Tài liệu Luận văn thạc sĩ Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Protease của HIV-1 trên nấm men Pichia Pastoris

  • Số trang: 67 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 95 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Tham gia: 31/07/2015

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đặng Thị Thanh Nhàn NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC MỞ ĐẦU Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Đặng Thị Thanh Nhàn NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên nghành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đinh Nho Thái TS. Nguyễn Thị Hồng Loan Hà Nội, 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đinh Nho Thái, người thầy đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thí nghiệm và viết luận văn. Thầy đã không ngại khó khăn hướng dẫn, giúp đỡ tôi làm quen từ những nguyên tắc và thao tác đầu tiên trong nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ, thành viên trong nhóm nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học và phòng protein tái tổ hợp, phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym và protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN. Tôi xin chân thành cảm ơn về sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Di truyền học cũng như các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức và kỹ năng cần thiết trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại Trường THPT Nguyễn Du, Thanh Oai, HN, đã ủng hộ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian học tập vừa qua. Lời cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, chồng, con, những người thân trong gia đình tôi đã chia sẻ, động viên và hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên: Đặng Thị Thanh Nhàn MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV ........................................................................3 1.1.1. Lịch sử hình thành AIDS ...........................................................................3 1.1.2. Thực trạng nhiễm HIV-1 ............................................................................4 1.1.3. Cấu trúc hình thể và hệ gen của HIV-1 .....................................................5 1.1.4. Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay .....................................................9 1.2. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1 ..............................................................12 1.2.1. Protease HIV-1 ..........................................................................................12 1.2.2. Chức năng của protease HIV – 1. ............................................................13 1.2.3. Sơ lƣợc về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới. ..............13 1.2.4. Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt Nam ....................................16 1.3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P. PASTORIS ...........................................................17 1.3.1. Đặc điểm của P. pastoris .........................................................................18 1.3.2. Ƣu nhƣợc điểm của hệ thống biểu hiện P. pastoris .................................19 1.3.3. Chủng nấm men P. pastoris biểu hiện protease HIV-1 ...........................20 1.3.4. Vector nhân dòng và biểu hiện ở P. pastoris ...........................................21 1.3.5. Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris ..............................22 1.3.6. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris ..........................................22 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................24 2.1. NGUYÊN LIỆU .................................................................................................24 2.1.1. Chủng vi sinh vật .....................................................................................24 2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác ................................................................24 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................25 2.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR .............25 2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose ..................................................................27 2.2.3. Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện: ..................28 2.2.4. Tách chiết và định lƣợng DNA plasmid ..................................................30 2.2.5. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 ..................................31 2.2.6. Biến nạp vector vào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện ..................32 2.2.7. Điện di protein trên gel polyacyamide (SDS-PAGE) .............................33 2.2.8. Thẩm tách miễn dịch (Western Blotting) ................................................34 2.2.9. Phƣơng pháp biểu hiện và thu nhận protein.............................................35 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………37 3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1. ............................37 3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR ...........................37 3.1.2. Tinh sạch plasmid pPIC9 từ E. coli .........................................................39 3.1.3. Cắt sản phẩm PCR và cắt mở vòng plasmid bằng enzym giới hạn .........40 3.1.4. Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 bằng phản ứng ligase ..................................................................................................................41 3.1.5. Kết quả giải trình tự xác định sự có mặt của protease HIV-1 trong vector biểu hiện pPIC9 .........................................................................................................42 3.2. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 TRÊN P. PASTORIS. ................................................................................................................44 3.2.1. Tạo dòng nấm men P. pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 ...................................................................................................44 3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên P. pastoris ........47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................53 1. KẾT LUẬN ...........................................................................................................53 2. KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................54 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cấu trúc của một hạt virus HIV-1......................................................................6 Hình 2. Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1......................................................................7 Hình 3. Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1................... ..............................12 Hình 4. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9.... ...................................................................21 Hình 5. Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus HIS4 giữa bộ gen của tế bào với vector biểu hiện....................................................................................................................22 Hình 6. Kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR.................38 Hình 7. Điện di sản phẩm tách chiết plasmid...........................................................39 Hình 8. Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzym giới hạn NotI và EcoRI..............................................................................................40 Hình 9. Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E. coli DH5α............................42 Hình 10. So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý thuyết..43 Hình 11. Sự hình thành khuẩn lạc trên P. pastoris SMD1168................................45 Hình 12. Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm men............................................................................................................................46 Hình 13. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng P. pastoris SMD1168 sau khi biểu hiện ở môi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời gian…………………………49 Hình 14. Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protease HIV-1 trong chủng tái tổ hợp SMD1168..................................................................................................50 Hình 15. Kết quả kiểm tra protein bằng thẩm tách miễn dịch Western Blot...........51 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp............................................................................................................................20 Bảng 2. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR.................................................26 Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR.........................................................................27 Bảng 4. Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn..................................................28 Bảng 5. Thành phần gel tách và gel cô trong SDS-PAGE ......................................33 Bảng 6. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp thông qua chỉ số OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm 3 lần.............................................48 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immuno Deficiency Syndrome) ART Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus(Antiretroviral drug therapy) AOX Alcohol oxidase Amp Ampicillin BMGY Buffered Minimal Glycerol Yeast Bp Base pair DNA Axit deoxyribonucleic ddNTP dideoxyribonucleotide – triphosphate E. coli Escherichia coli HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immunodeficiency virus) HIS: Histidine KLPT Khối lƣợng phân tử kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani mRNA RNA thông tin (Messenger RNA) MM: Môi trƣờng Minimal Methanol P. pastoris Pichia pastoris PCR Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction) PI Chất ức chế protease (Protease Inlibitor) RNA Axit ribonucleic SDS Sodium dodecyl sunfat SDS-PAGE: phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamid có SDS (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) UNAIDS Chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc ( United Nation Program on HIV/AIDS) MỞ ĐẦU Virus gây suy giảm miễm dịch ở ngƣời (Human Immuno Deficiency VirusHIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời (AIDS). Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều ngƣời chết nhất trong lịch sử loài ngƣời [49]. Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28]. Để tồn tại và phát triển, HIV-1 cần đến 3 enzym quan trọng không thể thiếu trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh đó là: enzym phiên mã ngƣợc reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Nếu một trong ba enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hƣởng, chính vì vậy hƣớng nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh nhân AIDS đã đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Các điều trị theo hƣớng sử dụng chất ức chế 3 enzym đó gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus ART (antiretroviral drug therapy) [28]. Enzym protease của HIV-1 (đƣợc gọi tắt là protease HIV-1) đƣợc mã hoá bởi gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus có thể tiếp tục lây nhiễm. Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 sẽ không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh [19]. Tuy nhiên, do HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót của enzym reverse transcriptase là 1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chƣa điều trị. Ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV đƣợc phát triển và thƣơng mại hóa nhƣng vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức chế nào thực sự có hiệu quả. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS. Quá trình nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lƣợng lớn protease nên việc sản xuất, tinh sạch protease HIV-1 là rất cần thiết. 1 Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 trên toàn thế giới. Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, khó phát hiện. Do đó, cần có những nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn. Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia coli (E. coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41]. Tuy nhiên, E. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn nhƣ mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng cải biến protein sau tổng hợp). Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện ở E. coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến sau dịch mã không diễn ra. Hạn chế này đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men và động vật có vú. Nấm men có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn. Nhiều protein của tế bào nhân thực đã đƣợc sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) [10]. Ngoài S. cerevisiae, nấm men Pichia pastoris (P. pastoris) cũng bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập và tạo dòng. P. pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E. coli hay S. cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27]. Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS, cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P. pastoris so với E. coli, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV-1 trên nấm men P. pastoris” với các nội dung: - Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện. - Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P. pastoris. 2 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV 1.1.1. Nguyên nhân hình thành AIDS Thuật ngữ AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome - Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) đƣợc đề xuất trong cuộc họp tại Washington của các nhà lãnh đạo cộng đồng ngƣời đồng tính, các quan chức và CDC (trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa kỳ) để thay thế cho GRID (suy giảm miễn dịch liên quan đến đồng tính) vào tháng 7 năm 1982 [11]. Đến tháng 8 năm 1982, AIDS đã trở thành tên gọi về hội chứng suy giảm miễn dịch ở ngƣời do tác nhân HIV gây nên [38]. Virus gây suy giảm miễn dịch đƣợc phát hiện lần đầu vào năm 1959 tại Châu Phi, và phân lập đầu tiên do Luc Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris thực hiện năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV). Năm 1986, virus này đƣợc Uỷ ban Quốc tế thống nhất gọi tên là HIV [24]. Cũng vào 1986, L. Montagnier lại phân lập đƣợc một loại virus tƣơng tự ở Tây Phi và đặt tên là HIV type 2 (HIV-2), đây là loại virus gốc của HIV-1. Cả HIV-1 và HIV-2 đều làm suy giảm hệ thống miễn dịch của ngƣời nên đƣợc đặt tên chung là HIV. Chúng giống nhau về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phƣơng pháp điều trị nhƣng ngƣời nhiễm HIV-2 ít phát sinh bệnh hơn so với HIV-1 và HIV-2 chủ yếu thấy ở các vùng Châu Phi [28]. Bởi vậy, bệnh AIDS hiện nay đƣợc hình thành do tác nhân chính là virus HIV-1. Theo phân loại, HIV thuộc họ Retrovirus, chi Lentivirus, có hai loại là HIV1 và HIV-2. Retrovirus là họ gây ung thƣ cho ngƣời và động vật. HIV-1 có 4 nhóm chính là M (main), N (new) và O (outlier) và nhóm P [40]. Trong đó, nhóm M xuất hiện tới 90% tổng số các ca lây nhiễm HIV trên toàn thế giới, nhóm này có 9 phân type (subtypes or clades) đƣợc kí hiệu bằng các chữ cái A; B; C; D; E; F; G; H; J; K và 49 dạng tái tổ hợp khác gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms) [6]. Sự khác nhau giữa phân nhóm này và phân nhóm khác là trình tự axit amin của protein vỏ và có thể vƣợt quá 30%. Vị trí địa lý có thể ảnh hƣởng đến sự 3 lây nhiễm các phân nhóm khác nhau nhƣ phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và Austalia, còn ở các nƣớc đang phát triển nhƣ Châu Á và Châu Phi, nơi mà có nhiều ngƣời bị nhiễm HIV-1 đang sinh sống thì lại phổ biến các phân nhóm không thuộc nhóm B. Cụ thể, theo ghi nhận của Ngân hàng Gen HIV Hoa Kỳ, kiểu gen CRF25_CPX thƣờng chỉ xuất hiện ở Châu Phi [53]. Những nghiên cứu ban đầu về dịch tễ học phân tử của HIV đã xác định đƣợc phân týp chính lƣu hành tại Việt Nam đó là phân týp CRF01_AE (96,7%) và phân týp B (3,3%) [10]. Năm 2013, Phạm Đức Minh và cộng sự đã công bố kết quả phân typ AE và B ở Việt Nam lần lƣợt là 98,53% và 1,33%. [6] 1.1.2. Thực trạng nhiễm HIV-1 Sau gần nửa thế kỷ phát hiện ra HIV đến nay, HIV/AIDS vẫn là đại dịch thế kỷ chƣa có vaccine phòng ngừa hay thuốc chữa trị đặc hiệu. Với tốc độ lây lan nhanh, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt là ở khu vực Châu Phi và các nƣớc Châu Á. Theo ƣớc tính của chƣơng trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc UNAIDS, trung bình mỗi ngày trên thế giới có thêm khoảng 7000 ngƣời nhiễm HIV. UNAIDS đã công bố báo cáo thống kê trong năm 2012 thế giới có khoảng 2,3 triệu các trƣờng hợp nhiễm mới HIV ở ngƣời lớn và trẻ em, giảm 33% so với năm 2001, các trƣờng hợp tử vong liên quan đến AIDS cũng giảm 30% so với mức đỉnh năm 2005 [49]. Đây là kết quả của sự nỗ lực không ngừng trong công tác truyền thông phòng, chống HIV và việc mở rộng tiếp cận điều trị theo hƣớng kháng virus làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sự sống cho ngƣời bệnh. Những con số thống kê này cho thấy hy vọng có thể ngăn chặn và đẩy lùi đại dịch HIV/AIDS trên toàn cầu khi nâng cao hơn nữa tính hiệu quả của các phƣơng pháp điều trị phòng và chống HIV/AIDS. Tuy nhiên, theo công bố của WHO, HIV vẫn tiếp tục là một vấn đề y tế công cộng quan trọng toàn cầu. Đến hết năm 2013 trên toàn thế giới, có khoảng 1,5 triệu ngƣời chết vì các nguyên nhân liên quan đến HIV, 33,2 - 37,2 triệu ngƣời sống chung với HIV với hơn 2,1 triệu ngƣời nhiễm mới. Trong đó, Sahara Châu Phi là khu vực có số ngƣời nhiễm HIV lớn nhất thế giới với trên 24,7 triệu ngƣời sống 4 chung với HIV, số ngƣời nhiễm mới cũng chiếm gần 70% tổng số ngƣời nhiễm trên toàn cầu [56]. Ở Việt Nam, năm 1990 phát hiện bệnh nhân dƣơng tính với HIV đầu tiên. Theo báo cáo của Cục phòng chống AIDS, giữa những năm 2000 đến 2007, số ngƣời nhiễm HIV đã tăng gấp đôi từ 122.000 đến 290.000 ngƣời và mỗi năm có khoảng 40.000 ngƣời nhiễm mới. Tính đến 30/9/2010 trên cả nƣớc có 180.631 ngƣời nhiễm HIV, đến ngày 30/9/2013 cả nƣớc có 218.427 ngƣời nhiễm HIV, trong đó có 66.729 ngƣời ở giai đoạn AIDS, 66.116 trƣờng hợp tử vong do HIV/AIDS, và trung bình mỗi ngày cả nƣớc phát hiện thêm 34 ngƣời nhiễm HIV [49]. Theo báo cáo mới nhất của cục phòng chống HIV/AIDS, tính đến ngày 30/4/2014, toàn quốc hiện có 219.163 trƣờng hợp báo cáo hiện nhiễm HIV (trong đó số bệnh nhân chuyển sang giai đoạn AIDS là 67.557), đến 31/8/2014 có 223.130 ngƣời nhiễm HIV đƣợc phát hiện. Đây chỉ là số ngƣời nhiễm HIV đƣợc phát hiện và xác nhận, số ngƣời nhiễm thực tế có thể lớn hơn [49]. Nhìn chung, đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn tập trung và xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt nhóm tiêm chích ma túy và mại dâm ở các thành phố lớn. 1.1.3. Hình dạng cấu trúc và hệ gen của HIV-1 1.1.3.1. Hình dạng cấu trúc của HIV-1 HIV-1 và HIV-2 có cấu trúc hình thể không khác nhau nhiều mà chỉ khác biệt với nhau về khối lƣợng của các protein và các gen phụ trợ. Chúng đều nhân bản trong tế bào lympho CD4 và cùng gây bệnh ở ngƣời, nhƣng mức độ suy giảm miễn dịch do HIV-1 gây ra nhiều hơn so với HIV-2 [28]. 5 Hình 1. Cấu trúc của một hạt virus HIV-1 [28] Về cấu tạo (Hình 1), HIV-1 có dạng hình cầu, có đƣờng kính 100 nm và đƣợc bao quanh bởi màng lipoprotein. Lớp ngoài cùng của virus là lớp lipit kép với nhiều protein Env gắn vào và nhô lên. Protein Env gồm hai phần là phần chỏm (gp120) và phần thân (gp41). Trong quá trình nảy chồi, các protein khác nhau từ màng của tế bào vật chủ có thể đƣợc gắn vào màng lipoprotein của virus, (chẳng hạn nhƣ protein HLA lớp I và II, hay protein bám dính ICAM) tạo điều kiện cho virus tiếp xúc, gắn vào các tế bào mục tiêu. Bên trong màng lipoprotein là protein P17, tiếp đến là lõi của virus. Lõi có dạng hình trụ đƣợc bao bọc bởi lớp capsid đƣợc tạo thành từ 2000 bản sao của protein p24. Bên trong lõi có hai bản sao của RNA HIV-1, các enzym phiên mã ngƣợc và integrase [28]. 1.1.3.2. Cấu tạo hệ gen của HIV Virus HIV-1 có hệ gen nằm trong phần lõi với hai sợi RNA (+) đơn, trên mỗi sợi có 9 gen mã hoá cho 15 protein khác nhau và có chiều dài khoảng 9,8 kb. Mỗi sợi RNA (Hình 2), có 3 gen cấu trúc là gen gag “group- antigen (kháng nguyên nhóm)”; gen pol “polymerase” và gen env “envelope - vỏ”. Các gen gag và env mã hoá cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hoá cho 3 enzym 6 reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Ngoài 3 gen chính, HIV1 còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [28]. Hình 2. Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1 [28] Bao gồm 9 gen: gag, pol, vif, vpr, vpu, env, tat, rev và gen nef. Gal, pol, env là 3 gen cấu trúc mã hóa các protein cấu tạo vỏ và lõi virus HIV-1 Tat, rev, vif, vpr, vpu và nef là 6 gen phụ 1.1.3.3. Sự xâm nhiễm vào tế bào và nhân lên của HIV-1 HIV truyền nhiễm theo các con đƣờng bao gồm quan hệ tình dục không an toàn với ngƣời nhiễm HIV, truyền máu và các sản phẩm của máu (có thể qua thụ tinh nhân tạo, ghép da và ghép tạng), dùng lại kim tiêm không tiệt trùng của ngƣời nhiễm và từ mẹ sang con [28]. Virus HIV xâm nhiễm vào tế bào vật chủ thông qua các thụ thể. Phân tử CD4 là thụ thể chính của HIV-1, HIV-2 và SIV, đã đƣợc mô tả từ năm 1984 [20]. CD4 có thể thấy trên bề mặt của 60% các tế bào: lympho T; các tế bào tiền thân của lympho T trong tủy xƣơng, tuyến ức; trên các tế bào đơn, đại thực bào, bạch cầu ƣa 7 kiềm, tế bào tua (dendritic cell) và các tế bào thần kinh đệm (microglial cell) [28]. Các tế bào này có vai trò rất quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, chúng nhận diện, báo động và huy động các tế bào lympho tấn công và tiêu diệt vi sinh vật lạ xuất hiện trong cơ thể. Chu trình nhân bản của HIV gồm 6 bƣớc: I) gắn và xâm nhập, II) cởi bỏ lớp vỏ bên ngoài, III) phiên mã ngƣợc, IV) gắn provirus, V) tổng hợp protein virus và lắp ráp, VI) nảy chồi. Toàn bộ con đƣờng sao chép của HIV có thể đƣợc chia thành 3 sự kiện chính: virus gắn vào tế bào, quá trình hoạt hóa và dung hợp. Quá trình lây nhiễm HIV đƣợc bắt đầu khi protein bề mặt vỏ gp120 gắn vào thụ thể CD4 trên bề mặt tế bào đích. Sự liên kết đầu tiên của gp120 với CD4 để lộ ra các vùng đặc hiệu trên vòng V3 của gp120 để gp120 có thể gắn với các đồng thụ thể chemokine (CCR5, CXCR4) trên bề mặt tế bào đích. Tiếp đó phân tử gp41 qua thụ thể gắn vào màng tế bào đích và hòa tan màng, HIV-1 cởi bỏ lớp vỏ lipid bên ngoài và bơm vật liệu di truyền RNA của nó cùng với enzym reverse transcriptase vào tế bào chất của tế bào vật chủ. Nhờ enzym reverse transcriptase mà sợi RNA của virus đƣợc tổng hợp thành sợi DNA bổ sung (cDNA). Tiếp đến là sự kết hợp của RNA virus với sợi cDNA thành chuỗi RNA/DNA - chuỗi lai này chuyển thành 2 sợi DNA xoắn mạch thẳng, sau đó chuyển thành DNA xoắn dạng vòng chui qua màng nhân vào trong nhân tế bào. Nhờ enzym integrase mà sợi DNA virus đƣợc chèn vào DNA nhiễm sắc thể của tế bào chủ. DNA virus đƣợc hợp thành có thể tồn tại ở trạng thái tiềm tàng trong nhiều giờ hoặc nhiều năm trƣớc khi trở thành dạng hoạt động mà không có biểu hiện bệnh [26]. Sau khi lây nhiễm vào vật chủ, hệ gen của virus HIV-1 sẽ đƣợc sao chép nhờ sự điều khiển phức tạp của một số protein nhƣ Tat và các yếu tố sao chép DNA của tế bào vật chủ. Do hệ gen vật chủ bị thay đổi cấu trúc khi DNA của virus chèn vào, DNA của virus chỉ thị cho tế bào phiên mã ra RNA virus nhờ enzym DNA polymerase tế bào vật chủ. Số lƣợng RNA của virus đƣợc tăng lên, tiếp tục tổng hợp các protein virus nhờ ribosome của tế bào vật chủ, chúng cùng di chuyển ra tế bào chất hoặc màng tế bào, sau đó là quá trình nảy chồi tạo thành các viron nằm trên màng hoặc tách ra khỏi tế bào chủ, đi vào máu và tiếp tục gắn vào các tế bào lympho T khác [26; 28]. 8 1.1.4. Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay Lý do khiến cho việc phát triển vaccine phòng chống nhiễm HIV-1 gặp rất nhiều khó khăn và thƣờng thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, lại thƣờng xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên. Sau nhiều nghiên cứu, đến ngày 6 tháng 3 năm 2012, các nhà nghiên cứu sinh học hàng đầu Cuba đã thử nghiệm thành công một loại vaccine mới với tên Teravac chống HIV/AIDS trên chuột, đã sẵn sàng để thử nghiệm trên con ngƣời. Vaccine đƣợc triển khai từ một protein tái tổ hợp có những phân tử giống virus, kích thích đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, theo Iglesias, trƣởng nhóm nghiên cứu vaccine Teravac, vaccine này ban đầu phải đƣợc thử nghiệm lâm sàng với số lƣợng nhỏ, trên một nhóm bệnh nhân AIDS đang ở giai đoạn đầu và cũng không nên hy vọng quá cao vào vaccine này. Tiếp theo là các cuộc thử nghiệm nhằm kiểm tra độ an toàn của vaccine, và việc phát triển một vaccine hiệu quả đòi hỏi nhiều năm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm trƣớc khi đƣa ra loại vaccine có thể thử nghiệm trên ngƣời lành [17]. Vì nhiều nguyên nhân trên mà việc sản xuất vaccine phòng HIV theo phƣơng pháp truyền thống gặp rất nhiều khó khăn. Ngƣời nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có cách duy nhất là dùng thuốc ức chế sự sao chép và nhân lên của HIV-1. Việc điều trị HIV/AIDS phức tạp, tốn kém và chỉ giúp kéo dài sự sống mà không chữa khỏi đƣợc bệnh. Các loại thuốc điều trị HIV/AIDS có thể hƣớng đến các đích khác nhau dựa trên cơ sở hiểu biết về quá trình nhiễm và nhân lên của HIV trong tế bào nhƣ: Ức chế quá trình nảy chồi; ức chế quá trình hoà màng và xâm nhập của HIV-1. Phƣơng pháp phổ biến nhất là liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART) đƣợc áp dụng từ những năm 1987 bao gồm thuốc ức chế enzym reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease [28]. ART là liệu pháp điều trị sử dụng các thuốc kháng virus hay còn gọi là thuốc ARV (Anti-retrovirus). Các thuốc ARV có tác dụng làm chậm sự nhân lên của HIV trong cơ thể, do đó tăng khả năng miễn dịch và ít mắc các nhiễm trùng cơ hội. Các thuốc kháng retrovirus ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở những giai đoạn khác nhau trong vòng đời của virus. Hiện có một số nhóm nhƣ: 9 + Các chất ức chế reverse transcriptase tương tự nucleoside (NRTI): NRTI ức chế sự sao chép của enzym phiên mã ngƣợc reverse transcriptase. Nhóm thuốc này gồm zidovudine, lamivudine, didanosin, zalcitabine, stavudine và abacavir. Đặc tính của thuốc nucleoside cũng gây ra các rối loạn về chuyển hoá đặc biệt là teo mỡ. Có thể chúng liên quan đến ức chế hoạt động của ty thể do hoạt động chức năng của ty thể cần đến nucleoside. Qúa trình chuyển hóa trong ty thể bị rối loạn do phải sử dụng các nucleoside “giả” dẫn đến sự thoái hoá của ty thể [25]. + Các chất ức chế protease (PI): Đây là nhóm thuốc gây cản trở sự nhân lên của HIV bằng cách tác động vào enzym protease của virus, làm cho cấu trúc HIV bị rối loạn và không gây nhiễm. Tuy nhiên, khi điều trị bằng PI, bệnh nhân thƣờng phải uống nhiều lần thuốc trong một ngày và việc điều trị kéo dài gây ra một số tác dụng phụ nhƣ: bệnh dạ dày, ruột, giảm chức năng gan, rối loạn lipid máu, loạn nhịp tim [13]. Những hạn chế này cũng đã đƣợc khắc phục khi PI mới (PI tăng cƣờng) ra đời. Thuốc PI tăng cƣờng đƣợc phân biệt với thuốc PI bằng chữ “r” thêm vào sau tên thuốc. Các thuốc trong nhóm gồm saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir và atazanavir. + Các chất ức chế reverse transcriptase không nucleoside (NNRTI). Những thuốc này phong bế hoàn toàn vị trí gắn các chất hoạt hóa enzym reverse transcriptase bằng cách gắn trực tiếp với enzym này, làm giảm quá trình tổng hợp axit nucleic. Nhóm thuốc này gồm các thuốc nevirapine, delavirdine và efavirenz. Một số nghiên cứu cho rằng nếu đảm bảo đã ức chế đƣợc virus thì có thể dùng NNRTI điều trị thay cho PI. Trong trƣờng hợp này, sử dụng NNRTI đôi khi đem lại hiệu lực tốt hơn việc tiếp tục điều trị bằng các thuốc PI [28]. + Các chất ức chế enzym reverse transcriptase nucleoside (NtRTI): Hoạt động của nhóm thuốc này rất giống với NRTI nhƣng tác dụng nhanh hơn. Tenofovir là thuốc duy nhất trong nhóm này có thể ức chế cả HIV và viêm gan B, đặc biệt lại có có hiệu quả ngay cả ở bệnh nhân đã kháng NRTI. 10 + Các chất ức chế hoà nhập: Nhóm thuốc này không cho virus nhân lên bằng cách ngăn không cho màng virus hoà nhập với màng của tế bào khỏe mạnh. Thuốc đầu tiên trong nhóm này là enfuvirtide. Để tăng hiệu quả và hạn chế tác dụng phụ, các loại thuốc thƣờng đƣợc dùng phối hợp trong điểu trị cho các bệnh nhân HIV/AIDS. Thực tế cho thấy, HIV/AIDS rất khó điều trị triệt để. Thời gian ƣớc lƣợng có thể xoá sạch các tế bào mang HIV-1 là 73,3 năm, nghĩa là HIV-1 không thể chữa khỏi hoàn toàn [44]. Đối mặt với nhiều khó khăn, cùng với sự biến đổi phức tạp của HIV-1, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực không ngừng, nghiên cứu và tìm ra thuốc chống HIV mới, hiệu quả hơn mang lại hy vọng sống cho nhiều bệnh nhận HIV/AIDS. 11 1.2. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1 1.2.1. Protease HIV-1 Protease HIV-1 là enzym có vai trò phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trƣởng thành của virus. Protease HIV-1 đƣợc mã hóa bởi gen pol trong hệ gen của HIV-1 và là một protease aspartyl (chứa aspartyl trong trung tâm hoạt động), họ retropepsin A2, đƣợc tạo ra khi HIV-1 nhiễm vào tế bào vật chủ. Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt nhau đƣợc sắp xếp gần nhƣ theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lƣợng khoảng 11 kDa gồm 99 axit amin. Mỗi tiểu phần tạo thành các phiến gấp nếp β và một đoạn xoắn α ngắn gần đầu C [47]. Trung tâm hoạt động của protease nằm tại mặt phân giới của dimer, chứa bộ ba Asp25-Thr26-Gly27. Trong đó, mỗi monomer đều có một bộ ba Asp-Thr-Gly với vị trí axit amin tƣơng ứng nhƣ sau: 25 (25’) - 26(26’) 27 (27’) và phân tử Asp cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease [36]. Protease HIV-1 có cấu tạo gồm ba vùng chính: vùng dimer hóa, vùng lõi và vùng mũ. Trung tâm hoạt động Hình 3. Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1 [47] Một tiểu phần bao gồm: βa(1-4); βb(9-15); βc(16-27); βd(30-35); βa’(43-49); βb’(52-56); βc’(69-78); βd’(83-85); Đoạn xoắn αh(86-94); chuỗi thẳng q(95-99) ở đầu C Vùng dimer hóa gồm các axit amin: Chuỗi βa(1-4), βq(95-99), và axit amin 24-29; Vùng lõi gồm các axit amin nằm ở 4 phần đầu sợi β : 10-32, 63-85, chứa trung tâm hoạt động Vùng mũ gồm các axit amin từ 33-43 và 63-85 bao quanh trung tâm hoạt động. 12
- Xem thêm -