Tài liệu Luận văn thạc sĩ xây dựng cơ sở dữ liệu về tần số allele 22 locus đa hình str trên nhiễm sắc thể thường ở quần thể người mông tại hà giang, việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Huyền Linh XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU VỀ TẦN SỐ ALLELE 22 LOCUS ĐA HÌNH STR TRÊN NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG Ở QUẦN THỂ NGƯỜI MÔNG TẠI HÀ GIANG, VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Huyền Linh XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU VỀ TẦN SỐ ALLELE 22 LOCUS ĐA HÌNH STR TRÊN NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG Ở QUẦN THỂ NGƯỜI MÔNG TẠI HÀ GIANG, VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: BIO2018 LUẬN VĂN THẠC SĨ Công nghệ sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. Chu Hoàng Hà Hà Nội - 2020 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan những nội dung viết trong luận văn là do sự tìm tòi, học hỏi và nghiên cứu của bản thân với sự hướng dẫn tận tình của PGS. TS. Chu Hoàng Hà và các đồng nghiệp tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mọi kết quả nghiên cứu cũng như ý tưởng của các tác giả khác (nếu có) đều được trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chưa được bảo vệ tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào và cũng chưa được công bố trên bất kỳ phương tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên. Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2020 Người cam đoan Trần Huyền Linh Lời cảm ơn Để hoàn thành được Luận văn cao học này, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến PGS. TS. Chu Hoàng Hà đã trực tiếp định hướng, hướng dẫn tôi một cách tận tình và giúp đỡ tôi xây dựng ý tưởng để hoàn thiện luận văn. Tôi xin cảm ơn tập thể lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, lãnh đạo và cán bộ Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen – Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo cùng các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp, những người đã luôn động viên, tạo điều kiện cho thôi hoàn thành luận văn này./. Học viên Trần Huyền Linh Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Chữ viết tắt Nội dung ADN Deoxyribonucleic acid nt nucleotide FTA Tên riêng của một loại giấy thu mẫu máu NST nhiễm sắc thể STR Short tandem repeat PCR Polymerase chain reaction MP Match probability DC Discrimination capacity PE Power of Exclusion PIC Polymorphic information content PI Paternity Index RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism ESS European Standard Set FBI Federal Bureau of Investigation VNTR Variable number of tandem repeat EH Expected Heterozygosity OH Observed Heterozygosity NJ Neighbor Joining SWGDAM Scientific Working Group on DNA Analysis Methods LD Linkage - Disequilibrium Danh mục các bảng Bảng 1.1. Thông tin về vị trí và tốc độ đột biến của một số locus thường dùng theo cơ sở dữ liệu STRbase .............................. 15 Bảng 1.2. Thông tin về vị trí và trình tự của một đơn vị lặp của các locus có trong bộ kit PowerPlex Fusion System theo thông tin của nhà sản xuất ...19 Bảng 2. Bảng thành phần phản ứng khuếch đại ..................29 Bảng 3.1. Số lượng allele mỗi locus ..........................33 Bảng 3.2. Bảng tần số allele 22 locus STR trên NST thường của Mông, tại Hà Giang - Việt Nam ......................................35 Bảng 3.3. Các allele có tần số thấp phát hiện được trong quần thể ......41 Bảng 3.4. Kết quả kiểm định cân bằng HWE bằng phần mềm Arlequin v3.5 ..................................................42 Bảng 3.5. Kết quả tính các chỉ số EH và OH của từng locus ..........44 Bảng 3.6. Bảng ma trận đánh giá linkage disequilibrium của các locus ...46 Bảng 3.7. Các chỉ số MP, PE, DC và PIC của các locus .............51 Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Các locus thuộc bộ CODIS của FBI và vị trí trên NST người ....5 Hình 1.2. Kết quả các băng thu được sau phân giải bằng enzyme giới hạn và lai Southern của một đại gia đình ..............................12 Hình 1.3. Kết quả thu được so sánh giữa hai phương pháp sử dụng nhiều locus và các đơn locus dựa trên phương pháp RFLP ...................13 Hình 1.4. Hình ảnh kết quả điện di mao quản của một số locus sử dựng phương pháp PCR và gắn huỳnh quang trên mỗi locus ...................13 Hình 1.5. Cơ chế sinh đột biến STR do gấp đoạn trong quá trình nhân bản 16 Hình 1.6. Quá trình xác định kích thước của một allele dựa trên ô thang chuẩn ........................................................................................................................ 19 Hình 1.7. Sự phân bố các nhánh ngôn ngữ thuộc hệ Mông - Dao tại Việt Nam. ..................................................24 Hình 1.8. Cây phát sinh chủng loại miêu tả mối quan hệ di truyền gần gũi giữa quần thể người Kinh và một số quần thể khác ...................25 Hình 2.1. Bản đồ hành chính tỉnh Hà Giang .....................26 Hình 2.2. Độ dài và loại dye được sử dụng cho mỗi locus trong bộ kit ...28 Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại với 28 chu kỳ ......29 Hình 3.1. Biểu đồ màu theo giá trị chỉ số MP của từng locus..........47 Hình 3.2. Biều đồ màu theo giá trị chỉ só PE của từng locus ..........48 Hình 3.3. Biều đồ màu theo giá trị DC của từng locus ..............49 Hình 3.4. Biểu đồ màu theo giá trị của chỉ số PI của các locus .........50 Hình 3.5. Hình ảnh giao diện phần mềm STR-VN version 1.0 .........52 Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại về mối tương quan di truyền giữa người Mông và các quần thể khác ...............................54 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................5 1.1. Tổng quan về đoạn lặp ngắn ngẫu nhiên – STR ...........5 1.1.1. Short tandem repeat – STR .......................5 1.1.2. Bộ kit Powerplex Fusion system được sử dụng trong giám định .........................................18 1.1.3. Cơ sở dữ liệu tần số STR ........................21 1.1.4. Di truyền quần thể và dân tộc .....................21 1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .............24 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................26 2.1. Nguyên vật liệu ................................26 2.1.1. Địa điểm thu mẫu.............................26 2.1.2. Thu thập và bảo quản ..........................27 2.2. Phương pháp nghiên cứu .........................27 2.2.1. Khuếch đại đoạn gen ..........................27 2.2.2. Tính toán tần số và các chỉ số pháp y ................30 2.2.3. Xác định mối liên hệ giữa quần thể người Mông tại Hà Giang và các quần thể khác ..................................31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................32 3.1. Kết quả thu mẫu và khuếch đại ADN .................32 3.2. Kết quả tính tần số các locus và xác định các allele có tần số thấp ...........................................34 3.3. Kết quả phân tích thống kê ........................42 3.3.1. Kiểm định cân bằng Hardy-Weinberg ...............42 3.3.2. Gía trị dị hợp tử mong đợi và quan sát được ...........44 3.3.3. Kiểm tra tính di truyền liên kết của các locus STR .......45 3.4. Kết quả phân tích các chỉ số pháp y ..................47 2 3.4.1. Chỉ số khả năng trùng hợp ngẫu nhiên - Match probability (MP) .........................................47 3.4.2. Chỉ số khả năng loại trừ - Power of Exclusion ..........47 3.4.3. Chỉ số khả năng phân biệt – Discrimination capacity......48 3.4.4. Chỉ số đa hình - Polymorphic information content .......49 3.4.5. Chỉ số Parternity index – PI ......................49 3.5. Các chỉ số pháp y đánh giá tần số các allele của một quần thể 50 3.6. Kết quả phân tích mối tương quan di truyền với các quần thể khác ...........................................52 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................55 4.1. Kết luận .....................................55 4.2. Kiến nghị ....................................56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................57 PHỤ LỤC ..........................................62 Phụ lục 1: Kết quả khuếch đại các locus STR của mẫu đối chứng dương ...........................................62 Phụ lục 2: Kết quả khuếch đại các locus STR của mẫu đối chứng âm63 Phụ lục 3: Kết quả kiểm định Chi-square các cặp locus về lingkage disequilirium ......................................64 Phụ lục 4: Thông tin các mẫu tham gia đề tài ................85 3 MỞ ĐẦU Short tandem repeat - STR là các đoạn trình tự ngắn, được cấu thành bằng sự lặp lại của khoảng 2 – 7 nucleotide. Trong hệ gen của người, các STR nằm rải rác khắp nơi, chúng nằm trong vùng không mã hóa, giữa các gen và chiếm khoảng 3% hệ gen người. Do vị trí đặc thù của STR, chúng có độ đa dạng cao về độ dài và trình tự lặp lại mà không ảnh hưởng đến hoạt động sống của con người. STR có tính bảo thủ cao, được truyền từ bố mẹ sang con cái, vì vậy mà các STR khác nhau giữa các cá thể khác nhau không có quan hệ huyết thống trực hệ. STR là các chỉ thị phân tử được ứng dụng rộng rãi trong các phân tích khoa học hình sự, cụ thể là công tác xác định danh tính, là công cụ đắc lực trong các vụ án hình sự phức tạp như cưỡng hiếp tập thể hoặc khi các dấu vết còn sót tại hiện trường không đủ cung cấp thông tin cho công tác điều tra [1], [2]. STR cũng được sử dụng trong nghiên cứu di truyền quần thể hay cho mục đích khảo cổ học. Mỗi một quần thể người đều có những đặc trưng sinh học riêng biệt hình thành trong quá trình sống qua nhiều thế hệ, trong đó ở cấp độ ADN, được thể hiện bằng sự phân bố khác nhau về tần suất allele trong mỗi nhóm dân tộc [3]. Việc thu thập dữ liệu STR các dân tộc sinh sống tại Việt Nam đã và đang được triển khai rộng khắp kể từ những năm 2000. Ngoài ứng dụng trong phân tích gen hình sự, các kết quả khảo sát còn được sử dụng trong nghiên cứu độ đa dạng về mặt nhân chủng học và xây dựng cơ sở dữ liệu về tần số phân bố allele trong quần thể người Việt Nam [4]–[6]. Tuy nhiên, việc thu thập dữ liệu nhiều dân tộc thiểu số vùng cao còn gặp nhiều khó khăn do địa bàn cư trú cách biệt và dân số thấp. Không chỉ vậy, Việt Nam cũng nằm trong vùng địa lý có lịch sử nhân chủng học rất phức tạp, đang còn nhiều tranh cãi về nguồn gốc, con đường hình thành các chủng người hiện đại đang sinh sống đó là khu vực Đông Nam Á [7]–[10]. Do đó nghiên cứu về các quần thể người sinh sống tại Việt Nam nói chung, về người Mông nói riêng còn rất hạn chế và chưa có một nghiên cứu chính thức nào được tiến hành. Thực trạng đặt ra yêu cầu cấp thiết là phải xây dựng bộ cơ sở dữ liệu STR cho nhóm dân tộc Mông sinh sống tại Việt Nam nhằm lưu trữ và phục vụ cho truy xuất nguồn gốc, xác định danh tính trong công tác giám định pháp y, 4 cũng như cho công tác nghiên cứu di truyền học, nhân chủng học và bảo tồn tại Việt Nam. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng cơ sở dữ liệu về tần số allele 22 locus đa hình STR trên nhiễm sắc thể thường ở quần thể người Mông tại Hà Giang, Việt Nam”, nhằm : i) Xây dựng bộ số liệu tần số allele của 22 locus đa hình STR trên nhiễm sắc thể thường của người Mông; ii) Đánh giá các chỉ số thống kê đặc trưng của tần số allele, chỉ số đa dạng di truyền của quần thể; iii) Xác định mối quan hệ di truyền của người Mông với các quần thể gần gũi khác. Ý nghĩa của nghiên cứu : Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu tần số STR nhiễm sắc thể thường phục vụ cho công tác giám định gen, xác định huyết thống và nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể. 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về đoạn lặp ngắn ngẫu nhiên – STR 1.1.1. Short tandem repeat – STR 1.1.1.1. STR là gì ADN đã được ứng dụng trong thực tế nghiên cứu pháp y từ thế kỉ XX, đi cùng với sự phát triển của công nghệ giải mã hệ gen người. Trong công tác giám định pháp y, dấu hiệu sinh học dựa trên ADN cung cấp rất nhiều thông tin đặc biệt quan trọng và cũng là một bước nhảy của khoa học hình sự. ADN mang những đặc điểm hóa sinh ưu thế khi mà các dấu vết sinh học khác còn có thể thu thập được ở hiện trường thường rất ít, bị phân hủy nhanh chóng và tiêu tốn thời gian. Hàng nghìn vụ án đã được đưa ra ánh sáng với sự hỗ trợ đắc lực của công nghệ giám định ADN. Hiện nay, đối với giám định ADN trong khoa học hình sự cả trong và ngoài nước thì các chỉ thị short tandem repeats (STR) được sử dụng rất phổ biến do dựa trên phản ứng khuếch đại gen – polymerase chain reaction (PCR), có độ đặc hiệu cao cũng như cho phép thực hiện đối với Hình 1.1 Các locus thuộc bộ CODIS của FBI và vị trí trên NST người 6 các loại mẫu phức tạp. Điển hình các tổ chức lớn như FBI (Federal Bureau of Investigation) đã công bố quy trình thường quy cho sử dụng 13 locus STR (CODIS) (Hình 1.1) hay Interpol cũng xác định bộ 10 locus STR chuẩn cho nước Anh và các nước Châu Âu cho công tác giám định xác định danh tính. Tại Việt Nam, việc sử dụng STR trong công tác giám định xác định danh tính cũng được sử dụng thường quy tại các viện Pháp y trong cả nước. STR là đoạn trình tự đa hình nằm trong vùng không mã hóa, có cấu trúc gồm các đoạn lặp lại của một trình tự nt có độ dài khoảng 2 – 7 bp, chiếm khoảng 3% hệ gen người. Do nằm ngoài vùng mã hóa, các STR rất đa dạng giữa người với người về độ dài (có thể lên đến hàng nghìn base), trình tự đoạn lặp mà không ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của tế bào. Các đoạn lặp lại này nằm rải rác ở khắp nơi trong hệ gen của người. Từ những năm 1990 đến nay đã có hàng chục nghìn STR trên các nhiễm sắc thể (NST) được phát hiện. Trong quá trình phân bào, các đoạn STR này không bị phân cắt, chúng có tính bảo thủ cao. Ngoại trừ trường hợp song sinh cùng trứng, số lượng lặp lại của các STR là độc nhất cho từng cá thể, được di truyền từ bố mẹ sang con cái và phân biệt các cá thể không có quan hệ huyết thống trực hệ. Do đó các cá thể này sẽ mang bộ số lượng đoạn lặp lại khác nhau của các STR [1], [2]. Bộ chỉ thị gồm nhiều các STR nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau cho phép phân biệt các cá thể riêng biệt, ngay cả với những cá thể có quan hệ họ hàng gần gũi. Đối với nghiên cứu di truyền quần thể, cơ sở di truyền của nghiên cứu dựa trên hai định luật căn bản của di truyền học Mendel đó là định luật di truyền phân ly độc lập và định luật di truyền phân ly. Do đó, các chỉ số về di truyền liên kết cân bằng và cân bằng Hardy-Weinberg được kiểm định đồng thời các phép tính thống kê được sử dụng nhằm tăng tính chính xác, giảm sai số trong phân tích [11]. Trong giám định hình sự, xác định danh tính có thể được hiểu là sự so sánh hồ sơ ADN của một người nào đó, lấy từ mẫu sinh học vương lại hoặc từ 7 các dấu vết như vết máu tại hiện trường của một vụ án với một người khác có mối liên quan nhằm xác định danh tính hoặc loại trừ khả năng. 1.1.1.2. Phân loại và danh pháp STR được phân loại dựa trên số lượng nucleotide được lặp lại, ví dụ dinucleotide cho 2 nucleotide, trinucleotide cho 3 nucleotide… Tuy nhiên, STR cũng có thể phân loại bằng một vài cách khác dựa trên tính phức tạp của trình tự lặp lại. Các STR đơn giản là các STR cấu thành bởi sự lặp lại của một trình tự nucleotide (ví dụ (GATA)n) hay STR phức là các đoạn được cấu thành bởi sự lặp lại của 2 hoặc nhiều hơn trình tự nucleotide (ví dụ (CG)m– (CA)n). Danh pháp hay tên của từng đoạn STR được đặt theo tên của gen nếu locus này nằm một phần hoặc nằm toàn bộ trong gen. Ví dụ chỉ thị STR TH01 có nguồn gốc từ tên gen tổng hợp enzym tyrosine hydroxylase của người, nằm trên NST số 11. Chữ "TH" xuất phát từ chữ cái đầu tyrosine hydroxylase. Phần "01" của ký hiệu "TH01" xuất phát từ vùng intron 1 của gen tổng hợp enzym tyrosine hydroxylase. Các trình tự ADN nằm ngoài vùng gen thì được xác định tên bằng vị trí của chúng trên NST. Ví dụ như locus D5S818 hay DYS19 là các locus nằm ngoài vùng gen mã hóa, chữ “D” kí hiệu cho ADN, các kí hiệu tiếp theo lần lượt là NST số 5/ Y cho NST Y; “S” có nghĩa là trình tự chỉ có một bản copy trên genome; con số cuối tên là thứ tự chỉ thị này được phát hiện và sắp xếp theo từng NST cụ thể. 1.1.1.3. Các chỉ thị STR thiết yếu Đối với công tác giám định, việc sử dụng một bộ các chỉ thị theo một tiêu chuẩn là cần thiết vì sự chính xác và đồng nhất của các kết quả giám định. Bộ các chỉ thị được sử dụng rộng rãi ngày nay đã được nghiên cứu và phát triển ở phòng thí nghiệm của tiến sĩ Thomas Caskey tại Trường đại học Y khoa 8 Baylor cùng với viện Forensic Science Service tại Anh thực hiện vào đầu những năm 1990. Những chỉ thị này được sử dụng nhiều hơn trong các kit xét nghiệm của hãng Promega (Mỹ) so với kit của hãng Applied Biosystems (Mỹ). Bộ kit thương mại được đưa ra thị trường đầu tiên được giới thiệu bởi hãng Promega năm 1994. Đây là bước nhảy lớn cho ứng dụng rộng rãi của STR trong công tác giám định pháp y. Bộ kit bao gồm các locus CSF1PO, TPOX và TH01, là các chỉ thị dạng “CTT”. Các chỉ thị triplex thường có chỉ số xác xuất trùng hợp ngẫu nhiên chỉ khoảng 1/500 nhưng lại được sử dụng rộng rãi tại Mỹ do đây là bộ kit thương mại đầu tiên cho phép khuếch đại cùng lúc nhiều chỉ thị với chi phí thấp [11]. Vào năm 1990, Cục điều tra liên bang Mỹ - FBI đã khởi động một sự án thăm dò trên tổng cộng 14 bang và phòng thí nghiệm liên quan tại địa phương. Dự án được biết với tên “The DNA Identification Act” nhằm mục đích xây dựng hệ thống dữ liệu quốc gia cho công tác điều (https://www.fbi.gov/services/laboratory/biometric-analysis/codis). tra án Năm 1997, một bộ gồm 13 chỉ thị STR đã được chọn cho dự án xây dựng cơ sở dữ liệu của hệ thống Combined DNA Index System - CODIS. Các chỉ thị bao gồm các locus CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, và D21S11 (Hình 1.1). Với bộ chỉ thị này, chỉ số trùng hợp ngẫu nhiên đã được nâng lên đến 1/1000000 trên các cá thể không có mối quan hệ huyết thống. Trong 13 locus thì các locus FGA, D18S51 và D21S11 có tính đa hình cao nhất. Một locus được sử dụng phổ biến thì có đặc tính riêng, trên cả số lượng allele, dạng trình tự lặp hay ngay cả các điểm đa dạng phổ biến quan sát được. 1.1.1.4. Lịch sử nghiên cứu và phát triển của phương pháp giám định gen trong khoa học hình sự 9 Thuật ngữ “DNA fingerprinting” được miêu tả lần đầu tiên vào năm 1985 bởi nhà di truyền học người Anh Alec Jeffreys. Tiến sĩ Jeffreys đã tìm thấy các vùng gen nhất định chứa các đoạn trình tự lặp lại tuần tự, nối tiếp nhau khi nghiên cứu các đoạn phát huỳnh quang gắn đa locus. Ông cũng phát hiện ra rằng số đoạn lặp lại của các đoạn trình tự đặc biệt kia có tính cá thể cao, khác nhau giữa các cá thể khác nhau. Bằng cách phát triển một công nghệ giúp kiểm tra sự đa dạng của các đoạn lặp trên, tiến sĩ Jeffeys đã tạo ra phương thức định danh người [12]. Phát hiện đó đã mở ra một kỷ nguyên mới trong khoa học. Công nghệ này không chỉ nâng tầm khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học hệ thống, đa dạng sinh học, y học lâm sàng và cả trong khảo cổ học. Những ứng dụng của công nghệ này đã vượt ra khỏi phạm vi nghiên cứu khoa học thuần túy khi mà lần đầu tiên ứng dụng thành công trong điều tra án và chiến tranh bắt đầu từ năm 1987. Phương pháp xác định dấu vân tay ADN – DNA fingerprinting cổ điển sử dụng phương pháp cắt enzyme giới hạn (RFLP) và Southern blot. Các đoạn vi vệ tinh hoặc các đoạn lặp lại được gắn với probe phóng xạ. Liên kết này sẽ bị phân giải bởi enzyme giới hạn, phân tách thành các đoạn riêng rẽ khi điện di gel agarose và cố định lên màng bằng lai Southern blot. Do chứa các trình tự nhận biết bởi enzyme giới hạn ở các vị trí khác nhau trên genome, các đoạn ADN đích (vi vệ tinh hoặc các đoạn lặp) sẽ bị cắt khỏi genome thành các đoạn có kích thước khác nhau theo số đơn vị đoạn lặp. Các đoạn này sẽ được rửa và hiển thị trên phim X-Quang và được dùng để so sánh giữa các cá thể. Các đoạn vi vệ tinh được gọi là 33,6 và 33,15 được dùng phổ biến ở Anh, phần lớn các nước khối EU và Hoa Kỳ. Mặt khác, đoạn lặp năm – pentameric (CAC)/(GTG)5 lại được dùng phổ biến tại Đức. Những chỉ thị này cũng được gọi là các probe đa locus có thể hiện thị được dải 15 - 20 trình tự có kích thước từ 3,5 đến 20 kb. Hình 1.2 là hình ảnh ví dụ một kết quả một bộ hồ sơ ADN của các cá thể 10 trong một gia đình. Tuy nhiên phương pháp này cho thấy một số hạn chế khi ứng dụng trong điều tra án hoặc các xét nghiệm xác định huyết thống khi mà điều kiện chạy hoặc chất lượng ADN quyết định rất lớn đến tính chính xác của các băng ADN hiển thị được. Cho đến giữa những năm 1990, các phòng thí nghiệm hình sự đã kết hợp với nhau để quy định cách tính các băng ADN dựa trên các ô thang cố định nhằm khắc phục khó khăn trên. Các ô thang này quy định tương đối vị trí các đoạn ADN quan sát được trên một ảnh điện di tiêu chuẩn theo kích thước, từ đó làm tăng khả năng phân biệt của hệ thống. Hạn chế thứ hai đến từ việc khi hồ sơ ADN không rõ danh tính, có nghĩa là không rõ nguồn, thì dẫn đến các sai số thống kê do có thể có khả năng các locus di truyền liên kết với nhau. Thêm nữa, để thu được một bộ hồ sơ ADN hoàn chỉnh thì cần phải dùng một khối lượng phân tử ADN lớn, dẫn đến làm giảm khả năng ứng dụng của phương pháp khi mà trên thực tế vụ án thì các mẫu sinh học lưu lại tại hiện trường thường không lớn hoặc có thể phải xâm hại nhiều vào các bằng chứng. Phương pháp sử dụng các locus đơn đã ra đời ngay trong năm 1987 nhằm khắc phục các hạn chế của phương pháp ban đầu [13]. Phương pháp này có cùng nguyên lý hoạt động nhưng sử dụng một bộ gồm bốn locus đơn, mỗi locus có hai allele. Phương pháp này chỉ cần 10 ng ADN và đã được kiểm định bởi các thí nghiệm mở rộng và thực tế điều tra án (Hình 1.3). Tuy nhiên, nhìn chung các phương pháp sử dụng RFLP vẫn mang nhiều hạn chế về độ nhạy và độ đặc hiệu, cũng như khó có thể so sánh các kết quả từ các phòng thí nghiệm khác nhau. Sau đó, phương pháp dựa trên PCR đã dần thay thế phương pháp cũ bởi tính nhạy, tốc độ, và đặc hiệu của nó. Microsatelites – các vi vệ tinh, được biết tới rộng rãi trong cộng đồng pháp y là các STR, được phát hiện và trở thành chỉ thị lý tưởng cho các ứng dụng trong pháp y. Hồ sơ STR có độ nhạy cao hơn so với các phương pháp RFLP đơn locus cũ, ít bị mất allele – hiện tượng allele dropout như đối với hệ thống sử dụng các tiểu vệ tinh VNTR và có khả năng phân biệt tốt hơn các phương pháp sử dụng HLA-DQA1. Do 11 đó, số lượng các công bố khoa học về các công nghệ này đã lên tới hàng nghìn, thực hiện trên hàng trăm quần thể khác nhau, với nhiều công nghệ mới đã được giới thiệu. Ngày nay, các bộ sinh phẩm được sử dụng đều dùng một panel nhiều các chỉ thị STR đa allele. Các chỉ thị này có cấu trúc tương tự như các vi vệ tinh đã được sử dụng nhưng có kích thước ngắn hơn, dễ dàng khuếch đại hơn bằng PCR. Trong một lần chạy điện di mao quản có thể cùng lúc điện di lên đến 30 chỉ thị STR khác nhau cho một cá thể [14]. 12 Hình 1.2. Kết quả các băng thu được sau phân giải bằng enzyme giới hạn và lai Southern của một đại gia đình 13 Hình 1.3. Kết quả thu được so sánh giữa hai phương pháp sử dụng nhiều locus và các đơn locus dựa trên phương pháp RFLP Hình 1.4 là hình ảnh điển hình cho một kết quả điện di mao quản các locus STR gắn hình quang và được đo đếm bằng số đoạn lặp. Hình 1.4. Hình ảnh kết quả điện di mao quản của một số locus sử dựng phương pháp PCR và gắn huỳnh quang trên mỗi locus