Tài liệu Luận văn thạc sĩ nghiên cứu mối liên quan giữa hình thái phôi nang và đột biến nhiễm sắc thể của phôi trong thụ tinh ống nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hoàng Minh Ngân NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI NANG VÀ ĐỘT BIẾN NHIỄM SẮC THỂ CỦA PHÔI TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2020 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hoàng Minh Ngân NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA HÌNH THÁI PHÔI NANG VÀ ĐỘT BIẾN NHIỄM SẮC THỂ CỦA PHÔI TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC Hƣớng dẫn 1: GS.TS. Nguyễn Đình Tảo Hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Trung Nam Hà Nội – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày 28 tháng 6 năm 2020 TÁC GIẢ LUẬN VĂN HOÀNG MINH NGÂN LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã cho phép và tạo điều kiện để tôi học tập, nâng cao tri thức. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông, Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện Đa khoa 16A, đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện thành công luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Đình Tảo, Nguyên phó giám đốc Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội – HVQY, TS. Nguyễn Trung Nam, Viện phó Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người thầy trực tiếp, tận tâm hết lòng hướng dẫn, tạo điều kiện và cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học, các Thầy (Cô) trong Hội đồng chấm luận văn đã đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thiện luận văn này. Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu tôi đã được sự hướng dẫn và giúp đỡ của rất nhiều của thầy cô và bạn bè để hoàn thành đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến: Tất cả thầy cô giáo, giảng viên và cán bộ nhân viên Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp tôi có lượng kiến thức cơ bản nhất định để hoàn thành các môn học cũng như đề tài luận văn này. Tập thể cán bộ, nhân viên Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện Đa khoa 16A đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thu thập số liệu và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt trong cuộc sống, học tập và công tác. Hà Nội, ngày 28 tháng 6 năm 2020 HOÀNG MINH NGÂN DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT a-CGH Array Comparative Genomic Hybridization/ Lai so sánh/đối chiếu bộ gen dùng chíp DNA AMH Anti Mullerian Hormone a-SNP Array Single Nucleotide Polymorphism/ Phân tích đa hình đơn dùng chíp DNA CGH Comparative Genomic Hybridization/ Lai so sánh bộ gen FISH Fluorescent In Situ Hybridization/ Lai huỳnh quang tại chỗ ICM Inner Cell Mass/ Khối tế bào nụ phôi ICSI Intra Cytoplasmic Sperm Injection/ Tiêm tinh trùng vào bào tƣơng của noãn IVF In Vitro Fertilization/ Thụ tinh trong ống nghiệm NGS Next Generation Sequencing/ Giải trình tự gene thế hệ mới NST Nhiễm sắc thể PGT-A Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy/ Xét nghiệm di truyền lệch bội tiền làm tổ TE Trophectoderm Epithelium/ Nguyên bào lá nuôi DANH MỤC CÁC BẢNG 1.1 Đánh giá phôi nang theo tiêu chuẩn của Gardner D. K. 19 2.1 Đánh giá chất lƣợng phôi nang trong nghiên cứu theo tác giả Gardner D. K. (1999) và tác giả Majumdar (2017) 46 3.1 Phân bố tuổi mẹ của nhóm đối tƣợng nghiên cứu 57 3.2 Các NST đột biến thƣờng gặp 61 3.3 Đánh giá hình thái lá nuôi (TE) 65 3.4 Đánh giá hình thái nụ phôi (ICM) 66 3.5 Đánh giá chất lƣợng 953 phôi nang ngày 5 nuôi cấy ngày 5 68 3.6 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang và tuổi mẹ 70 3.7 Mối liên quan giữa độ giãn rộng của khoang phôi với đột biến NST 72 3.8 Mối liên quan giữa hình thái lá nuôi với đột biến NST 74 3.9 Mối liên quan giữa hình thái nụ phôi với đột biến NST 76 3.10 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với đột biến số lƣợng NST 78 3.11 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với đột biến cấu trúc NST 79 3.12 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với đột biến khảm NST 81 3.13 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với đột biến NST 83 3.14 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với số lƣợng đột biến NST tính trên 1 phôi 85 3.15 Mối liên quan giữa nhóm tuổi mẹ với đột biến NST 86 3.16 Nguy cơ có phôi đột biến NST của phụ nữ >35 tuổi 89 DANH MỤC CÁC HÌNH 1.1 Đánh giá phôi nang của Gardner D. K(1999) 20 1.3 Hình ảnh phôi khảm NST số 2s, 5s, 10 28 1.4 Hình ảnh phôi bình thƣờng 46,XY 29 1.5 Các giai đoạn của quá trình giải trình tự và xử lý số liệu 33 2.1 Các môi trƣờng sử dụng trong trong quá trình nuôi cấy và sinh thiết 41 2.2 Tủ nuôi cấy phôi trigas và tủ 2 khí có chƣơng trình khử nhiệt 42 2.3 Tủ trữ mẫu chuyên dụng 42 2.4 Tủ thao tác vô trùng 42 2.5 Lồng thao tác với trứng và phôi 43 2.6 Tủ cấy 3 khí G210 43 2.7 Kính hiển vi đảo ngƣợc vi thao tác gắn hệ thống laser 43 2.8 Máy phân tích kết quả và giải trình tự Miseq Illumine 43 2.9 Chuẩn bị đĩa test (A) và đĩa sinh thiết phôi (B) 47 2.10 Các bƣớc sinh thiết phôi nang ở ngƣời 49 2.11 Đĩa rửa cụm tế bào sau sinh thiết 50 2.12 Ống PCR và cách ghi kí hiệu trên ống 51 2.13 Thao tác trên Bullet khi rửa phôi bào 52 3.1 Hình ảnh của mẫu có bộ NST 47,XY,+21 63 3.2 Hình ảnh của mẫu có bộ NST 46,XX,+13,-16 63 3.3 Hình ảnh của mẫu có bộ NST 45,X 63 3.4 Hình ảnh chất lƣợng phôi nang ngày 5 69 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ 3.1 Kết quả nuôi cấy phôi nang ngày 5 56 3.2 Tỷ lệ xuất hiện đột biến NST của phôi nang ngày 5 59 3.3 Tỷ lệ số lƣợng đột biến NST tính trên 1 phôi 60 3.4 Đánh giá mức độ giãn rộng khoang phôi 64 3.5 Phân bố tuổi mẹ theo đánh giá hình thái phôi 71 3.6 Phân bố tuổi mẹ theo đột biến NST 88 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 7 1.1. ĐỊNH NGHĨA, TÌNH HÌNH VÔ SINH THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .. 7 1.1.1 Định nghĩa vô sinh ........................................................................... 7 1.1.2 Tình hình vô sinh trên thế giới ......................................................... 7 1.1.3 Tình hình vô sinh tại Việt Nam........................................................ 8 1.2. QUÁ TRÌNH THỤ TINH VÀ LÀM TỔ CỦA PHÔI NGƢỜI ............. 8 1.2.1 Sự thụ tinh - giai đoạn hình thành hợp tử ........................................ 8 1.2.2 Sự phân cắt và làm tổ của phôi ........................................................ 9 1.2.3 Quá trình phát triển và đánh giá phôi tới giai đoạn ngày 5 trong thụ tinh ống nghiệm......................................................................................... 9 1.3. HÌNH THÁI PHÔI NANG .................................................................. 11 1.3.1 Những nghiên cứu về phôi nuôi cấy ngày 5 .................................. 11 1.3.2 Những nghiên cứu về mức độ phát triển của khoang phôi nang ... 13 1.3.3 Những nghiên cứu về hình thái nụ phôi ......................................... 14 1.3.4 Những nghiên cứu về hình thái lá nuôi .......................................... 15 1.3.5 Những nghiên cứu về đột biến NST ở giai đoạn phôi nang .......... 16 1.3.6 Đánh giá phôi nang theo tiêu chuẩn của Gardner D. K (1999) ..... 18 1.4. ĐỘT BIẾN NHIỄM SẮC THỂ VÀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ Ở PHÔI ........................................................................ 21 1.4.1 Đột biến NST ở phôi ...................................................................... 21 1.4.1.1 Đột biến NST ............................................................................. 21 1.4.1.2 Đặc điểm một số bệnh di truyền do đột biến số lƣợng NST thƣờng gặp ............................................................................................. 23 1.4.1.3 Các bệnh đột biến cấu trúc NST thƣờng trên phôi .................... 25 2 1.4.1.4 Phôi thể khảm ............................................................................ 27 1.4.2 Phƣơng pháp phân tích NST ở phôi ............................................... 29 1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP SÀNG LỌC DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ .. 29 1.5.1 Phƣơng pháp lai huỳnh quang tại chỗ ............................................ 29 1.5.2 Phƣơng pháp lai so sánh bộ gen ..................................................... 30 1.5.3 Phƣơng pháp lai so sánh bộ gen dùng chíp DNA .......................... 31 1.5.4 Phƣơng pháp phản ứng chuỗi Polymerase ..................................... 31 1.5.5 Phƣơng pháp phân tích đa hình đơn nucleotide dùng chíp DNA .. 31 1.5.6 Sàng lọc tiền làm tổ bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới .... 32 1.6. PHƢƠNG PHÁP SINH THIẾT PHÔI NANG .................................... 34 1.7. GIÁ TRỊ CỦA SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN NST PHÔI TRONG IVF .... 35 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 38 2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU..................................... 38 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn ....................................................................... 38 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ ......................................................................... 38 2.1.3 Thiết kế nghiên cứu ........................................................................ 38 2.1.4 Cỡ mẫu và chọn mẫu ...................................................................... 38 2.1.5 Sơ đồ nghiên cứu............................................................................ 40 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .................................................................. 41 2.2.1 Hóa chất.......................................................................................... 41 2.2.2 Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 42 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 44 2.3.1 Phƣơng pháp đánh giá hình thái phôi theo Gardner D. K (1999) .. 44 3 2.3.2 Phƣơng pháp sinh thiết phôi phôi nang theo tác giả Markus Montag (2014) và Costa - Borges (2017) ............................................................. 46 2.3.3 Phƣơng pháp rửa phôi bào và bảo quản tế bào phôi theo tác giả Costa - Borges (2017) ............................................................................. 49 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích NST của phôi ........................................... 53 2.3.5 Phƣơng pháp phân tích số liệu nghiên cứu .................................... 54 2.3.6 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu .................................................. 54 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 56 3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................ 56 3.1.1 Kết quả nuôi cấy phôi nang ngày 5 ................................................ 56 3.1.2 Phân bố tuổi mẹ của nhóm đối tƣợng nghiên cứu ......................... 57 3.1.3 Tỷ lệ các loại đột biến NST của phôi nang ngày 5 ........................ 59 3.1.4 Tỷ lệ số lƣợng đột biến NST tính trên 1 phôi ................................ 60 3.1.5 Các nhiễm sắc thể đột biến thƣờng gặp ......................................... 61 3.2. ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI PHÔI NANG NGÀY 5 TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM ........................................................................................... 64 3.2.1 Đánh giá mức độ giãn rộng của khoang phôi ................................ 64 3.2.2 Đánh giá hình thái lá nuôi .............................................................. 65 3.2.3 Đánh giá hình thái nụ phôi ............................................................. 66 3.2.4 Đánh giá hình thái phôi ngày 5 trong thụ tinh ống nghiệm ........... 67 3.2.5 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang và tuổi mẹ ....................... 70 3.2.6 Phân bố tuổi mẹ theo đánh giá hình thái phôi ................................ 71 3.3. ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN HÌNH THÁI VỚI ĐỘT BIẾN NST 72 3.3.1 Mối liên quan giữa độ giãn rộng của khoang phôi với đột biến NST ................................................................................................................. 72 4 3.3.2 Mối liên quan giữa hình thái lá nuôi với đột biến NST ................. 73 3.3.3 Mối liên quan giữa hình thái nụ phôi với đột biến NST ................ 76 3.3.4 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với đột biến số lƣợng NST ................................................................................................................. 78 3.3.5 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với đột biến cấu trúc NST ................................................................................................................. 79 3.3.6 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với đột biến khảm NST .. 80 3.3.7 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với đột biến NST ............ 83 3.3.8 Mối liên quan giữa hình thái phôi nang với số lƣợng đột biến NST tính trên một phôi .................................................................................... 84 3.3.9 Mối liên quan giữa đột biến NST với tuổi mẹ ............................... 86 3.3.10 Phân bố tuổi mẹ theo đột biến NST ............................................. 88 3.3.11 Nguy cơ có phôi đột biến NST của phụ nữ >35 tuổi ................... 89 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 91 4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................... 91 4.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 93 PHỤ LỤC ............................................................................................................ DANH SÁCH BỆNH NHÂN ............................................................................. HÌNH ẢNH MỘT SỐ EM BÉ ĐƢỢC SINH RA KHỎE MẠNH NHỜ PHƢƠNG PHÁP PGT-A SỬ DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM TẠI TRUNG TÂM HỖ TRỢ SINH SẢN BỆNH VIỆN ĐA KHOA 16A HÀ ĐÔNG ............................ 5 MỞ ĐẦU Hiện nay, tỷ lệ vô sinh ngày càng tăng lên, các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản hiếm muộn ngày càng nhiều. Theo Bộ y tế Việt Nam có khoảng 7,7% các cặp vợ chồng vô sinh hiếm muộn và 50% số đó trong độ tuổi sinh sản [1]. Cùng với sự phát triển của khoa học, kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF - In vitro fertilization) ra đời và ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong điều trị vô sinh trên toàn thế giới. Trong kỹ thuật này, tinh trùng và trứng đƣợc lấy ra khỏi cơ thể và sau đó đƣợc kết hợp tạo phôi trong phòng thí nghiệm. Phôi đƣợc nuôi từ 2 đến 5 ngày sau đó chuyển vào trong buồng tử cung của ngƣời phụ nữ. Hiện nay IVF là phƣơng pháp điều trị hiệu quả nhất cho các cặp đôi hiếm muộn. Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển phôi và có thai trung bình chƣa cao chỉ từ 30% – 40% [2]. Việc lựa chọn phôi thƣờng chỉ dựa trên những tiêu chuẩn về hình thái của phôi nhƣ: mức độ giãn rộng khoang phôi, đặc điểm hình thái lá nuôi, đặc điểm hình thái nụ phôi… Chúng ta đều biết rằng đánh giá về hình thái không phản ánh đầy đủ chất lƣợng thực của phôi, đã hạn chế đến kết quả điều trị trong thụ tinh ống nghiệm. Nhiều khi phôi có chỉ số hình thái cao lại không làm tổ đƣợc hoặc không tạo ra trẻ khoẻ mạnh, ngƣợc lại, một số phôi có chỉ số hình thái thấp lại có thể tạo ra em bé bình thƣờng. Chuyển phôi có chất lƣợng tốt để nâng cao tỷ lệ có thai trong thụ tinh ống nghiệm vẫn là vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu. Đột biến nhiễm sắc thể (NST) là một trong những nguyên nhân ảnh hƣởng tới tỷ lệ thành công trong thụ tinh ống nghiệm và có thể dẫn tới sảy thai, thai lƣu và dị tật thai nhi. Vì vậy, nên có phƣơng pháp tìm ra phôi bình thƣờng và loại đi phôi đột biến trƣớc khi cấy chuyển phôi. Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đƣợc kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm di truyền tiền làm tổ giúp sàng lọc phôi, đánh giá đột biến cấu trúc và số lƣợng NST của phôi trƣớc khi chuyển phôi. Phƣơng pháp này đã đƣợc ứng dụng trong lâm sàng để cải thiện tỷ lệ thành công trong điều trị vô sinh và áp dụng đối với các bệnh nhân có nguy cơ cao trong đột biến NST, 6 đặc biệt với những cặp vợ chồng có tiên lƣợng xấu nhƣ tuổi mẹ cao, chuyển phôi thất bại nhiều lần và sảy thai liên tiếp. Để cải thiện tỷ lệ thành công của kỹ thuật IVF, giảm tỷ lệ sảy thai, yêu cầu phải sàng lọc đột biến NST trên toàn bộ bộ NST. Kỹ thuật này không xâm lấn trên ngƣời mẹ, nhanh chóng, giảm chi phí cũng nhƣ tránh đƣợc các gánh nặng về tinh thần, có thể áp dụng cho tất cả các bệnh nhân. Gần đây, tổng hợp các kết quả nghiên cứu về xét nghiệm di truyền lệch bội tiền làm tổ ( PGT-A) cho thấy tỷ lệ chuyển phôi, có thai tăng lên đáng kể [3]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến đột biến NST ở phôi nang. Đồng thời có nhiều hƣớng nghiên cứu nhằm kết hợp sử dụng các đặc điểm hình thái của phôi nang và xét nghiệm sàng lọc di truyền của phôi với mục đích lựa chọn phôi tiềm năng nhất sử dụng để chuyển phôi nhằm tăng hiệu quả của chu kỳ IVF [4]. Tuy nhiên chƣa có nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa hình thái phôi đến đột biến NST ở phôi nang, vì vậy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan giữa hình thái phôi nang và đột biến nhiễm sắc thể của phôi trong thụ tinh ống nghiệm” với mục tiêu: 1. Đánh giá hình thái phôi ngày 5 trong thụ tinh ống nghiệm. 2. Bƣớc đầu xác định mối liên quan giữa hình thái phôi với bộ nhiễm sắc thể của phôi. 7 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐỊNH NGHĨA, TÌNH HÌNH VÔ SINH THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1 Định nghĩa vô sinh Theo định nghĩa của Tổ chức y tế thế giới năm 2000, vô sinh đƣợc hiểu là tình trạng một cặp vợ chồng không có thai sau một năm chung sống, giao hợp bình thƣờng, không sử dụng các biện pháp tránh thai nào. Trong trƣờng hợp tuổi của ngƣời vợ trên 35 thì khoảng thời gian này chỉ 6 tháng đã đƣợc đánh giá là vô sinh [5]. Vô sinh nguyên phát, còn đƣợc gọi là vô sinh loại I: là tình trạng vô sinh ở những cặp vợ chồng mà ngƣời vợ chƣa có thai lần nào. Vô sinh thứ phát, còn đƣợc gọi là vô sinh loại II: là tình trạng vô sinh ở những cặp vợ chồng mà ngƣời vợ đã từng có thai trƣớc đó (ít nhất 1 lần). Vô sinh nữ là các trƣờng hợp vô sinh nguyên nhân do ngƣời vợ. Vô sinh nam là các trƣờng hợp vô sinh nguyên nhân do ngƣời chồng. Những trƣờng hợp vô sinh không r căn nguyên là khi không tìm thấy các nguyên nhân gây vô sinh ở cả 2 vợ chồng. Ngoài ra còn có nguyên nhân vô sinh do cả 2 vợ chồng. 1.1.2 Tình hình vô sinh trên thế giới Theo số liệu mới công bố năm 2012, đánh giá khảo sát trên 277 nghiên cứu đƣợc thực hiện rất quy mô để điều tra về tình hình vô sinh của các vùng quốc gia và lãnh thổ trên thế giới, cho thấy kết quả chung về tỉ lệ vô sinh dao động trong phạm vi từ 9,1% đến 13,1% [6]. Năm 2010, tỉ lệ vô sinh nguyên phát ở nữ giới độ tuổi từ 20 đến 44 là khoảng 1,9%. Tỉ lệ này dao động trong phạm vi từ 1,7% đến 2,2% tùy thuộc từng quốc gia lãnh thổ. Tỉ lệ 10,5% cũng là tỉ lệ vô sinh trung bình đối với nhóm vô sinh thứ phát ở độ tuổi này. Trong đó phạm vi dao động đối với tỉ lệ vô sinh thứ phát từ 9,5% đến 11,7%. Đặc biệt, không nhận thấy sự khác biệt về tỉ lệ vô sinh trung bình cả vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ phát khi so sánh số liệu giữa kết quả tổng 8 hợp điều tra của năm 2010 và năm 1990. Nhƣ vậy có thể nói đây là kết quả phản ánh khá trung thực về thực trạng tình hình vô sinh trên thế giới. Khi so sánh tỉ lệ vô sinh theo nhóm tuổi cho thấy, tỉ lệ vô sinh nguyên phát ở nhóm dƣới 25 tuổi, nhóm từ 25 đến 29 tuổi, và nhóm từ 30 đến 44 tuổi lần lƣợt là: 2,7%; 2,0% và 1,6%. Và tỉ lệ vô sinh thứ phát là 2,6% ở nhóm từ 20 - 24 tuổi và 27,1% ở nhóm từ 40 - 44 tuổi [6]. 1.1.3 Tình hình vô sinh tại Việt Nam Mặc dù ngành hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam ra đời sau so với thế giới, nhƣng tính đến nay trên cả nƣớc đã có trên 35 cơ sở hỗ trợ sinh sản thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm. Theo số liệu khảo sát mới đây của tác giả Nguyễn Viết Tiến công bố năm 2011, tỷ lệ vô sinh trung bình trên toàn quốc là khoảng 7,7% [1]. Trong đó tỷ lệ vô sinh nguyên phát là 3,9% và vô sinh thứ phát là 3,8%. Nhƣ vậy, tỉ lệ vô sinh ở Việt Nam theo nhƣ nghiên cứu dịch tễ mới đây là thấp hơn so với tỉ lệ vô sinh chung của thế giới. Tuy nhiên tỉ lệ vô sinh nguyên phát tại Việt Nam lại cao hơn, điều này có thể giải thích là do xu thế và tỉ lệ phụ nữ Việt Nam mong muốn có con sớm hơn so với mặt bằng chung của thế giới, đặc biệt là những nƣớc phát triển. Xét về đặc điểm phân bố của nguyên nhân dẫn đến vô sinh cũng có nhiều nghiên cứu đƣợc các tác giả đƣa ra những kết quả khác nhau. Theo nghiên cứu của Trần Thị Trung Chiến và cộng sự, thì nguyên nhân gây vô sinh nam chiếm khoảng 40,8% trong số các trƣờng hợp vô sinh. Trong nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Bệnh viện Phụ sản Trung ƣơng tiến hành trên 1000 trƣờng hợp vô sinh có đầy đủ các xét nghiệm thăm dò chẩn đoán cho kết quả tỷ lệ vô sinh nữ chiếm khoảng 54%, vô sinh nam chiếm 36%, vô sinh do cả nam và nữ chiếm 10%, còn lại 10% là vô sinh không rõ nguyên nhân [7]. 1.2. QUÁ TRÌNH THỤ TINH VÀ LÀM TỔ CỦA PHÔI NGƢỜI 1.2.1 Sự thụ tinh - giai đoạn hình thành hợp tử Khái niệm: Sự thụ tinh là sự kết hợp giữa tinh trùng với noãn tạo thành hợp tử có bộ NST lƣỡng bội đặc trƣng của loài. 9 Kết quả của quá trình thụ tinh làm phục hồi lại bộ NST đặc trƣng của loài, duy trì sự ổn định về NST của quần thể loài, quyết định giới tính cho cá thể phôi và khởi động quá trình phân cắt, phát triển phôi. Ở ngƣời quá trình này diễn ra ở vị trí 1/3 ngoài của vòi trứng [8], [9]. Xét về khía cạnh sinh học, sự thụ tinh liên quan đến 4 bƣớc tuần tự: - Sự lựa chọn tinh trùng sẽ tham gia quá trình thụ tinh. - Sự xâm nhập của tế bào tinh trùng qua các lớp vỏ của noãn. - Sự gắn kết giữa tế bào tinh trùng và màng bào tƣơng của noãn, đây là quá trình hòa hợp bào tƣơng xảy ra giữa 2 giao tử. - Sự hòa hợp nhân dẫn đến việc hình thành bộ gen của phôi. 1.2.2 Sự phân cắt và làm tổ của phôi Ở ngƣời, vào khoảng giờ thứ 30 sau khi hình thành hợp tử, phôi bƣớc vào phân cắt lần đầu để sinh ra 2 phôi bào, tiếp theo là 4 rồi 8 phôi bào, dần dần hình thành phôi dâu. Phôi lúc này còn đƣợc màng trong suốt bao bọc, các phôi bào nhỏ dần sau mỗi lần phân cắt. Giữa các phôi bào trong phôi dâu bắt đầu xảy ra quá trình tiết dịch và hấp thụ dịch vào trong. Khi trong phôi dâu xuất hiện 1 khoang duy nhất chứa dịch thì phôi dâu biến thành phôi nang. Quá trình phân cắt phôi để hình thành phôi dâu, rồi phôi nang xảy ra ở vòi trứng và tử cung trong vòng từ 5 - 7 ngày sau khi thụ tinh. Khi phôi nang đƣợc tạo thành, khối tế bào bên trong gọi là nụ phôi, sẽ phát triển thành thai sau này. Khối tế bào bên ngoài đƣợc gọi là lá nuôi, sẽ phát triển thành các phần phụ của thai. Cực có mầm phôi đƣợc gọi là cực phôi, cực kia gọi là cực đối phôi. Lá nuôi hợp bào ở phía cực phôi bám vào niêm mạc tử cung ngƣời mẹ, từ đó l m sâu vào bên trong và tự vùi mình vào trong lớp niêm mạc tử cung ngƣời mẹ [8], [9], [10]. 1.2.3 Quá trình phát triển và đánh giá phôi tới giai đoạn ngày 5 trong thụ tinh ống nghiệm Khoảng 16 giờ sau khi thụ tinh, phôi bình thƣờng có 2 tiền nhân. Ở một số bệnh nhân, tiền nhân có thể xuất hiện sớm 12 - 14 giờ sau khi thụ tinh hoặc 10 xuất hiện muộn sau 20 - 22 giờ. Sự phân chia đầu tiên xảy ra khoảng 20 - 24 giờ sau khi thụ tinh. Bình thƣờng cứ mỗi 24 giờ, phôi có số lƣợng tế bào phát triển tăng gấp đôi. Vào ngày thứ 2, phôi phát triển bình thƣờng sẽ có 2 đến 4 tế bào và có khoảng 8 tế bào vào ngày thứ 3. Trong quá trình phát triển phôi trải qua 3 chu kì phân chia. Thời điểm của 3 chu kì phân chia lần lƣợt là 35,6 giờ; 45,7 giờ và 54,3 giờ sau khi thụ tinh. Số lƣợng tế bào phôi không chẵn có thể gặp ở phôi phát triển bình thƣờng do tế bào phôi đang trong giai đoạn phân bào hoặc do sự phân chia của các tế bào phôi không đồng bộ. Cuối ngày thứ 3 sau khi phát triển thành 8 tế bào (rất ít trƣờng hợp phát triển đến 16 - 32 tế bào) phôi sẽ kết dính và bắt đầu xuất hiện những khoang nhỏ trong phôi vào cuối ngày thứ tƣ. Khoảng 120 giờ (ngày thứ 5) sau khi thụ tinh, phôi tiếp tục phân chia, số lƣợng các phôi bào tăng dần và phát triển thành phôi nang. Phôi nang phát triển hoàn toàn vào ngày thứ 5. Số lƣợng tế bào ở thời điểm này vào khoảng 50 đến 150 tế bào và bao gồm 2 loại: - Loại tế bào thứ nhất hình thành đám tế bào nụ phôi (Inner Cell Mass/ ICM) sau này sẽ phát triển thành thai, chiếm khoảng từ 20 - 30% tổng số tế bào. - Loại tế bào thứ hai là tế bào lá nuôi (Trophectoderm Epithelium/ TE) sẽ phát triển thành các phần phụ của thai. Tế bào lá nuôi tạo thành 1 lớp bao quanh đám tế bào nụ phôi (phôi thai sau này) ở giữa và khoang phôi chứa đầy dịch do hai loại tế bào này tiết ra để bảo vệ và nuôi dƣỡng thai. Vào giai đoạn này, màng trong suốt (zona pellucida/ ZP) bị dàn mỏng ra và bao quanh nhƣ một màng mỏng, sau đó màng trong suốt vỡ ra để các phôi bào thoát ra ngoài màng gọi là hiện tƣợng phôi thoát màng chuẩn bị cho sự làm tổ của phôi trong tử cung. Hiện tƣợng phôi thoát màng xuất hiện vào cuối ngày 5 và hoàn chỉnh vào ngày thứ 6 hoặc thứ 7. Hình thái phôi đƣợc đánh giá ngay khi noãn đƣợc thụ tinh cho đến giai đoạn cuối cùng của phôi nang trƣớc khi thoát khỏi màng trong suốt. Cụ thể là phôi ngày 1 đang trong giai đoạn xuất hiện hai tiền nhân, phôi phân cắt vào 11 ngày 2 hoặc 3, ngoại trừ phôi ngày 4 đang trong giai đoạn phôi dâu ít khi đƣợc xem xét vì lúc này phôi thƣờng kết dính, khó xác định ranh giới giữa các phôi bào và tỷ lệ mảnh vỡ bào tƣơng. Phôi nang thƣờng là xuất hiện khoang nên bắt đầu quan sát thấy các phôi bào ở bên trong. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn đánh giá vào thời điểm ngày 5 sau thụ tinh. Mặc dù phôi chuyển đã đƣợc theo d i đánh giá vào ngày 2 hoặc ngày 3 dựa trên hình thái phôi nhƣng vẫn chƣa thể chính xác, phôi chuyển có thể bất thƣờng hoặc dừng phát triển ở giai đoạn sau đó. Do vậy, bệnh nhân có lợi khi phôi nuôi cấy kéo dài đến ngày 5. Phôi trƣớc ngày 3 có một tỷ lệ phôi ngừng phát triển (Embryo block), ở giai đoạn này phôi phát triển chủ yếu dựa vào hoạt động di truyền của noãn, sau giai đoạn này bộ gen của phôi bắt đầu hoạt động. Gardner D. K và cộng sự (1999) xác định đƣợc phôi nang có chất lƣợng tốt khi căn cứ vào hình dạng tế bào lá nuôi và nụ phôi. Tác giả đánh giá nụ phôi thành 3 loại: loại A khi các tế bào nụ phôi nhiều, gắn kết chặt chẽ. Loại B có một vài tế bào, gắn kết lỏng lẻo. Loại C có rất ít tế bào. Cùng với đó là tế bào lá nuôi tạo thành một lớp biểu mô gắn kết chặt chẽ. Phôi nang đƣợc đánh giá dựa vào tiêu chuẩn của Gardner D. K theo thang điểm từ 1 đến 6 phụ thuộc vào độ phát triển rộng của khoang phôi chứa dịch và hiện tƣợng thoát màng [11]. 1.3. HÌNH THÁI PHÔI NANG 1.3.1 Những nghiên cứu về phôi nuôi cấy ngày 5 Mặc dù trƣờng hợp thụ tinh trong ống nghiệm thành công đầu tiên trên thế giới là từ kết quả chuyển phôi giai đoạn phôi nang (phôi nuôi cấy ngày 5), nhƣng phần lớn việc chuyển phôi tại hầu hết các trung tâm thụ tinh ống nghiệm trên thế giới vẫn phổ biến áp dụng chuyển phôi giai đoạn phôi phân cắt. Dễ hiểu là do việc nuôi cấy phôi kéo dài đến giai đoạn phôi nang còn nhiều yếu điểm nhƣ: kéo dài thời gian phơi nhiễm của phôi, thao tác phức tạp, tốn kém và đặc biệt là hiệu quả không cao so với chuyển phôi nuôi cấy ngày 2 hoặc ngày 3.