tự động
hóa. Tuy nhiên, khi nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, sử dụng các thử nghiệm sinh
học quá đặc hiệu không phải luôn là một sự lựa chọn tốt (nguy cơ để mất các hợp chất
có tác dụng…). Do đó trong sàng lọc các hợp chất tự nhiên, trong giai đoạn đầu nên sử
dụng các thử nghiệm chung, không quá đặc hiệu. Sau khi lựa chọn các dịch chiết có
tác dụng thông qua các test sàng lọc chung, các dịch chiết này tiếp tục được nghiên
cứu sâu hơn dựa trên các test đặc hiệu hơn. Điều cần chú ý là không thể sàng lọc tất cả
các dược liệu cũng như tất cả các hợp chất trên tất cả các tác dụng dẫn đến nguy cơ bỏ
qua dược liệu tiềm năng. Một chất hiện tại không có tác dụng trên mô hình thử nghiệm
này nhưng 10 hay 20 năm sau thì có thể cho tác dụng trên các mô hình thử nghiệm
khác. Quy mô các chương trình sàng lọc khác nhau phụ thuộc vào sự kết hợp giữa các
phòng nghiên cứu, các hãng dược phẩm, sự liên kết trong nước cũng như các đơn vị
nghiên cứu nước ngoài.
3.1.
IC50 và EC50
IC50 (Inhibitory Concentration at 50%): Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử
nghiệm. IC50 cho biết nồng độ của thuốc/dịch chiết cần thiết để ức chế 50% một quá
trình sinh học nhất định (hoặc thành phần của một quá trình, tức là một enzyme, tế
bào, thụ thể tế bào hoặc vi sinh vật…). Giá trị này là một thước đo về hiệu quả của
một chất ức chế, thường được sử dụng để xem xét hiệu lực ức chế trong nghiên cứu
dược lý. Theo FDA, IC50 đại diện cho nồng độ của một loại thuốc ức chế được 50%
đối tượng thử nghiệm in vitro. IC50 được so sánh với EC50 của thuốc chủ vận. Giá trị
IC50 có thể được sử dụng để so sánh hiệu lực của hai chất đối kháng.
EC50 (Effective Concentration at 50%): Nồng độ gây ra tác động sinh học cho
50% đối tượng thử nghiệm. EC50 đại diện cho nồng độ thuốc/dịch chiết cần thiết để đạt
được 50% hiệu quả tác dụng. Giá trị EC50 có thể được sử dụng để so sánh hiệu lực tác
dụng của hai thuốc/dịch chiết.
IC50 và EC50 của một thuốc/dịch chiết có thể được xác định bằng cách xây dựng
một đường cong đáp ứng liều: Thử nghiệm bắt đầu với liều nhỏ nhất. Xác định liều lớn
nhất (Imin hay Emin) bắt đầu có khả năng ức chế hay bắt đầu có tác dụng hoạt hóa và liều
nhỏ nhất (Imax hay Emax) mà sự ức chế hay hoạt hóa không tăng lên khi tăng nồng độ
thuốc/dịch chiết. IC50 hay EC50 là nồng độ hay liều mà tại đó tạo ra đáp ứng bằng 50%
liều nhỏ nhất (Imax hay Emax).
3.2.
Thử nghiệm in vitro trên các đích tác dụng
Các đích tác dụng của thuốc có thể là enzyme, receptor màng tế bào, receptor
nhân, hormone và các yếu tố tăng trưởng, kênh vận chuyển ion, ADN và một số đích
tác dụng chưa xác định được. Đánh giá tác dụng trên receptor, enzyme hay đích tác
dụng còn nhiều hạn chế trong vấn đề ngoại suy con người, nhưng thuốc không có tác
dụng nếu không có tương tác với đích tác dụng.
Tính đặc hiệu và chọn lọc trên đích tác dụng (mục tiêu phân tử) là yếu tố cực kỳ
quan trọng một khi đích tác dụng được sử dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc. Một
thuốc càng có tác dụng chọn lọc lên một mục tiêu phân tử nhất định thì có nghĩa là
càng ít tương tác với các mục tiêu phân tử khác trong cơ thể và do đó thuốc sẽ càng có
ít tác dụng không mong muốn hơn. Sự hiểu biết rõ về enzym, thụ thể hay protein cụ
thể nào liên quan đến bệnh sinh là vô cùng quan trọng. Điều này cho phép các nhà
nghiên cứu và phát triển thuốc quyết định dùng chất chủ vận hay chất đối kháng của
thụ thể, dùng chất ức chế hay hoạt hóa enzym để can thiệp cơ chế bệnh sinh.
3.2.1. Tương tác thuốc và receptor
a. Điều kiện “gắn”:
Muốn nghiên cứu tương tác của thuốc và đích tác dụng, điều đầu tiên là chất/
dịch chiết phải “gắn” với đích tác dụng. Đo lường khả năng gắn của thuốc và đích tác
dụng đó hay xác định ái lực gắn của thuốc và đích tác dụng. Tuy nhiên cần xem xét
thuốc là chất ức chế hay chất chủ vận của đích tác dụng.
R + L* RL*
R: Tế bào/ màng sinh học có gắn receptor
L*: Thuốc gắn thêm đồng vị phóng xạ Ligant
RL*: Phức hợp thuốc-Ligant
Thuốc gắn thêm đồng vị phóng xạ (dịch chiết dược liệu thì không) nhằm giúp
máy dễ đo, dễ đếm cường độ nhấp nháy.
Nguyên tắc: Thuốc và receptor được ủ trong ống nghiệm, tiến hành lọc và rửa
qua màng lọc với cấu trúc đường kính nhỏ, giữ lại các phức hợp thuốc-Ligant (RL *),
những phân tử tự do mới có thể xuyên qua màng lọc, đi xuống dịch rửa. Tiến hành đo
nồng độ dịch rửa.
Tổng nồng độ ban đầu – Nồng độ dịch rửa = Nồng độ gắn
Gắn là điều kiện cần nhưng chưa phải là điều kiện đủ để tạo ra tác dụng. Trường
hợp thuốc gắn receptor thì phải hoạt hóa receptor, khi đó mới tạo được đáp ứng, mới
thu được tác dụng mong muốn. Sau khi thử nghiệm gắn xong, tiến hành đánh giá hiệu
quả gắn: kích thích, ức chế hay không thay đổi. Gắn mạnh chưa chắc đồng nghĩa với
hiệu lực cao. Cimetidin là thuốc kháng Histamin trên thụ thể H2 của thành dạ dày,
Cimetidin có khả năng gắn mạnh với thụ thể H2 đẩy Histamin ra ngoài, tuy nhiên hoạt
tính trên thụ thể này lại yếu.
Trong một bệnh lý có thể có nhiều đích tác dụng (receptor hay enzyme…) tham
gia vào cơ chế. Nếu thuốc không đáp ứng, không phải không có tác dụng, mà cần thử
trên các receptor khác.
b. Thăm dò chức năng:
Ủ thuốc với receptor, tiến hành đo sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối
cùng mà quá trình tương tác thuốc/dịch chiết và receptor tạo ra. Giả thuyết là nồng độ
sản phẩm tạo ra tỉ lệ thuận với khả năng tương tác thuốc với receptor. Quá trình này
giúp ta xác định 2 biến số EC50 và Emax.
Mục đích của thăm dò chức năng là xác định thuốc là chất chủ vận/đối vận hay
chủ vận từng phần của receptor. Chất chủ vận toàn phần sẽ cho giá trị E max cao nhất.
Chất chủ vận từng phần, gắn với receptor nhưng yếu hơn nên sẽ cho giá trị E max thấp
hơn. Nếu thu được đường cong nằm ngang, chất đem thử nghiệm là chất ức chế hay
đối vận.
c. Những yếu tố cần cân nhắc khi xây dựng phương pháp thử
-
Nguồn receptor: tế bào, màng tế bào (trên màng có nhiều loại receptor),
receptor tái tổ hợp. Nguồn receptor khác nhau cho khả năng gắn thuốc với receptor
cũng khác nhau. Dễ nhất là thực hiện với receptor tái tổ hợp vì không có yếu tố cản
trở, màng tế bào và tế bào có nhiều yếu tố ảnh hưởng, phải vượt qua nhiều quá trình
thuốc mới đến và gắn được vào receptor.
-
Chất (thuốc/dịch chiết) nghiên cứu: Khả năng gắn phụ thuộc vào liều hay nồng
độ làm việc.
-
Lựa chọn điều kiện ủ: thời gian, nhiệt độ
-
Lựa chọn hệ đệm cho thử nghiệm: pH
-
Lựa chọn thể tích làm việc: 50-200 µl
-
Lựa chọn phương pháp tách phần tự do/phần gắn: màng, điều kiện rửa.
d. Ý nghĩa:
Sàng lọc thuốc theo đích tác dụng: Thuốc có ái lực gắn cao với thụ thể sẽ cho
tác dụng chọn lọc, ít tác dụng phụ.
Thuốc có tác dụng trên nhiều đích, thuốc có thể tác dụng trong nhiều bệnh lý,
chỉ định của thuốc sẽ tăng lên. Tuy nhiên tính chọn lọc giảm, khả năng xuất hiện tác
dụng phụ cũng tăng lên và nguy cơ độc tính nhiều hơn.
Ái lực này phải được đánh giá trên nhiều đích tác dụng thì mới đưa ra kết quả
thuốc/dịch chiết có tác dụng chọn lọc hay không.
3.2.2. Tương tác thuốc và enzyme
Những yếu tố cần lưu ý khi xây dựng phương pháp
-
Nguồn enzym
-
Lựa chọn nồng độ enzyme
-
Lựa chọn cơ chất và nồng độ cơ chất
-
Lựa chọn nồng độ của các đồng yếu tố (cofactor)
-
Lựa chọn phương pháp phát hiện: huỳnh quang, phóng xa, đo màu
-
Lựa chọn pH
-
Lựa chọn nhiệt độ
-
Khả năng tương hợp với DMSO
Dược liệu nghiên cứu thường được đem chiết với dung môi rồi cô quay ở áp
suất thấp lấy cắn. Cắn được hòa tan để tiến hành ủ với enzyme (hoặc receptor) thông
thường sử dụng DMSO để hòa tan cắn, đây là dung môi hòa tan vạn năng. Nhưng
nồng độ DMSO không được vượt quá 0,1%, với nồng độ cao hơn sẽ ảnh hưởng đến
enzyme/receptor, nên sử dụng nồng độ DMSO thấp nhất có thể.
-
Khả năng tương hợp với dịch chiết cần thử
Lưu ý nếu bước sóng hấp thụ dịch chiết trùng với bước sóng cần đo thì sẽ gây
ảnh hưởng nhiều đến kết quả đo quang, hiệu quả đo không chính xác, lúc này cần sử
dụng phương pháp khác. Nếu bước sóng không trùng, ta sử dụng mẫu trắng (dịch chiết
mà không có enzyme hay receptor…) trong quá trình đo.
-
Phát hiện khả năng ức chế enzyme: cạnh tranh và không cạnh tranh.
3.3.
Nghiên cứu ở mức độ tế bào/ cơ quan
Mô hình này gần với sinh lý bệnh, cho ta thêm thông tin về tác dụng của thuốc/
dịch chiết. Nghiên cứu trên tế bào, thuốc thâm nhập vào bên trong tế bào, tác dụng tại
chỗ trên enzym. Ngoài ra thử nghiệm này còn cho ta biết tại nồng độ tác dụng đó thì
thuốc có độc hay không (biểu hiện ở tế bào vẫn sống hay chết).
Đối với cơ quan (ex vivo), cao hơn mức tế bào và thừa hưởng các ưu điểm của
các mô hình đơn giản phía dưới. Ở mức độ này, có sự phối hợp các loại tế bào khác
nhau cùng cho đáp ứng. Có đầy đủ sự toàn vẹn của tế bào và đầy đủ các yếu tố tham
gia đáp ứng.
4. Xử lý số liệu
Đánh giá kết quả và xử lý thống kê: Dùng phần mềm Excel, SPSS…
Chuyển tải thông tin vào máy, mã hóa thông tin dạng số để dễ xử lý.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bohlin L., Bruhn Jan G. (Eds.) (1999), Bioassay Methods in Natural Product
Research and Drug Development, Springer Science + Business Media.
2. Jose V. Castell, Maria Jose Gmez-Lechn (1996), In Vitro Methods in
Pharmaceutical Research, Academic Press.
3. Eisenbrand G., Pool-Zobel B., Baker V., Balls M, Blaauboer BJ., Boobis
A., Carere A., Kevekordes S., Lhuguenot JC., Pieters R., Kleiner J. (2002),
Methods of in vitro toxicology, Food and Chemical Toxicology, 40(2-3), 193236.
4. Mon M. M., Maw S. S., and Oo Z. K. (2011), Screening of Antioxidant, Antitumor and Antimicrobial Herbal Drugs/Diets from Some Myanmar Traditional
Herbs, International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics,
1(2), 142-147.
- Xem thêm -