Tài liệu Luận văn thạc sĩ nghiên cứu một số đặc điểm bacteriocin của vi khuẩn lactobacillus plantarum ul487

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------------------- Đồng Thị Hoàng Anh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum UL487 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------------------- Đồng Thị Hoàng Anh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum UL487 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển PGS. TS. Nguyễn Quang Huy HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quỳnh Uyển, cán bộ Viện Vi sinh học và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm, giúp tôi hoàn thành luận văn theo đúng định hướng ban đầu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy, cán bộ tại Bộ môn Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. CN Hoàng Thu Hà, CN Lê Hồng Anh cùng toàn thể cán bộ, sinh viên tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình làm thực nghiệm. Đề tài “ Đánh giá nguồn gen vi khuẩn lactic bản địa định hướng ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm và thức ăn chăn nuôi ” - Bộ khoa học và Công nghệ đã hỗ trợ hóa chất, dụng cụ thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè và các anh chị đồng học luôn ở bên giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian học tập suốt 2 năm vừa qua. Hà Nội, tháng 01 năm 2020 Học viên Đồng Thị Hoàng Anh DANH MỤC VIẾT TẮT LAB : Lactic Acid Bacteria AU : Activity Unit kDa : Kilo Dalton kb : kilo basepair ABC : cassetle liên kết ATP Lan : Lantibiotic PTS : phosphotransferase PEP : phosphoenolpyruvate pln : plantaricin IF : induce factor HPK : Histidine protein kinase RR : Response regular HPLC : High Performance Liquid Chromatography mg : Miligram ml : Millit µL : Microlit SPFF : Sepharose Fast Flow LC/MS : Liquid chromatography– mass spectrometry MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 2 1.1. Vi khuẩn lactic ................................................................................................ 2 1.1.1. Đặc trưng của vi khuẩn lactic.................................................................. 2 1.1.2. Đặc trưng di truyền của vi khuẩn lactic ................................................... 4 1.2. Bacteriocin .................................................................................................... 13 1.2.1. Định nghĩa ............................................................................................ 13 1.2.2. Phân loại............................................................................................... 13 1.2.3. Cơ chế tổng hợp của bacteriocin ............................................................ 16 1.2.4. Các đặc tính của bacteriocin ................................................................. 17 1.2.5. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic ............................................................... 18 1.2.6. Một số phương pháp tinh sạch bacterioicin từ Lactobacillus plantarum 19 1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic .................................. 21 1.3.1. Ứng dụng vi khuẩn lactic ....................................................................... 21 1.3.2. Tình hình nghiên cứu bacteriocin .......................................................... 22 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 26 2.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 26 2.1.1. Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum ............................................... 26 2.1.2. Nguồn vi sinh vật .................................................................................. 26 2.1.3. Môi trường, hóa chất và thiết bị ............................................................. 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 28 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 28 2.2.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin29 2.2.3. Một số tính chất của bacteriocin ............................................................ 29 2.2.4. Tinh sạch bacteriocin............................................................................. 30 2.2.5. Phương pháp nhân dòng gen .................................................................. 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 35 3.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL487 ..................................................................... 35 3.2. Một số tính chất của bacteriocin từ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487 36 3.2.1. Hoạt độ bacteriocin (AU/ml) ................................................................. 36 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin ................................. 38 3.2.3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin ......................................... 38 3.3. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của bacteriocin từ chủng L. plantarum UL48740 3.4. Tinh sạch bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng Lactobacillus plantarum UL48741 3.4.1. Tinh sạch trên hệ thống AKTA .............................................................. 42 3.4.2 . Chương trình tinh sạch trên hệ thống HPLC ......................................... 44 3.5. Nhân dòng và giải trình tự gen ........................................................................ 45 3.5.1. Phát hiện các gen mã hóa cho bacteriocin từ chủng L. plantarum UL48745 3.5.2. Nhân dòng các gen trong chủng L. plantarum UL487............................ 46 3.5.3. Phân tích trình tự các gen và so sánh với các chủng Lactobacillus plantarum khác47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 49 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 49 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 50 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Đặc trưng trình tự bộ gen LAB ................................................................... 5 Bảng 1.2. Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn ............................................................................................... 18 Bảng 1.3. Tinh sạch một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum. ............................................................................ 20 Bảng 2.1. Các chủng vi khuẩn kiểm định ................................................................... 26 Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật gây bệnh.................................................................. 26 Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi .................................................................................. 33 Bảng 3.1. Hoạt độ bacteriocin sinh tổng hợp bởi chủng L. plantarum UL487 ............ 37 Bảng 3.2. Chương trình tinh sạch bacteriocin từ L.plantarum 487 bằng AKTA ......... 42 Bảng 3.3. Tổng kết quá trình tinh sạch bacteriocin của chủng L. plantarum UL487 bằng cột sắc ký trao đổi cation .................................................................... 44 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I ........................................................... 16 Hình 1.2. cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II .......................................................... 17 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm ......................................................................... 28 Hình 3.1 : Hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L. plantarum UL487 với KĐ28 tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau .......................................................... 35 Hình 3.2. Hoạt tính bacteriocin từ chủng L. plantarum UL487 tại 100oC và 121 oC .......... 38 Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocincủachủng Lactobacillus plantarum UL487 ....................................................................................... 39 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của UL487 chống lại một số vi khuẩn gây bệnh ........... 40 Hình 3.5. Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum UL487 qua cột HitrapSPFF 1ml .......................................................................................... 42 Hình 3.6. Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum UL487 qua cột semi C4-dionex ........................................................................................... 44 Hình 3.7. Kết quả PCR kiểm tra các gen plnA, plnEF thuộc vi khuẩn L. plantarum UL487 trên agarose 1.5% ........................................................................... 45 Hình 3.8. Kết quả PCR sàng lọc khuẩn lạc với mồi M13 và mồi đặc hiệu gen plnA, plnEF.......................................................................................................... 46 Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide gen plnA của chủng L. plantarum UL487 ........ 47 Hình 3.10. So sánh trình tự nucleotide gen plnEF của chủng L. plantarum UL487 .... 48 MỞ ĐẦU Hiện nay, ở nước ta, việc lạm dụng các chất phụ gia, hóa chất rẻ tiền độc hại trong quá trình sản xuất, chế biến và bảo quản thực phẩm tác động không nhỏ tới sức khỏe con người. Trong số các giải pháp được đưa ra nhằm kiểm soát vấn đề này, phải kể đến hướng nghiên cứu sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm với mục tiêu đem tới những thực phẩm an toàn và có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng. Không giống như hóa chất phụ gia, hay hóa chất thường được sử dụng trong bảo quản thực phẩm, bacteriocin là các protein kháng khuẩn được sản xuất an toàn, không gây dị ứng và không gây hại cho sức khỏe con người. Những năm gần đây, vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng có khả năng sinh acid và ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn nhờ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Trong đó, vi khuẩn Lactobacillus plantarum được đánh giá là một trong những ứng cử viên tiềm năng trong việc sinh tổng hợp bacteriocin giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes. Hiện nay, trên các tạp chí khoa học trong nước và quốc tế đã có nhiều công bố nghiên cứu chuyên sâu về bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum, bao gồm cả tinh sạch cũng như xác định các bacteriocin mới để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm nhằm mục đích kéo dài thời gian bảo quản, chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh và điều trị một số bệnh và duy trì sức khỏe cho con người. Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu về bacteriocin ở Việt Nam vẫn còn khiêm tốn. Xuất phát từ thực tế cùng xu hướng nghiên cứu hiện nay về việc ứng dụng bacteriocin, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm của bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487” để cung cấp thêm những thông tin về bacteriocin và góp phần làm phong phú hơn những tiềm năng ứng dụng của Lactobacillus plantarum. 1 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Vi khuẩn lactic Con người từ lâu đã biết chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, pho mát, muối dưa, muối cà..), thức ăn ủ chua cho gia súc để tăng thời gian bảo quản cũng như tăng hương vị cho sản phẩm. Cho đến những năm 80 của thế kỷ 18, vi khuẩn lactic mới được giới khoa học phát hiện và tập trung nghiên cứu. Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wihelm Scheele lần đầu tiên tách được lactic acid từ sữa bò lên men chua gọi là “axit sữa”, nhưng mãi đến năm 1857, Louis Pasteur mới chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic. Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis (nay gọi là Streptococcus lactis). Đến nay, các nhà khoa học đã phân lập và nghiên cứu nhiều loại vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn hữu cơ khác nhau trong tự nhiên: trong phân, rác, xác động vật, trong các sản phẩm muối chua, thậm chí trong niêm mạc đường tiêu hóa, âm đạo người và động vật. Ngoài ra, một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên cơ thể thực vật, hút các chất tiết từ mô cây [28,50,54]. 1.1.1. Đặc trưng của vi khuẩn lactic 1.1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria, LAB) là tên gọi chung của những vi khuẩn sinh lactic acid như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa carbohydrate. Do đặc tính chung này, các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceace mặc dù chúng không đồng nhất về mặt hình thái (bao gồm cả các vi khuẩn dạng que ngắn, que dài, lẫn các vi khuẩn hình cầu). Vi khuẩn lactic được đặc trưng bởi khả năng sinh lactic acid từ các loại đường khác nhau, cụ thể là Firmicutes và Firmicutes. Trong ngành Firmicutes, LAB thuộc bộ Lactobacillales và bao gồm các chi sau: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Symbiobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella. Sinh vật thuộc các chi này đều có hàm lượng guanine-cytosine thấp (31- 49%). LAB trong ngành Actinobacteria chỉ bao gồm các loài Bifidobacterium [41]. 2 Vi khuẩn lactic có tế bào dạng hình cầu hoặc hình que, thành tế bào Gram dương, không di động, không sinh nội bào tử. Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số chủng trong họ vi khuẩn lactic có khả năng sinh nội bào tử. Chúng thiếu khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (các thành phần của chuỗi hô hấp) và do đó không thể tạo ra ATP do gradient proton. LAB chỉ có thể thu được ATP bằng cách lên men, thường là lên men đường. Vi khuẩn lactic không khử nitrate (NO3−), có phản ứng catalase âm tính, và kị khí tùy ý trừ một vài loài kị khí bắt buộc sống trong hệ tiêu hóa của con người. Bên cạnh lactic acid, các sản phẩm phụ khác bao gồm acetate, ethanol, CO2, formate và succinate cũng được tìm thấy [24]. Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn đa khuyết dưỡng. Chúng dễ dàng chuyển hóa năng lượng các dạng đường đơn: glucose, fructose, maltose, galactose, mannose nhưng không có khả năng chuyển hóa các loại carbohydrate phức tạp như: tinh bột, hay dextrose. Bên cạnh đó, nguồn nitơ được sử dụng hiệu quả nhất là từ cao nấm men. Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Vitamin cần cho vi khuẩn lactic chia thành 3 nhóm: vitamin thiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không cần thiết. Vi khuẩn lactic cũng cần muối vô cơ như kali, phốt pho, lưu huỳnh, đặc biệt mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân chia và ổn định cấu trúc tế bào. Vi khuẩn lactic đạt tăng trưởng tối ưu ở pH 5,5-5,8 và nhiệt độ là 15oC -50oC. Ở nhiệt độ 80oC, vi khuẩn lactic dễ bị tiêu diệt [58]. Lactobacillus là chi lớn nhất bao gồm khoảng 175 loài phân lập từ các nguồn khác đã được công bố. Phần lớn các loài (gần một phần ba trong số những nguồn được mô tả) đã được phân lập từ đường ruột người và động vật. Rau và các sản phẩm lên men từ rau củ quả (bao gồm dưa chua và kim chi, bột chua, v.v.) là nguồn phân lập Lactobacillus phong phú. Trong ấn bản thứ 2 cuốn Cẩm nang về hệ thống Vi khuẩn của Bergey (Kandler và Weiss 1986), nhiều loài Lactobacillus đã được liệt kê, và danh pháp được tổ chức lại thành ba nhóm: nhóm I (chủng lên men đồng hình bắt buộc), nhóm II (chủng lên men dị hình không bắt buộc), nhóm III (chủng lên men dị hình bắt buộc). Dựa trên trình tự 16S rDNA, các nhóm chính là: (1) nhóm Lb. delbrueckii bao gồm chủ yếu là các loài lên men đồng hình; (2) nhóm Lb. 3 pediococcus, bao gồm các loài lên men đồng hình cũng như lên men dị hình bắt buộc và không bắt buộc; (3) nhóm Leuconostoc bao gồm một số loài lên men dị hình bắt buộc và sau đó được chia thành ba chi: Leuconostoc, Oenococcus và Weissella (Collins et al. 1991). Lactobacillus được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, pho mát, thịt, các chế phẩm probiotic [36]. 1.1.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum được đặt tên lần đầu tiên là Streptobacterium plantarum bởi nhà khoa học Orla-Jennsen vào năm 1919 và được thay tên là L. plantarum (1936) bởi Pederson. Ông là người đã mô tả loài này bằng các đặc trưng sinh hóa và hình thái. Các chủng thuộc nhóm này có hình dạng khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, tế bào có dạng hình que thường kết đôi hoặc hình chuỗi, bắt màu Gram dương, không sinh bào tử, sinh trưởng tốt trong điều kiện vi hiếu khí [37]. Tính đặc trưng duy nhất của Lactbacillus plantarum là khả năng dị hóa arginine, và sinh ra nitric oxide. Lactobacillus plantarum không có khả năng phân giải amino acid, ngoại trừ tyrosine và arginine. Chúng có đến 6 con đường chuyển hóa arginine khác nhau và đều sinh ra nitric oxide. Việc sinh ra nitric oxide giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida abicans, Escherichia coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh trùng. Lactobacillus plantarum ngăn chặn sự bám dính của E. coli tiết ra. Chúng quan trọng trong việc bảo vệ các chất chống vi sinh vật và chống lại một cách hiệu ủa các vi sinh vật gây bệnh nội bào và ngoại bào. Lactobacillus plantarum có khả năng giúp tiêu hóa các chất xơ có trong lúa mì,lúa mạch den và trong men bia. Do đó, chúng cải thiện tốt những vấn đề tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng [45]. Ngoài ra còn có một số loài của chi Lactobacillus khác hư Lactobacillus paracasei, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lactis, đều có ích cho đường tiêu hóa [38]. 1.1.2. Đặc trưng di truyền của vi khuẩn lactic 1.1.2.1. Bộ gen vi khuẩn lactic Bộ gen của Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 được công bố vào năm 2001. Đây là đại diện đầu tiên được giải trình tự của bộ gen LAB. Kể từ đó hơn 75 4 bộ gen quan trọng của LAB trong lĩnh vực công nghiệp đã được giải trình tự, trong khi hơn 80 dự án giải trình tự bộ gen đang được tiến hành [33]. Bộ gen của LAB có hàm lượng GC thấp và phạm vi kích thước từ 1,3 đến 3,3 Mb. Từ các bộ gen hoàn chỉnh được công bố khả năng sinh tổng hợp và trao đổi chất cũng như sự khác biệt tiến hóa của LAB đã được mô tả rõ hơn. Số lượng gen mã hóa protein được dự đoán trong LAB khác nhau từ khoảng 1,700 đến khoảng 2,800 gen. Nhiều LAB chứa một số plasmid, một số trong đó rất cần thiết cho sự tăng trưởng trong các môi trường cụ thể và có các gen sử dụng trong quá trình trao đổi chất, vận chuyển màng và sản xuất bacteriocin. Các gen được mã hóa từ plasmid trong LAB dao động từ 0% đến 4,8% tổng lượng gen [34]. Một số đặc điểm trình tự bộ gen của LAB được trình bày trong Bảng 1.1. Bảng 1.1. Đặc trưng trình tự bộ gen LAB [33]. Kích Loài thước bộ Plasmid gen Lactobacillus acidophilus NCFM Lactobacillus brevis ATCC 367 Lactobacillus casei ATCC 334 Pseudo gene Prophage Protein 1.9Mb 0 0 1864 2.3Mb 2 49 2221 2.9Mb 1 82 2776 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 0 1 2 0 1.9Mb 0 533 1562 11842 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 0 1.9Mb 0 192 1725 1.9Mb 0 48 1763 BAA-365 Lactobacillus gasseri ATCC 33323 5 1 Lactobacillus johnsonii NCC 533 Lactobacillus plantarum WCFS1 Lactobacillus reuteri F275 Lactobacillus sakei subsp. sakei 23k Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118 Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 1.9Mb 0 0 1821 3.3 3 42 3009 2.0Mb 0 39 1900 1.9Mb 0 0 1879 1.8Mb 3 49 1717 2.5Mb 0 82 2434 2.4Mb 5 144 2509 2.3Mb 0 1 2321 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides 2 2 1 2 2 4 3 1 2.0Mb 1 19 2009 1.8Mb 0 122 1701 1.8Mb 0 20 1757 1.8Mb 0 0 1915 1.8Mb 2 206 1710 1.8Mb 0 0 1889 ATCC8293 Oenococcus oeni PSU-1 Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 Streptococcusthermophilus CNRZ1066 Streptococcusthermophilus LMD-9 Streptococcus thermophilus LMG 18311 0 2 1 1 0 Vi khuẩn lactic lên men carbohydrate để lấy năng lượng, sử dụng các nguồn carbon nội sinh làm chất nhận điện tử cuối cùng thay oxy thông qua quá trình 6 đường phân. Các enzyme của quá trình đường phân là tương đồng giữa các thành viên trong nhóm vi khuẩn lactic. Những phân tích gần đây của bộ gen LAB chỉ ra rằng 13-17% tổng số gen mã hóa protein vận chuyển. Trong đó sự phân bố các gen liên quan tới vận chuyển và chuyển hóa các carbohydrate chiếm ưu thế trong bộ gen. Hệ thống phosphotransferase (PTS) phụ thuộc phosphoenolpyruvate (PEP) là cơ chế hấp thụ carbohydrate chiếm ưu thế trong chi Lactobacillus. Bộ gen của những loài trong chi này mã hóa trung bình 20-30 kênh vận chuyển PTS, thêm vào một vài kênh vận chuyển cassette liên kết ATP (ABC) và permease. Đặc trưng này giúp vi khuẩn lactic chuyển hóa carbohydrate khác nhau từ môi trường [31,34]. Trong phần lớn các loài vi khuẩn lactic, amino acid được sử dụng trong một số chức năng sinh lý như kiểm soát pH nội bào hay khả năng chống lại áp lực từ môi trường. Con đường sinh tổng hợp amino acid ở hầu hết các loài LAB chưa hoàn chỉnh ở các mức độ khác nhau, ngoại trừ L. lactis. Lactobacillus bù đắp những thiếu sót này bằng việc mã hóa số lượng lớn peptidase, amino acid permease và nhiều chất vận chuyển oligopeptide có thể hỗ trợ xử lý và thu hồi amino acid hiệu quả từ môi trường giàu dinh dưỡng [32]. Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic cũng sản sinh một số một số hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn như lactic acid, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, bacteriocin. Tại mức pH thấp, tác dụng kháng khuẩn chủ yếu là lactic acid, lúc này lactic acid ức chế khuynh hướng hình thành bào tử của nhiều vi khuẩn. Hydrogen peroxide được tạo ra trong điều kiện thiếu oxygen. Hydrogen peroxide có khả năng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật gây bệnh. Reuterin là hợp chất kháng khuẩn bắt nguồn từ glycerol dưới điều kiện kỵ khí. Reuterin đóng vai trò ngăn cản sự hình thành mycotocxin cũng như chống lại các vi khuẩn gram âm, và gram dương. Bacteriocin là các peptide kháng khuẩn tổng hợp trên ribosome, có khả năng chống lại các vi khuẩn cùng loài (phổ hẹp) hoặc vi khuẩn trên các chi khác (phổ rộng). Tất cả các hợp chất kháng khuẩn có thể chống lại sự phát triển của một số vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm [37]. Trong LAB, các gen mã hóa sản phẩm bacteriocin được sắp xếp thành các cụm operon phân bố trong bộ gen hoặc plasmid. Các operon sinh tổng hợp 7 lantibiotic thường chứa các gen mã hóa cho tiền peptide, các enzyme chịu trách nhiệm cho các phản ứng sửa đổi (LanB, C/LanM), các protease chịu trách nhiệm loại bỏ peptide dẫn (LanP), ABC (cassetle liên kết ATP), tập hợp protein vận chuyển liên quan đến chuyển dịch peptide (LanT), protein điều hòa (LanR, K) và protein liên quan đến khả năng tự bảo vệ của sinh vật sản xuất (miễn dịch) (LanI, FEG). Lantibiotic được đặc trưng bởi sự hình thành amino acid lanthionine và 3methyllanthionine thông qua cải biên hậu dịch mã. Phân lớp thứ nhất của nonlantibiotic bacteriocin (<10 kDa) với đại diện là Pediocin PA-1/AcH, Saracens A và P, Leucocin A, Carnobacteriocin được đặc trưng bởi một trình tự liên ứng đầu N được bảo tồn YGNGVxCxxxxCxV. Phân lớp thứ hai của non-lantibiotic bacteriocin mã hóa trên cùng operon, hoạt động của chúng phụ thuộc vào hoạt động bổ sung của hai peptide. Ví dụ điển hình Lactoccins G và F, Lactation F, Plantaricin EF và JK, Brochocin C. Phân lớp thứ ba được tổng hợp với trình tự dẫn loại sec đầu N, dẫn đến bài tiết và xử lý thông qua con đường sec (acidocin B, carnobacteriocin A, divergicin A, enterocin P, enterocin B) [15]. 1.1.2.2. Đặc trưng di truyền của Lactobacillus plantarum Năm 2003, bộ gen của Lactobacillus plantarum được công bố lần đầu tiên. Bộ gen của Lactobacillus plantarum có kích thước khoảng 3.2 Mbp với hàm lượng GC 44.0 – 45.3%, CDS (coding sequences) ~3,000 và có 1 tới 3 plasmid. Hầu hết các loài L.plantarum chứa khoảng hơn 2000 gen. Các gen này phần lớn mã hóa protein có tính tương đồng với các chủng khác trong LAB, còn lại 300 gen là không cho thấy sự tương đồng trong trình tự so với các chủng LAB [37]. Một số nghiên cứu cũng chỉ ra 121 gen đặc trưng duy nhất cho loài L. plantarum. Những gen này chưa được tìm thấy trong các vi khuẩn lactic khác [52]. Lactobacillus plantarum là những vi khuẩn sử dụng một lượng lớn gen mã hóa cho quá trình vận chuyển đường trong khi quá trình này ở Streptococcus cần một lượng gen ít hơn. Phần lớn các quá trình vận chuyển thông qua hệ thống phosphotransferase (PTS) phụ thuộc phosphoenolpyruvate (PEP). L. plantarum mã hóa khoảng 20-30 enzyme phức hợp PTS loại II hoàn chỉnh. Số lượng PTS được mã hóa trong các chủng này cao hơn so 8 với những vi khuẩn khác và chỉ tương tự với Listeria monocytogenes. Ngoài ra, bộ gen của L. plantarum còn mã hóa cho hệ vận chuyển liên quan đến quá trình vận chuyển nguồn cacbon. Các gen mã hóa enzyme liên quan tới con đường chuyển hóa được phân bố trong các operon. Glucose bị chuyển hóa thành một lượng D- và Llactate bởi các hoạt động của các enzyme dehydrogenase. Nhiễm sắc thể mã hóa hai gen giả định cho lactate dehydrogenase và một số lượng lớn các enzyme phân giải pyruvate khác được dự đoán sẽ xúc tác cho quá trình sản xuất các chất chuyển hóa khác, bao gồm formate, acetate, ethanol, aceton và 2,3-butanediol. Nhiều gen vận chuyển và chuyển hóa đường được tập hợp gần nơi khởi đầu sao chép. Cụ thể, khu vực 213 kb mã hóa hầu hết các protein cho quá trình vận chuyển, chuyển hóa và điều tiết carbonhydrate. Hơn nữa, toàn bộ khu vực này có hàm lượng GC thấp hơn (41.5%) so với phần còn lại của bộ gen. Điều này sẽ phù hợp với giả thuyết rằng khu vực 213-kb của nhiễm sắc thể L. plantarum đại diện cho vùng thích nghi với điều kiện sống [30]. Sự phân bố các gen liên quan đến quá trình vận chuyển amino acid đem tới ưu thế hơn so với các chủng LAB khác. Một đặc trưng quan trọng của L. plantarum là khả năng thích nghi với những áp lực từ môi trường, bao gồm một số protein được sản sinh phản ứng lại áp lực môi trường như protein sốc nhiệt ( hrcA-grpE-dnaK-dnaJ ), protein sốc lạnh (CspL, CspC, CspP), protein sốc alkaline, và các protein liên quan tới áp lực oxi hóa (catalase, thiol peroxidase, glutathione peroxidase, halo peroxidase, bốn thioredoxin, bốn reductase glutathione, năm NADH-oxidase, and hai NADH peroxidase). Ngoài ra, vi khuẩn sản xuất axit lactic phải đối phó với khả năng axit hóa môi trường trong môi trường sống. F0F1ATPase có chức năng như là một cơ chế điều chỉnh chủ yếu của pH nội bào. Bên cạnh đó, L. plantarum còn có các gen chịu trách nhiệm cho hệ thống điều hòa hai thành phần và khả năng dẫn truyền tín hiệu [34]. Plantaricin là peptide kháng khuẩn tự nhiên được sản xuất bởi các chủng Lactobacillus plantarum. Peptide kháng khuẩn này có thể nằm trong nhiễm sắc thể hay plasmid của vi khuẩn. plantaricin 423 được mã hóa bởi gen trên plasmid. Trong khi plantaricin ST31 được xác định bởi gen trong nhiễm sắc thể. Hiện nay có 9 khoảng năm loci đặc trưng khác nhau từ các chủng L. plantarum (C11, NC8, WCFS1, J23, J51), có khoảng 25 gen trải dài khoảng 18-19 kb trên sợi DNA được tìm thấy trong mỗi locus. Các gen này tổ chức thành 5-6 operon. Vùng bảo toàn chứa một operon bacteriocin (pln EFI) và một operon vận chuyển (pln GHSTUVW). Trong khi các vùng ít bảo toàn hơn gồm một operon điều tiết, và hai hoặc ba operon bacteriocin. Hơn nữa, mỗi locus cũng chứa một một hoặc hai operon với những chức năng chưa được biết đến và ít vùng bảo toàn hơn [19]. Bacteriocin từ vi khuẩn L. plantarum có cấu trúc là chuỗi peptit đơn hoặc đôi với khối lượng phân tử nằm trong khoảng 0,4 – 14 kDa và có khả năng ức chế nhiều vi sinh vật gây hại như S. aureus, E. faecalis, P. aeruginosa, L. monocytogenes [39]. Sản phẩm bacteriocin từ chủng Lactobacillus plantarum được điều hòa bởi một mạng lưới dẫn truyền tín hiệu. Trong đó, peptide pheromone được tạo ra từ gen pln A đóng vai trò cảm ứng cho sản xuất bacteriocin. Pln A thuộc về operon điều hòa (pln ABCD). Trong số các sản phẩm bacteriocin được tạo ra từ operon (pln ABCD), plantaricin EF hiện diện trong toàn bộ loci pln trong khi các plantaricin khác được tìm thấy ở các chủng khác nhau như plantaricin JK chỉ hiện diện trong các chủng L. plantarum C11, WCFS1, V90, NC8; plantaricin NC8 chỉ có trong NC8 và J51 [19].  Plantaricin A Các bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn lactic thường là các peptide cation có đặc tính thấm màng và chứa khoảng 25 đến 60 amino acid. Quá trình sản xuất bacteriocin trong một vài vi khuẩn được kiểm soát bằng một hệ thống điều tiết 3 thành phần bao gồm một kinase histidine liên kết màng, một hệ điều tiết phản ứng và một peptide pheromone giống bacteriocin. Plantaricin A (PlnA) là một peptide ngắn có hoạt tính như bacteriocin được tìm thấy từ Lactobacillus plantarum C11. Gen plnA mã hóa tiền peptide chứa 26 amino acid. Ngoài dạng này, hai dạng rút ngắn đầu N (chứa 22 và 23 amino acid) cũng được phân lập từ môi trường nuôi cấy của L. plantarum C11. PlnA 22-, 23-, và 26-mer peptide là ba biến thể đều có nguồn gốc từ tiền protein 48 amino acid được mã hóa bởi gen pln A [18]. So sánh trình tự 10 amino acid với một loạt bacteriocin khác cho thấy trình tự dẫn được loại bỏ từ tiền peptide bằng cách cắt acid amin sau hai glycine được bảo toàn. Nghiên cứu của Dzung B. Diep và các cộng sự chỉ ra rằng hoạt tính của plantaricin A là sự kết hợp của hai peptide được cho là α và β, tương ứng với hai biến thể Pln A 23- và 26-mer. Khối lượng phân tử của α và β là 2426 và 2497 Da. Khối lượng phân tử của α và β khi được xác định bởi khối phổ lần lượt là 2687+/-30 và 2758+/-30 Da. Các nghiên cứu cho thấy rằng chức năng của cả ba biến thể PlnA là một pheromone gây ra sự phiên mã của các gen pln. PlnA gây ra sự phiên mã của các gen được sắp xếp trong năm operon: plnABCD, plnEFI, plnJKLR, plnMNOP và plnGHSTUV [18]. Plantaricin A hoạt động với chức năng kép trong hệ thống plantaricin. Nó làm việc với cả hai chức năng: nhân tố cảm ứng trong điều tiết gen và peptide kháng khuẩn. Plantaricin A được nhận định ban đầu như một bacteriocin. Phổ kháng khuẩn của plantaricin A tương đối hẹp. Plantaricin A cho thấy khả năng đối kháng đặc hiệu với các loài Lactobacillus khác như là L. casei, L. sakei và L. viridescensi. Plantaricin A có hoạt tính thấp hơn (khoảng 10 – 100 lần) so với các plantaricin khác như EF và JK. Hơn nữa, plantaricin A thiếu đi một protein miễn dịch nên về cơ bản là một yếu tố cảm ứng, hoạt tính kháng khuẩn của nó là thứ cấp. Những nghiên cứu này chứng minh rằng plantaricin A sử dụng một α-helix lưỡng tính (mang cả đặc trưng ưa nước và ưa chất béo) từ amino acid 12 đến 21 (phần đầu C) khi nó tiếp xúc với các điện tích âm trên màng. Sự hình thành dạng xoắn này là cần thiết cho cả chức năng pheromone và hoạt tính kháng khuẩn. Trong hoạt động pheromone, α -helix tạo điều kiện cho việc định vị phần đầu N của plantaricin A tham gia vào các tương tác đồng phân lập thể (chiral) với thụ thể (PlnB), trong khi đối với hoạt tính kháng khuẩn, các tương tác non- chiral tham gia và chỉ cần có αhelix vừa có cả tính ưa nước và kỵ nước (amphiphilic) đủ để thấm các tế bào nhạy cảm. Một khía cạnh thú vị khác của plantaricin A là trong các nghiên cứu trên các tế bào tuyến yên chuột, plantaricin A dường như ưu tiên tính thấm với các tế bào ung thư hơn các tế bào bình thường, và nó có thể phân biệt giữa màng tế bào bên trong và bên ngoài của các tế bào này. Plantaricin A được tìm thấy trong các chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum C11, WCFS1, V90 [19]. 11  Plantaricin EF Sau khi phát hiện ra plantaricin A trong Lactobacillus plantarum C11, có đến sáu loại bacteriocin khác được phân tách trên cùng vi khuẩn này. Tất cả các peptide này ban đầu được tạo ra ở dạng tiền peptide chứa glycine kép quen thuộc. Trong số này có plantaricin E và F có tác dụng bổ sung cho nhau khi kết hợp. Plantaricin EF là các peptide kháng khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn nhóm IIb, theo định nghĩa, hoạt động của chúng phụ thuộc vào hoạt động bổ sung của hai peptide khác nhau. Bản chất cation của các peptide là rất cần thiết, vì nó tạo điều kiện cho sự tiếp xúc ban đầu giữa các bacteriocin và điện tích âm trên màng thông qua các tương tác tĩnh điện. Các bacteriocin được dịch mã thành tiền peptide với trình tự dẫn glycine kép được tách ra trong quá trình xuất bào để tạo ra các peptide hoạt động với kích thước lần lượt là 33 amino acid (PlnE), 34 amino acid (PlnF). Một số peptide riêng lẻ có hoạt tính kháng khuẩn kém, tuy nhiên, hiệu quả của chúng tăng khoảng 1000 lần khi kết hợp với các peptide tương đồng của chúng, PlnE với PlnF. Bacteriocin này đều cho thấy phổ ức chế tương đối hẹp, chủ yếu là kháng lại các loài Lactobacillus (ví dụ: L. plantarum, L. casei, L. sakei, L. curvatus) và một số vi khuẩn gram dương khác như Pediococcus pentosaceus và P. acidilactici. Plantaricin EF tiêu diệt vi khuẩn nhạy cảm bằng cách thấm vào màng trong của chúng, gây ra sự chuyển dịch của nhiều loại phân tử màng, cuối cùng dẫn đến việc phá vỡ tế bào như là kết quả của sự sụt giảm điện thế sinh học và gradient pH qua màng. Loại bacteriocin này có cả hoạt động bổ sung và trùng khớp đối với phương thức hoạt động của chúng [19]. Các nghiên cứu về cấu trúc đã tiết lộ rằng các peptide của bacteriocin không có kết cấu trong dung dịch nước. Do tương tác với màng, chúng thực hiện cấu trúc xoắn α và hình thành peptide dạng lỗ với đặc trưng lưỡng tính. Ngoài ra, sự tương tác với một peptide tương đồng giúp tăng cường đáng kể quá trình xử lý cấu trúc, hai peptide bổ sung được tiếp xúc với nhau khi hình thành lỗ rỗng trong màng tế bào đích. Loại bacteriocin này chứa các cấu trúc GxxxG trong trình tự bậc một của 12