Tài liệu Luận văn thạc sỹ: phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase

  • Số trang: 94 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 64 |
  • Lượt tải: 0
vndoc

Đã đăng 7399 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ PHƢƠNG DUNG PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T. BLAKE) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn THAI NGUYEN UNIVERSITY COLLEGE OF EDUCATION LE PHUONG DUNG CLONING PROMOTER REGION OF GENE ENCODING CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) AND CONSTRUCTING PLANT TRANSFORMATION VECTOR CARRYING CINNAMOYL CoA REDUCTASE GENE FROM EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T. BLAKE Speciality: Genetics Code: 60.42.70 MASTER’S THESIS SUMMARY Supervisor: Dr. Nguyen Huu Cuong Thai Nguyen, 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Lê Phƣơng Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 1.1. Tổng quan về cây bạch đàn ......................................................................... 1.2. Tình hình trồng bạch đàn ở Việt Nam........................................................ 1.3. Tình hình sinh trƣởng của cây bạch đàn ở Việt Nam ……………………. 1.4. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật ..................................... 1.4.1. Lignin .................................................................................................. 1.4.2. Chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật ............................................. 1.4.3. Giới thiệu về gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) 1.5. Tổng quan về promoter ............................................................................... 1.5.1. Mô hình điều hoà biểu hiện gen ở sinh vật nhân chuẩn. ....................... 1.5.2. Cấu trúc và chức năng của promoter .................................................... 1.5.3. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học ........................... 1.5.4. Promoter điểu khiển hoạt động gen ở tầng xylem Error! Bookmark not defined. 1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 2.1.1. Vật liệu: ............................................................................................... 2.1.2. Hoá chất:.............................................................................................. 2.1.3. Máy móc, thiết bị ................................................................................. 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.2.1. Phƣơng pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme CAD trên ngân hàng gen quốc tế ....................................................................... 2.2.2. Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter. .................................... 2.2.3. Tách chiết và tinh sạch DNA – RNA từ mô gỗ .................................... 2.3.4. Tổng hợp cDNA 2.2.5. Khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn gen CCR bằng phản ứng PCR ..... 2.2.6. Phƣơng pháp tách dòng ....................................................................... 2.2.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error! Bookmark not defined. 2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự của gen. ............................................... 2.2.9. Phƣơng pháp Gateway. ........................................................................ CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 3.1. Tách chiết DNA bạch đàn........................................................................... 3.2. Khuếch đại promoter bằng PCR ................................................................. 3.3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter EuCAD .............................. 3.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR và tạo vector tái tổ hợp .................................... 3.3.2. Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5. ................ 3.3.3. Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp. ..................................... 3.3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp ................................................................... 3.3.5. Kết quả đọc trình tự nucleotide của hai đoạn promoter CAD1 và CAD2.... 3.3.6. Phân tích các nhân tố điều hòa dạng cis có mặt trong trình tự của promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake..... ............................................................................................................ 3.3.7. Kết quả đăng tải trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase tại ngân hàng gen quốc tế NCBI ................................... KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………. TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết … 19 Bảng2.2. Thành phần dung dịch đệm tách chiết ... 21 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khử DNA ... 22 Bảng 2.4A. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23 Bảng 2.4B. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ... 23 Bảng 2.4C. Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA ... 24 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR ... 24 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng ..26 Bảng 2.7. Thành phần hoá chất tách plasmid .. 28 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt ... 29 Bảng 2.9. Thành phần phản ứng colony-PCR ...29 Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối ... 31 Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR ... 32 Bảng 2.12. Thành phần phản ứng LR ... 33 Bảng 2.13. Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR .. 34 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của các mồi ... 35 Bảng 3.2. Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi CCR entr-F, CCR-R ... 52 Bảng 3.3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng XhoI ... 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc cơ bản của lignin …………………………………... 9 Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin trong thực vật .................................................. 10 Hình 1.3.Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B)..15 Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ......................................................... 25 Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT ..................................................................................... 26 Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR ........................................... 30 Hình 2.4. Sơ đồ vector pENTRTM/D-TOPO ......................................................... 31 Hình 2.5. Sơ đồ vector pBENDER .................................................................... 32 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn ....................... 34 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 .................... 35 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 .................... 36 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh sạch.....37 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh sạch .37 Hình 3.6: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến .................... 39 Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .....41 Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc .... 41 Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α ……. 42 Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1 ................................................................................................................ 43 Hình 3.11: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2 ................................................................................................................. 44 Hình 3.12: Kết quả điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 và CAD2 ................................................................................................................. 45 Hình 3.13: Kết quả so sánh trình tự DNA với gen CAD của E. gunnii ............ 46 Hình 3.14: Kết quả phân tích promoter của gen CAD ……………………….. 48 Hình 3.15: Kết quả điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% .............................. 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Hình 3.16: Kết quả điện di khử DNA ................................................................ 51 Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR .......................................... 53 Hình 3.18. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% .... 54 Hình 3.19. Kết quả dựng cây phát sinh chủng loại của gen CCR ..................... 56 Hình 3.20. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến E.Coli DH5 ...... 56 Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid pENTR/CCR .... 58 Hình 3.22. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR ... 59 Hình 3.23. Kết quả colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F và CCR R .... 61 Hình 3.24. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR .... 61 Hình 3.25. Kết quả cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR bằng enzyme XhoI .. 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Cường – Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN cùng toàn thể cán bộ nhân viên trong khoa đã tạo mọi điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn này. Thái Nguyên, ngày 09 tháng 9 năm 2009 Học viên Lê Phương Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT bp base pair cDNA Complementary DNA DNA Deoxyribonucleic Acid DEPC Diethyl pyrocarbonate dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen dimine tetra acetic acid g/l Gam/lít IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside Kb Kilobase kDa KiloDalton LB Luria Bertani mg/l miligam/lít OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris - Acetic acide - EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TE Tris – EDTA v/p vòng/phút X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 1. Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng. NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 311- 317. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. Nxb Giáo Dục, tr101-112. 3. Trần Duy Hưng, Đỗ Ngọc, Nguyễn Thị Chương (1991), Cây rừng. Trường công nhân Kỹ thuật Lâm nghiệp 4, Bộ Lâm nghiệp, tr. 96 – 100. 4. Nguyễn Dương Tài (1994). Bước đầu khảo nghiệm xuất xứ bạch đàn Eucalyptus urophylla S.T. Blake tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc Bộ, Việt Nam. Luận án PTS khoa học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam. 5. Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình Sinh lý thực vật. NXB Hà Nội, tr 214 – 221. 6. Hà Văn Tuế (1993), Nghiên cứu cấu trúc và năng suất của một số quần xã rừng trồng nguyên liệu giấy tại vùng trung du Vĩnh Phú. Tóm tắt luận án tiến sĩ sinh học. Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội, 24trang. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 7. A. Baghdady, A.-S. Blervacq, L. Jouanin, J. Grima-Pettenati, P. Sivadon, S. Hawkins (2006), Eucalyptus gunnii CCR and CAD2 promoters are active in lignifying cells during primary and secondary xylem formation in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry 44, pp. 674–683. 8. Aldwin M. Anterola, Norman G. Lewis (2002), Trends in lignin modification: a comprehensive analysis of the effects manipulations/mutations on lignification and vascular of genetic integrity. Phytochemistry 61 (2002) 221–294. 9. Artem Evdokimov, DNA cloning for protein expression using Gateway© technology. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 10. Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto D.S., Yellanki P., Carlson J.E. (2009), The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and expression. BMC Plant Biology. 9(26): 1-15. 11. Chiang, V. L., (2006). Understanding Gene Function and Control in Lignin Formation in Wood. NABC Report. 12. Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin. Volume 4, number 4. 13. Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima P.J. (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants. Plant Molecular Biology. 4(27): 651-667. 14. Fiona S. Poke1, René E. Vaillancourt, Robert C. Elliott and James B. Reid (2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2). Molecular Breeding 12: 107–118, 2003. 15. Gawel N. J. and Jarret R. L. (1991), A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 3(9): 262-266. 16. Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J. (2005), EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem, regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis. The Plant Journal. 43(4): 553-567. 17. Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W. and Xiangning J. (2003), Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco. Plant Growth Regulation. 41: 279-286. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 18. Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J. C. (1997), Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of promoter activity in transgenic Poplar. Plant Physiology. 113: 321-325. 19. Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai C.J. & Chiang V.L. (1999), Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature Biotechnology. 17: 808-812. 20. Johan Wadenback, Sara von Arnold, Ulrika Egertsdotter, Michael H. Walter, Jacqueline Grima-Pettenati, Deborah Goffner, Goran Gellerstedt, Terry Gullion, David Clapham (2008), Lignin biosynthesis in transgenic Norway spruce plants harboring an antisense construct for cinnamoyl CoA reductase (CCR). Transgenic Res (2008) 17:379–392 21. Kim S.J., Kim M.R., Bedgar D.L., Moinuddin S.G., Cardenas C.L., Davin L.B., Kang C., Lewis N.G. (2004), Functional reclassification of the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101:1455-1460. 22. Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase: Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar. Plant Physiol 113: 321-325. 23. Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P. and Grima P.J. (2002), The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species. Plant molecular biology. 50(3): 497509. 24. Matthieu Chabannes, Abdellah Barakate, Catherine Lapierre, Jane M. Marita, John Ralph, Michel Pean, SaoEda Danoun1, Claire Halpin, Jacqueline Grima-Pettenati and Alain Michel Boudet1 (2001), Strong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn decrease in lignin content without significant alteration of plant development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in tobacco plants. The Plant Journal (2001) 28(3), 257±270. 25. pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kits (6 April 2006). Invitrogen 26. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Vol. 1, 2, and 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 27. Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase: Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar . Plant Physiol 113: 321-325. 28. Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana Hasegawa, Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura, Toshiaki Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), Cinnamoyl-CoA reductase, a key enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small GTPase Rac in defense signaling in rice. PNAS vol. 103 no. 1, pg. 230–235. 28. Whettena R. and Sederoffa R. (1995), Lignin Biosynthesis. The Plant Cell. 7: 1001-1013. 29. Xu Q., Wen X.P., and Deng X.X. (2004), A Simple Protocol for Isolating Genomic DNA from Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt) for RFLP and PCR Analyses. Plant Molecular Biology Reporter. 22: 301a-301g. TÀI LIỆU WEB 30. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 31. http://www.community.h2vn.com/index.php?action=printpage%3Btopi c=061.0. 32. http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem. 33. http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/webin.html. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Phụ lục 1. Kết quả phân tích độ tương đồng giữa 26 loài thực vật 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 Zea_mays 2 Arabidopsis_thaliana 0.49 3 Lycopersicon_esculentum 0.52 0.38 4 Hordeum_vulgare 0.17 0.42 0.49 5 Triticum_aestivum 0.18 0.43 0.51 0.05 6 Vitis_vinifera 1.00 0.94 0.86 0.91 0.96 7 Solanum_tuberosum 0.46 0.36 0.19 0.45 0.49 0.94 8 Saccharum_officinarum 0.07 0.48 0.53 0.15 0.19 0.98 0.47 9 Populus_trichocarpa 0.39 0.34 0.28 0.36 0.38 0.87 0.27 0.39 10 Prunus_persica 0.41 0.35 0.30 0.39 0.40 0.80 0.24 0.42 0.21 11 Capsicum_annuum 0.43 0.36 0.19 0.40 0.43 0.88 0.09 0.43 0.27 0.25 12 Fragaria_ananassa 0.39 0.34 0.32 0.38 0.41 0.89 0.25 0.41 0.25 0.16 0.25 13 Eucalyptus_globulus 1.34 1.31 1.24 1.25 1.24 1.63 1.28 1.40 1.28 1.33 1.22 1.33 14 Linum_album 0.39 0.36 0.33 0.39 0.41 0.87 0.31 0.41 0.27 0.29 0.30 0.28 1.27 15 Eucalyptus_gunnii 0.37 0.38 0.36 0.35 0.36 0.81 0.32 0.38 0.25 0.25 0.30 0.27 1.41 0.31 16 Eucalyptus_nudicaulis 1.34 1.29 1.24 1.23 1.24 1.61 1.28 1.38 1.25 1.35 1.21 1.34 0.03 1.28 1.41 17 Eucalyptus_chloroclada 1.37 1.32 1.25 1.26 1.25 1.63 1.28 1.40 1.29 1.38 1.21 1.37 0.04 1.31 1.44 0.02 18 Eucalyptus_brassiana 1.34 1.30 1.23 1.23 1.23 1.63 1.28 1.37 1.27 1.34 1.20 1.35 0.03 1.27 1.40 0.01 0.01 19 Eucalyptus_cordata 1.33 1.29 1.23 1.23 1.23 1.60 1.27 1.38 1.27 1.32 1.20 1.31 0.01 1.26 1.40 0.03 0.03 0.02 20 Eucalyptus_vicina 1.35 1.30 1.24 1.24 1.24 1.59 1.27 1.38 1.26 1.35 1.20 1.34 0.03 1.29 1.41 0.01 0.01 0.01 0.03 21 Eucalyptus_saligna 0.39 0.38 0.36 0.36 0.37 0.83 0.32 0.40 0.25 0.25 0.30 0.26 1.36 0.31 0.02 1.36 1.39 1.35 1.35 1.36 22 Eucalyptus_blakelyi 1.36 1.31 1.25 1.25 1.26 1.61 1.28 1.39 1.27 1.37 1.21 1.35 0.04 1.30 1.42 0.01 0.02 0.01 0.03 0.00 1.37 23 Eucalyptus_alba 1.32 1.29 1.23 1.21 1.22 1.67 1.31 1.36 1.27 1.34 1.23 1.32 0.03 1.28 1.40 0.02 0.03 0.02 0.03 0.02 1.35 0.03 24 Eucalyptus_punctata 1.32 1.26 1.22 1.21 1.21 1.57 1.26 1.35 1.24 1.32 1.20 1.30 0.03 1.25 1.38 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 1.33 0.03 0.02 25 Eucalyptus_grandis 1.36 1.29 1.23 1.23 1.25 1.59 1.28 1.39 1.28 1.35 1.21 1.34 0.03 1.27 1.39 0.01 0.02 0.02 0.03 0.02 1.35 0.02 0.02 0.02 26 Eucalyptus_urophylla 0.39 0.38 0.35 0.36 0.37 0.81 0.32 0.39 0.25 0.25 0.30 0.27 1.36 0.31 0.02 1.37 1.39 1.35 1.36 1.37 0.02 1.38 1.35 1.34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 25 1.35 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1.1. Lý do chọn đề tài Lignin là một trong hai loại polymer sinh học phổ biến trong cây, sau cellulose. Nó chiếm khoảng 30% lượng cacbon hữu cơ trong sinh quyển và gần 35% lượng vật chất khô trong gỗ của các loài thực vật. Quá trình tổng hợp lignin là một trong những cách thức thích nghi của thực vật trong quá trình tiến hóa khi thực vật thay đổi môi trường sống từ nước lên cạn. Lignin giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc thành tế bào và thân. Thêm vào đó lignin tham gia vào quá trình vận chuyển nước, các chất dinh dưỡng thông qua hệ thống bao mạch và giữ vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự chắc chắn của cây trong không gian, cũng như bảo vệ cây khỏi các nhân tố gây bệnh [7]. Hàm lượng lignin cao trong gỗ giúp gỗ bền. Bởi vậy, nó là nguyên liệu thô tốt cho nhiều ứng dụng (trong xây dựng, nội thất,...) và là một loại nhiên liệu hoàn hảo. Tuy nhiên trong một số lĩnh vực như sản xuất sợi, sản xuất giấy thì hàm lượng lignin cao lại là một trở ngại. Việc loại bỏ lignin trong quy trình sản xuất bột gỗ bằng cách xử lý hóa học là một trong những biện pháp tốn kém đối với điều kiện kinh tế và môi trường nước ta hiện nay [27]. Vậy làm thế nào để điều chỉnh được hàm lượng lignin trong cây theo hướng có lợi cho bản thân sinh vật và con người, như: tăng hàm lượng lignin trong cây trồng làm nhiên liệu, trong xây dựng, trong cây nông nghiệp (cây lúa – chống đổ) hay giảm hàm lượng lignin trong cây bạch đàn nhằm tạo thuận lợi cho quá trình sản xuất giấy. Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu (chủ yếu là ở nước ngoài) về lignin, quá trình sinh tổng hợp lignin, các enzyme tham gia vào quá trình này như enzyme cinnamoyl coenzymeA reductase (CCR) và enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD), nhưng đa phần là trên các cây mô hình (Arabidopsis thaliana, Populus trichocarpa) [7],[10],[18]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Nhằm mục đích điều khiển sự biểu hiện của một số enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp lignin ở mô phân sinh gỗ cho một số đối tượng cây lâm nghiệp bằng phương pháp chuyển gen, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake)” làm vật liệu để thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen ở thực vật. 1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục tiêu Tách dòng, phân tích trình tự promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake). 1.2.2. Nội dung nghiên cứu - Tập hợp thông tin về trình tự nucleotide đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) và trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coA dehydrogenase (CCR) đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để thiết kế cặp mồi khuếch đại đoạn gen này từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake). - Tách dòng, phân tích trình tự đoạn promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme CCR từ cây bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T. Blake). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.Lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây bạch đàn Chi Bạch đàn Eucalyptus thuộc họ Sim Myrtaceae có hơn 700 loài, hiện đã được trồng ở hơn 30 nước trên thế giới từ vĩ độ 580 Bắc đến 460 Nam. Bạch đàn mọc tự nhiên và có nguồn gốc từ châu Úc, chúng có thể sinh trưởng dưới một phổ sinh thái rộng như tập trung ở các vùng thấp ven biển, nhưng cũng có thể mọc ở những vùng cao (2000m so với mặt biển) hay vùng khô cạn (sa mạc hoặc bán sa mạc) [4]. Cây bạch đàn thuộc loại đại mộc, cao 25 – 50m, có cây cao tới 100m. Đường kính thường đạt 120-180 cm. Vỏ ngoài màu xám trắng hoặc nâu, đỏ nâu, xám xanh…, bong mảng hoặc nứt dọc, vỏ thân chứa tinh dầu Eucalyptone thơm mùi dầu tràm. Lá đơn, khi cây còn non lá thường mọc đối, sau đó có dạng lá đơn mọc cách, không có lá kèm; mép lá nguyên, phiến lá dày, gân phụ thường nối với nhau ở đầu gân thành một đường song song với mép lá. Hoa lưỡng tính, nụ hình thoi. Khi hoa nở nửa trên hình chóp nón rụng đi, để lộ nhị và nhụy. Nhị nhỏ, rời nhau, rất nhiều, màu trắng vàng. Nhuỵ có bầu trung, một phần gắn liền với ống đài, một phần nhô lên. Quả khô, khi chín nứt ở đỉnh. Hạt nhiều, thường có góc cạnh, rất nhỏ. Ngày nay bạch đàn là một trong những loài cây gỗ lâm nghiệp rất quan trọng, được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và ôn đới, giữa các vĩ độ 45oN và 40oB như: Braxin, Trung Quốc, Ấn Độ, … với diện tích canh tác khoảng 12 triệu hecta [4]. Ở Việt Nam đã gây trồng bạch đàn từ những năm 1930 ở cả hai miền Nam, Bắc. Hiện nay có 10 loài bạch đàn đang được trồng phổ biến là: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.Lrc-tnu.edu.vn
- Xem thêm -