Tài liệu Luận văn thạc sĩ khoa học tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính của một số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Mai Thị Vân Khánh Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT NHẰM SẢN XUẤT PHÂN VI SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Mai Thị Vân Khánh Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT NHẰM SẢN XUẤT PHÂN VI SINH Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Lớp: BIO17-1 Khóa: K2017B Khoa: Công nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1: TS. Nguyễn Thành Đức Hướng dẫn 2: TS. Lê Thị Nhi Công Hà Nội - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thành Đức và TS. Lê Thị Nhi Công. Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó. Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình./. Hà Nội, tháng năm 2019 Tác giả Mai Thị Vân Khánh ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Di truyền Nông nghiệp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành khóa học này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thành Đức Viện Di truyền Nông nghiệp và TS. Lê Thị Nhi Công - Viện Công nghệ sinh học, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin được cảm ơn GS. TS Đỗ Năng Vịnh và tập thể cán bộ Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào - Viện Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất - trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Luận văn được sử dụng một phần số liệu và kết quả thuộc chương trình Nghị định thư với Cộng hòa Liên bang Đức: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng một số vật liệu mới (Chất hấp thụ, hạt cải tạo và vải địa kỹ thuật) từ phế phụ phẩm mía đường và lúa để nâng cao giá trị gia tăng và phục vị nông nghiệp bền vững”, mã số: NĐT.22.GER/16 do GS.TS. Đỗ Năng Vịnh làm chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cám ơn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng năm 2019 Tác giả Mai Thị Vân Khánh iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Giải thích ký hiệu 1 VSV Vi sinh vật 2 PL Phân lập 3 (N) Phân đạm 4 (P) Phân lân 5 VSVPGL Vi sinh vật phân giải lân 6 XK Xạ khuẩn 7 KHC Ký hiệu chủng 8 KL Khuẩn lạc 9 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam 10 NCBI Ngân hàng dữ liệu trình tự gen 11 DNA Phân tử mang thông tin di truyền 12 PCR Phản ứng chuỗi polymerase 13 Gauze I Môi trường Gauze bổ sung thêm bột CMC 14 AT Môi trường nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn chi Azotobacter iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật phân giải xenlulo phân lập từ các mẫu đất thu thập ............................................................. 24 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV có khả năng cố định nitơ........................................................................................................................ 26 Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân từ các mẫu đất thu thập ................................................................... 27 Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV ( phân lập trên môi trường King B) ..................................................................................................... 28 Bảng 3.5. Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng vi sinh vật .............. 30 Bảng 3.6. Khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn phân lập .......................... 32 Bảng 3.7. Đánh giá hoạt tính phân giải lân của các chủng VSV phân lập ....................... 33 Bảng 3.8. Đánh giá hoạt tính sinh IAA sau 48 h của các chủng vi khuẩn phân lập ... 35 Bảng 3.9. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi sinh vật phân giải xenlulo tuyển chọn 37 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau (glucose, sacharose, tinh bột, CMC) đến sinh trưởng, phát triển của chủng VSV....................................... 37 Bảng 3.11. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hoạt tính sinh học của chủng X-VDT3 38 Bảng 3.12. Đặc điểm sinh học của chủng N-VDT10........................................... 38 Bảng 3.13. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hoạt tính sinh học của chủng N-VDT10 .............................................................................................................................. 39 Bảng 3.14. Điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn ........................ 40 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.1. Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo của các vsv phân lập (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch) ............................................................................. 31 Hình 3.2. Phản ứng màu của các chủng cố định N2 với thuốc thử Nessler ................. 32 Hình 3.3. Vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc của các vsv phân lập (trên môi trường chứa Ca3(PO4)2)................................................................................. 34 Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của các chủng vi sinh vật ...................... 36 Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại của hai chủng X-VDT3 và X-VDT6 ........... 44 vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ................................................................................ v MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH ...... 3 1.1.1. Tình hình nghiên cứu phân bón trong sản xuất nông nghiệp .................. 3 1.1.2. Tình hình sản xuất phân bón trong sản xuất nông nghiệp ........................ 5 1.1.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phân bón hữu cơ vi sinh trên thế giới ....................................................................................................................... 7 1.2. NHÓM VI SINH VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH ................................................................................................................ 10 1.2.1. Vi sinh vật cố định đạm ..................................................................... 10 1.2.2. Vi sinh vật phân giải lân .................................................................... 10 1.2.3. Vi sinh vật phân giải xenlulo ............................................................. 11 1.2.4. Vi sinh vật sinh hocmon sinh trưởng thực vật .................................. 13 1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT ........... 14 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................................... 17 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 17 2.2.1. Phân lập và lưu giữ các chủng vi sinh vật từ mẫu đất ....................... 17 2.2.2. Tuyển chọn và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật có ích................................................................................................................. 17 2.2.3. Định danh chủng vi sinh vật phân giải xenlulo ................................. 17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 17 2.3.1. Phương pháp phân lập và lưu trữ các chủng vi sinh vật ................... 17 vii 2.3.2. Phương pháp xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983). ........................................................................................................... 19 2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính cố định nitơ của vi sinh vật ........... 19 2.3.4. Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt pho .................. 20 2.3.6. Phân loại vi sinh vật .......................................................................... 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 24 3.1. PHÂN LẬP VÀ LƯU GIỮ CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TỪ MẪU ĐẤT 24 3.1.1. Vi sinh vật phân giải xenlulo ............................................................. 24 3.1.2. Vi sinh vật cố định nitơ ..................................................................... 25 3.1.3. Vi sinh vật phân giải lân .................................................................... 27 3.1.4. Vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật ....................................... 28 3.2. ĐÁNH GIÁ CÁC HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ ÍCH .................................................................................................... 29 3.2.1. Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo .............................................. 29 3.2.2. Đánh giá hoạt tính cố định Nitơ ...................................................... 31 3.2.3. Đánh giá khả năng phân giải Phốt pho (lân) khó tiêu.................... 33 3.2.4. Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng vi sinh vật ................ 35 3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH ...................... 36 3.4. ĐỊNH DANH CHỦNG VSV PHÂN GIẢI XENLULO BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GENE RNA RIBOXOM ĐẶC TRƯNG CHO LOÀI .......................................................................................................................... 40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 45 4.1. KẾT LUẬN............................................................................................... 45 4.2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 46 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Với lợi thế là đất nước nông nghiệp, Việt Nam có tiềm năng rất lớn về nguồn phế phụ phẩm trồng trọt từ các cây trồng chính( lúa, ngô, mía, lạc, đậu tương...), riêng mía lượng bã bùn mía sau chế biến đường là rất lớn, mỗi năm diện tích trồng mía khoảng 257.546 ha, sản lượng ép là 15,76 triệu tấn mía cây, trong sản xuất đường sẽ sinh ra một lượng phế thải khổng lồ: 2,5 triệu tấn bã mía, 500.000 tấn bã bùn (sau khi đã lấy nước đường) và 250.000 tấn mật rỉ. Trước đây 80% lượng bã mía này được dùng để đốt lò hơi trong các nhà máy sản xuất đường, sinh ra 50.000 tấn tro và 20% còn lại (khoảng 500.000 tấn) được dùng làm ván ép, còn mật rỉ dùng sản xuất cồn, mỳ chính hoặc các công nghệ vi sinh khác như chế biến thành thức ăn chăn nuôi. Riêng tro, đặc biệt là bã bùn không sử dụng phải đổ bỏ gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, vì trong bã bùn mía có chứa một lượng dinh dưỡng cao như đạm, lân, lưu huỳnh và canxi, nếu được sử dụng làm nguồn phân hữu cơ thì rất tốt cho cây trồng, đặc biệt là cây mía. Đứng trước tình hình đó, đã có nhiều giải pháp được đặt ra như sử dụng nguồn chất thải này làm thức ăn chăn nuôi, nhưng chỉ sử dụng những loại bã mía sạch, chất lượng tốt nên vẫn chưa giải quyết được bã bùn (nguyên nhân chính gây hôi thối khi đổ ra ngoài môi trường). Một giải pháp được coi là khả quan nhất xét cả về mặt kinh tế và môi trường đó là sử dụng bã bùn mía làm phân hữu cơ vi sinh. Vì giải pháp này sẽ trả lại một lượng hữu cơ quan trọng cho đất trồng mía. Theo tính toán để trồng được 250.000 ha mía, ngoài phân bón vô cơ (đạm - lân - kali) tối thiểu phải bón 4 - 5 tấn phân chuồng cho 1 ha, tức là phải có 1 triệu tấn phân chuồng bón cho 250.000 ha. Tuy nhiên, để sử dụng hiệu quả bã bùn mía thì việc xử lý nguyên liệu này bằng các chủng vi sinh vật là rất quan trọng. Trong chất thải nhà máy mía đường thì thành phần của bã thải là bã bùn, váng bọt (chiếm 1 - 4% so với cây mía), chất xơ, đường, protein, lipit,… đây là thành phần rất tốt cho phân hữu cơ vi sinh, việc nghiên cứu, tuyển chọn vi sinh vật phân giải bã bùn mía là rất cần thiết. Do vậy, đề tài “Tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính sinh học của một số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh" được đề xuất thực hiện nhằm giải quyết được một phần vấn đề có tính cấp thiết, mang tính khoa học và thực tiễn cao. Kết quả thu được của đề tài sẽ cung cấp một số nhóm 2 chủng vi sinh vật có ích với hoạt tính mạnh cho quá trình sản xuất phân bón vi sinh, phân bón hữu cơ vi sinh hay chế phẩm vi sinh, các chủng lưu giữ với danh tính rõ ràng, thuận tiện trong quá trình lưu giữ và sử dụng sau này. 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của 2 - 3 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo, cố định đạm, phân giải lân khó tiêu, sinh hocmon sinh trưởng thực vật. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật được phân lập mới từ các mẫu đất thu thập tại các ruộng lúa, ruộng mía ở các tỉnh Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hóa. - Phạm vi nghiên cứu: tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính mạnh trong phân hủy xenlulo, phân giải lân khó tiêu, cố định đạm và sinh hocmon sinh trưởng thực vật nhằm ứng dụng các chủng vi sinh này trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh. Đồng thời ứng dụng sinh học phân tử trong định danh các chủng vi sinh vật phân lập được. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu - Đề tài góp phần tuyển chọn, định danh một số chủng vi sinh vật có có hoạt tính cao phục vụ sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh. - Đề tài góp phần định danh chính xác tên loài một số chủng vi sinh vật phục vụ sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH 1.1.1. Tình hình nghiên cứu phân bón trong sản xuất nông nghiệp Hiện nay, các nước đang phát triển có xu hướng sử dụng ngày càng tăng lượng phân bón hóa học và Việt Nam cũng nằm trong xu thế này. Tuy nhiên, việc dùng quá nhiều phân đạm (N) tới mức lạm dụng đã làm tăng dần sự mất cân đối các dưỡng chất trong đất ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng nông sản. Đồng thời dùng lượng N quá cao sẽ gây khó khăn trong việc bảo quản nông sản cũng như tích lũy NO3- trong rau và các loại cây thực phẩm sẽ là nguy cơ đe dọa sức khỏe con người và vật nuôi. Ngoài ra, theo các nhà khoa học thì khí N2O gây hiệu ứng nhà kính lớn hơn khí CO2 gấp 300 lần. Trong sản xuất nông nghiệp, một lượng đáng kể N bị thất thoát vào không khí khi bón đạm Ure hoặc Sulphate Amon (SA), gây lãng phí và gia tăng hiệu ứng nhà kính. Muốn khai thác có hiệu quả tiềm năng dinh dưỡng của đất trồng nông nghiệp nhằm hạn chế dần việc bón bổ sung những loại phân hóa học hay các loại khoáng vô cơ khác, hạn chế tối đa những ảnh hưởng không tốt đến biến đổi khí hậu mà do chính quá trình sản xuất nông nghiệp gây ra; các nhà khoa học trong lĩnh vực trồng trọt đã nghiên cứu và cho ra đời một số công nghệ vi sinh và công nghệ enzyme. Mặt khác, một số chủng vi sinh còn có vai trò đối kháng với các loài vi sinh có hại (gây bệnh cho cây), ức chế hoặc tiêu diệt những loại vi sinh vật này giúp cây phát triển tốt hơn. Có thể ví dụ một số loại vi sinh có lợi đã được đưa vào công nghệ sản xuất phân bón như: Vi sinh vật cố định đạm (Rhizobium, Bradyrhizobium), vi sinh vật cố định nitơ tự do (A. chroococcum, P. tinctorius), vi sinh vật phân giải lân (Pseudomonas sp, Achromobacter sp, A. polymixa), vi sinh vật kích thích sinh trưởng (E. cloaceae, A. radiobacter, A. bejerinckii, E. Aerogenes), vi sinh vật đối kháng vi khuẩn, nấm bệnh (B. subtilis, Pseudomonas sp, Bacillus sp). Ngoài ra còn có một số chủng vi sinh vật có lợi khác như: Bacillus 4 licheniformis, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiace. Các vi sinh vật trong đất, đặc biệt là vi sinh vật vùng rễ có vai trò đặc biệt quan trọng với cây trồng, chúng tạo thành mối quan hệ hữu cơ, gắn bó trong một thể thống nhất. Quá trình mặn hóa, phèn hóa hiện đang làm giảm rõ rệt số lượng vi sinh vật trong đất, đặc biệt là các nhóm vi sinh vật có ích như cố định nitơ, phân giải hữu cơ, phân giải lân, sinh các chất kích thích sinh trưởng thực vật,…và gián tiếp gây giảm năng suất cây trồng, nhất là cây lúa. Như vậy cần phải bổ sung lại những nhóm vi sinh vật có ích này thông qua các loại phân bón vi sinh vật chức năng. Trong những năm vừa qua, mặc dù đã có một số nghiên cứu liên quan đến phân bón hữu cơ đựơc thực hiện bởi các đơn vị nghiên cứu trong và ngoài nước nhưng vẫn cón rất ít về số lượng. Ngoài các nghiên cứu về hiệu lực, hiệu quả của phân bón hữu cơ, các đề tài, dự án nghiên cứu còn tập trung vào tìm kiếm, tuyển chọn các sản phẩm phân hữu cơ, đặc biệt là phân hữu cơ vi sinh để phục vụ sản xuất nông nghiệp. Một số đề tài có giá trị phải kể đến như: “Nghiên cứu, sản xuất phân hữu cơ vi sinh đa chức năng đặc chủng cho cây cao su vùng Tây Bắc từ than bùn và phế phụ phẩm nông nghiệp” của Viện Thổ nhưỡng Nông hóa; “Đánh giá ảnh hưởng của một số loại phân hữu cơ đến năng suất và hàm lượng nitrat trong rau trên đất xám” của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam; “ Nghiên cứu phân vùng địa lý sinh thái hiệu lực phân bón Việt Nam” do Giáo sư Võ Tòng Xuân chủ trì. Có thể thấy công tác nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực phân bón nói chung và phân bón hữu cơ nói riêng chưa được quan tâm đầu tư đúng mức. Nhìn lại danh mục các nghiên cứu về phân bón thì phần lớn là quá cũ hoặc chỉ thông qua các dự án hợp tác quốc tế. Trong mười năm 2006-2016 chỉ có 03 đề tài nghiên cứu cấp Bộ có liên quan đến phân bón, trong đó có 2 đề tài về xử lý phế phụ phẩm và 01 đề tài vi sinh vật. Đối với đề tài cấp nhà nước, trong thời gian 10 năm kể trên chỉ có 02 đề tài nghiên cứu cấp nhà nước về lĩnh vực này. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu chưa đi liền với thực tế phát triển ngành phân bón, chưa phục vụ hiệu quả cho công tác quản lý nhà nước. Hiện tại vẫn còn thiếu rất nhiều nghiên cứu mang tính bài bản, hệ thống về mối liên hệ giữa tính chất đất và nhu cầu phân bón đặc thù cho từng loại đất, vùng đất; về nhu cầu phân bón phù hợp, đặc thù với các loại đất khác nhau, trên 5 các loại cây trồng khác nhau và ở các giai đoạn sinh trưởng phát triển phân bón mới thì việc đánh giá tác động môi trường và tác động đến sức khỏe của con người thông qua chất lượng nông sản còn chưa được quan tâm đúng mức. Chưa có nghiên cứu bài bản, hệ thống nào về hiệu suất sử dụng phân bón, thất thoát dinh dưỡng và các biện pháp khắc phục. Việc chuyển giao các tiến bộ kỹ thuật mới thông qua hệ thống khuyến nông để khuyến khích, hướng dẫn người dân sử dụng phân bón hữu cơ còn hạn chế. Tính đến thời điểm hiện tại, rất ít dự án khuyến nông về phân bón hữu cơ được triển khai. 1.1.2. Tình hình sản xuất phân bón trong sản xuất nông nghiệp Ở Việt Nam phân bón hữu cơ hiện nay được sản xuất trong nước theo hai phương thức là ủ truyền thống và sản xuất công nghiệp. Phương thức ủ truyền thống được sử dụng chủ yếu ở quy mô nông hộ dựa trên nguồn nguyên liệu là chất thải hay các phế phụ phẩm cây trồng thu gom từ chăn nuôi và trồng trọt tại nông hộ. Các phế phụ phẩm hữu cơ được trộn đều, đồng thời có thể bổ sung thêm các nguyên tố khoáng và chế phẩm vi sinh vật sau đó ủ thành đống với mục đích di trì nhiệt độ hình thành trong đống ủ để thúc đẩy quá trình phân hủy chất hữu cơ, đẩy nhanh quá trình khoáng hóa và tiêu diệt các sinh vật gây bệnh cho người, vật nuôi, cây trồng. Phương thức sản xuất công nghiệp áp dụng tại các cơ sở sản xuất phân bón được đầu tư cơ sở hạ tầng, dây chuyền máy thiết bị với quy mô công suất lớn nhỏ khác nhau (từ 20.000 đến 500.000 tấn). Hiện nay, cả nước có 180 doanh nghiệp đã được cấp Giấy phép sản xuất phân bón hữu cơ, chiếm 24,5% so với tổng số Giấy phép sản xuất mà Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn và Bộ Công thương đã cấp (735 Giấy phép). Tổng công suất của các cơ sở sản xuất phân bón hữu cơ là 2,5 triệu tấn/năm, chiếm 8,5% so với tổng công suất các cơ sở sản xuất phân bón trong nước (29,5 triệu tấn/năm) và bằng gần 1/10 so với công suất sản xuất phân bón vô cơ (26,7 triệu tấn/năm). Giai đoạn 2015-2017, Việt Nam xuất khẩu phân bón hữu cơ đến 34 quốc gia khác nhau với khối lượng tăng mạnh trong hai năm 2016 và 2017. Cụ thể, khối lượng xuất khẩu năm 2017 xấp xỉ 76.000 tấn, tăng hơn 6 lần so với năm 2015 (12.000 tấn). Về doanh nghiệp xuất khẩu: Năm 2015 mới chỉ có 2 doanh nghiệp xuất khẩu phân bón hữu cơ, năm 2016 là 12 doanh 6 nghiệp, đến năm 2017 đã có 19 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu phân bón hữu cơ, chủ yếu là Công ty Cổ phần hữu hạn VEDAN Việt Nam (gần 68.000 tấn), Công ty TNHH MTV Quế Lâm Phương Bắc (xấp xỉ 3.900 tấn), Công ty cổ phần Sê Công (trên 2.000 tấn) còn lại là các doanh nghiệp khác xuất khẩu từ 7-504 tấn. Về chủng loại: Năm 2015 có 17 sản phẩm phân bón hữu cơ được xuất khẩu, năm 2016 tăng lên 56 sản phẩm và năm 2017 đã có tổng cộng 75 sản phẩm phân bón hữu cơ được xuất khẩu ra nước ngoài. Trong số đó, chủ yếu là phân bón hữu cơ (42 sản phẩm với khối lượng xấp xỉ 60.000 tấn), phân bón hữu cơ khoáng (20 sản phẩm với khối lượng trên 9.500 tấn), phân bón hữu cơ vi sinh (11 sản phẩm với khối lượng xấp xỉ 6.500 tấn) và một lượng ít phân bón khoáng hữu cơ. Khối lượng phân bón hữu cơ nhập khẩu trong 3 năm gần đây đều đã tăng đáng kể. Cụ thể, khối lượng nhập khẩu năm 2017 là khoảng 220.000 tấn, tăng gấp đôi so với năm 2016 (xấp xỉ 102.000 tấn). Trong số đó, phải kể đến phân bón vi sinh vật, khối lượng nhập hẩu năm 2017 (617 tấn) tăng gần 5 lần so với năm 2015 (126 tấn) và tăng gần 2 lần so với 2016 (319 tấn). Khối lượng nhập khẩu phân bón hữu cơ sinh học năm 2017 (xấp xỉ 117.000 tấn) tăng gần 8 lần so với năm 2016 (xấp xỉ 15.000 tấn). Đặc biệt, năm 2017 Việt Nam đã bắt đầu nhập khẩu phân bón hữu cơ cải tạo đất với khối lượng 105 tấn (Báo cáo: Thực trạng và giáp pháp phát triển phân bón hữu cơ, 2018). Thời gian qua, các nhà khoa học trong cả nước đã nghiên cứu và sản xuất thành công rất nhiều loại phân hữu cơ vi sinh nhằm cải tạo đất và chăm sóc cây trồng. Kết quả thử nghiệm tại các vùng sản xuất cho thấy, các sản phẩm phân bón hữu cơ vi sinh này có tác dụng tích cực đến việc nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, đồng thời có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất và bảo vệ môi trường sinh thái. Một số loại phân hữu cơ vi sinh điển hình như: HUĐAVIL; HN 2000; Omix; Vi sinh tổng hợp Biomic –C; Phân hữu cơ vi sinh vật chức năng, VTN1; VTN2 và VTN3...v...v.... Phân bón hữu cơ vi sinh đã được nghiên cứu từ lâu, song do yếu tố chủ quan và khách quan khác nhau nên mức độ ứng dụng cho đến nay vẫn còn nhiều hạn chế. Đặc biệt, các loại phân chuyên dụng cho từng loại cây còn rất ít, hơn nữa các loại phân vi sinh này mới chỉ được sản xuất từ một số loại vi sinh vật và nguyên liệu nhất định (cố định nitơ cộng sinh- Nitragin, 7 Rhizoda... cố định nitơ hội sinh, tự do- Azogin, Rhizolu...phân giải lân...), hiệu quả sử dụng của các loại phân bón này ở các địa phương khác nhau là không giống nhau. Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự phong phú, đa dạng của hệ vi sinh vật đất và tác động qua lại nhiều chiều của các vi sinh vật với nhau, của vi sinh vật với cây trồng và điều kiện môi trường. Ở Việt Nam, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam là cơ quan đầu mối về quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp, hiện đang lưu giữ và bảo quản trên 600 chủng vi sinh vật các loại phục vụ cho sản xuất phân bón vi sinh, các chế phẩm bảo vệ thực vật và xử lý môi trường. Hiện nay, ở nước ta có nhiều cơ sở sản xuất nhiều loại phân hỗn hợp từ than bùn. Trên thị trường có các loại phân hỗn hợp với các tên thương phẩm sau đây: Biomix (Củ Chi), Biomix (Kiên Giang), Biomix (Plâyku), Biofer (Bình Dương), Komix (Thiên Sinh), Komix RS (La Ngà), Compomix (Bình Điền II), phân hữu cơ sinh học và hữu cơ vi sinh Quế Lâm, phân lân hữu cơ sinh học sông Gianh và nhiều loại phân lân hữu cơ sinh học ở nhiều tỉnh phía Bắc. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phân bón hữu cơ vi sinh trên thế giới Tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc tình hình sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp ủ thành phân bón hữu cơ trong sản xuất nông nghiệp tăng dần. Khoảng 77% nông dân sử dụng 60% sản phẩm phụ của cây trồng vụ trước cho các cây trồng vụ sau, 18% hộ nông dân sử dụng 90% sản phẩm phụ cho cây trồng vụ sau. Trong rơm rạ chứa khoảng 0,6% N, 0,1% P, 0,1% S, 1,5% K, 5% Si và 40% C. Rơm rạ là nguồn sẵn có với số lượng dao động từ 2-10 tấn/ha nên đó là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho cây. Gần như tất cả K và 1/3 N, P, S nằm trong rơm rạ. Do vậy, rơm rạ chính là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng rất tốt cho cây (Bell và Edwards, 1989)[1]. Viện Lân và Kali của Canada (1995) xác nhận 80% tổng số kali cây lấy đi nằm trong xác, bã cây. Nếu các xác bã thực vật này được hoàn lại cho đất đã canh tác thì chúng sẽ cung cấp một lượng kali đáng kể cho các cây trồng vụ sau. Các vùng trồng mía lớn trên thế giới (Ấn Độ, Trung Quốc, Cuba,...) cũng có cách thức trả lại ngọn lá mía cho đất để làm dinh dưỡng cho vụ sau thông qua kỹ thuật ủ tạo phân hữu cơ. Van Dillewijn (1952) phân tích thấy bộ phận ngọn và lá mía chiếm 62% N, 50% P2O5 và 55% K2O trong tổng số 8 của bộ phận thu hoạch. Như vậy có nghĩa 4 nếu trả lại ngọn lá mía bón lại cho vụ sau thì cung cấp một lượng dinh dưỡng tương đối lớn cho cây (Van Dillewijn, 1952)[1]. Các nghiên cứu, áp dụng công nghệ EM đạt được kết quả một cách rộng rãi trong lĩnh vực xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, chế biến phân bón vi sinh cho cây trồng.... Qua các báo cáo khoa học tại các Hội nghị Quốc tế về công nghệ EM cho thấy công nghệ EM có thể gia tăng cân bằng sinh quyển, tính đa dạng của đất nông nghiệp, tăng chất lượng đất, khả năng sinh trưởng, chất lượng sản phẩm nông nghiệp. Vì thế, các nước trên thế giới đón nhận EM là một giải pháp để đảm bảo cho một nền nông nghiệp phát triển bền vững và bảo vệ môi trường. Nhiều nhà máy, xưởng sản xuất EM đã được xây dựng ở nhiều nước trên thế giới và đã sản xuất được hàng ngàn tấn EM mỗi năm như: Trung Quốc, Thái Lan (hơn 1000 tấn/năm), Myanmar, Nhật Bản, Brazil (khoảng 1.200 tấn/năm), Srilanca, Nepal, Indonesia (khoảng 50 - 60 tấn/năm) (Erangelista và Urriza, 1999)[3]. Trong nền nông nghiệp cổ truyền của các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam và các nước Asian, phân hữu cơ không chỉ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng với hàm lượng vốn có của nó mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện các đặc tính lý hoá học của đất thông qua vai trò của vật chất hữu cơ. Do đó hiện nay phân hoá học được coi là yếu tố quan trọng để đẩy năng suất cây trồng nên xu hướng sử dụng phân hoá học vẫn ngày càng tăng. Nhưng phân hữu cơ nói chung và phân hữu cơ vi sinh nói riêng vẫn đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp bền vững và bảo vệ môi trường ở các nước nhiệt đới cũng như là ở các nước phát triển. Hiện nay do nhu cầu của thị trường mà ngành chăn nuôi ở nước ta đã có những thay đổi, nguồn phân hữu cơ sử dụng trong nông nghiệp đang có chiều hướng giảm dần do lượng chất độn chuồng giảm. Trong khi đó nguồn phế phụ phẩm từ nông nghiệp như rơm rạ, thân lá ngô, sắn, tế guột...thường bị đốt ngay tại chỗ sau khi thu hoạch, gây ảnh hưởng tới môi trường và làm thất thoát một lượng đáng kể các chất dinh dưỡng từ phụ phẩm nông nghiệp. Tác giả Tabagari và các cộng tác viên (1987) dẫn theo Đinh Thị Ngọ (Đinh Thị Ngọ, 1996)[4], nghiên cứu dùng than bùn để tủ gốc cho chè trên đất Podzolic cho thấy: cây chè được tủ bằng than bùn có sinh khối phần trên mặt đất cao nhất, sau đó đến tủ gốc bằng màng mỏng 5 PE màu đen, công thức đối chứng không tủ cho sinh khối thấp nhất. Trọng lượng bộ rễ đặc biệt là rễ hút tăng 63% ở công thức tủ bằng than bùn, tăng 27% ở công thức tủ bằng màng mỏng PE 9 màu đen (so với đối chứng), lượng rễ hút phân bố nhiều ở tầng đất 0 – 10cm (công thức tủ bằng than bùn chiếm 46%, công thức tủ bằng màng mỏng PE màu đen chiếm tới 64%, công thức không tủ chỉ có 7%). Nghiên cứu dài hạn về ảnh hưởng của việc sử dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp (đã xử lý thành phân bón hữu cơ) trên đất phiến thạch sét tại Brazil sau 17 năm đã chỉ ra rằng, trong công thức luân canh với sử dụng tối đa nguồn hữu cơ từ thân lá ngô và cây họ đậu đã làm tăng hàm lượng các bon trong tầng đất mặt (0-17,5 cm) 24% và đạm tổng số tăng 15% và hàm lượng kali dễ tiêu cũng tăng 5% so với đối chứng với công thức đối chứng độc canh hai vụ ngô (Diekow, 2005)[5]. Ảnh hưởng của vùi phụ phẩm nông nghiệp (chưa qua xử lý cũng như đã xử lý thành phân bón hữu cơ) đến năng suất cây trồng ở vùng bán khô hạn của Ấn Độ chỉ ra rằng sinh khối tăng 25,3 % và năng suất hạt tăng 9,2 % so với công thức đối chứng. Ngoài ra sử dụng phế phụ phẩm còn có thể tiết kiệm được 50% lượng phân hoá học, giảm chi phí cho người dân trong sản suất (Heman và Singh, 1992)[6]. Nhật Bản cũng khuyên nông dân trồng chè của mình nên tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp làm phân bón hữu cơ cho cây chè để tăng hàm lượng mùn trong đất (Taton, 2005)[7]. Nguồn Carbon hữu cơ trong đất có thể được cải thiện trong suốt quá trình bón phân hữu cơ. Từ năm 1992 - 1997, Quỹ Kellogg, W. K tài trợ thử nghiệm bón phân hữu cơ được bổ sung thêm một số loài vi sinh vật có ích thuộc 2 chi: Bacillus, Pseudomonas có khả năng phân giải lân, kali tại 2 vùng trồng chè trọng điểm của Srilanca và nhận thấy năng suất chè tăng 9 – 14% so với đối chứng có bón phân hữu cơ và tăng 17% so với đối chứng không sử dụng 2 loại phân bón này (Kellogg, 1997)[8]. Kết quả thí nghiệm của Christian Bruns và Christian Schüler năm 2000 cũng cho thấy nếu phân hữu cơ (làm từ phân người, gia súc và cây xanh) có bổ sung thêm Bacillus subtilus, Lactobaccillus rhammossus, Bacillus polymyxa bón cho chè thì chất hòa tan trong chè tăng từ 47,31% (chỉ bón phân hữu cơ) lên 51,01% (bón phân hữu cơ vi sinh) (Christian Bruns và Christian Schüler, 2000)[9]. Đã có nhiều biện pháp xử lý rác thải nông nghiệp như đốt, chôn lấp, ủ phân phân hữu cơ vi sinh. Ở Australia, Pháp, Indonesia, Malaysia, Miến Điện, Philippine, Tây Ban Nha và Thái Lan, phụ phẩm nông nghiệp thường được đem đốt. Các nước Mỹ, Đức, Italia... xử lý bằng cách chôn vùi chiếm 60-80%. Bên cạnh việc sử dụng nguồn rác thải nông nghiệp để làm nhiên liệu, trong nuôi trồng thủy sản, 10 công nghiệp sản xuất đồ gốm, công nghiệp sản xuất silic...Đa số lượng rác thải còn lại được đốt bỏ không sử dụng. 1.2. NHÓM VI SINH VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH 1.2.1. Vi sinh vật cố định đạm Cố định đạm hay cố định nitơ là một quá trình mà nitơ (N2) trong khí quyển được chuyển đổi thành amoni (NH4+). Nitơ trong khí quyển hoặc phân tử khí nitơ (N2) tương đối trơ, tức là nó không dễ dàng phản ứng với các hóa chất khác để tạo ra hợp chất mới. Quá trình cố định phân giải các phân tử nitơ dạng hai nguyên tử (N2) thành các nguyên tử. Cố định đạm trong tự nhiên và tổng hợp, là quá trình cần thiết cho tất cả các hình thái của sự sống bởi vì nitơ là cần thiết để sinh tổng hợp các yếu tố cấu tạo cơ bản của thực vật, động vật và các hình thái sự sống khác; ví dụ, nucleotide trong DNA và RNA và các axit amin trong protein. Do đó, cố định đạm cần thiết trong nông nghiệp và sản xuất phân bón. Đây cũng là một quá trình quan trọng trong sản xuất thuốc nổ (ví dụ như thuốc súng, thuốc nổ TNT, v.v). Cố định đạm tự nhiên trong không khí là nhờ tia sét. Cố định đạm cũng gồm những dạng chuyển đổi sinh học khác của nitơ, chẳng hạn như chuyển đổi sang nitơ điôxit (NO2). Vi sinh vật có thể cố định được nitơ là những sinh vật nhân sơ (cả vi khuẩn và vi khuẩn cổ) gọi chung là các vi khuẩn cố định đạm (diazotroph). Một số thực vật bậc cao, và một số động vật (mối), đã có những hình thức cộng sinh với các vi khuẩn (diazotroph) này. Nhiều nghiên cứu cho thấy các nhóm vi sinh vật trong đất có khả năng hòa tan lân khó tan và phóng thích lân dễ tan cho cây trồng do chúng có khả năng tổng hợp và phóng thích các acid hữu cơ và trực tiếp hòa tan lân khó tan thành lân dạng dễ hấp thu. Khi sử dụng các loài vi sinh vật nầy sản xuất phân sinh học bón cho cây trồng đã giúp tăng năng suất một cách rất có ý nghĩa. 1.2.2. Vi sinh vật phân giải lân 11 Photpho là nguyên tố quan trọng thứ 2 trong 3 nguyên tố dinh dưỡng đa lượng chính của cây trồng (N, P,K), là thành phần của axit nucleic, phytin, photpholipit. Photpho có tác động trực tiếp đến quá trình tích lũy đường, protein, lipid, vitamin… của cây trồng. Đặt biệt photpho là thành phần không thể thiếu của ATP, ADP, AMP (phân tử trao đổi năng lượng), kiểm soát, điều khiển quá trình trao đổi năng lượng của cây (hô hấp, quan hợp..). Photpho có tác dụng thúc đẩy phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng. Thiếu photpho, sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc ít phân cành, đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng. Thiếu photpho, năng suất cây trồng bị giảm sut nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ. Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của photpho trong tự nhiên diễn ra theo một quy trình khép kín gọi là vòng tuần hoàn của photpho thông qua 4 quá trình (khoáng hóa, cố định sinh học, cố định hóa học và phân giải). Theo như các nghiên cứu cây trồng chỉ có thể hấp thu 5 25% lượng lân được bón, số còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi. VSV phân giải lân, VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSM) là các VSV có khả năng chuyển hóa hợp chất photpho khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Các VSV phân giải hợp chất photpho khó tan được biết đến nay là các loài: Pseudomonas, Micrococus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Sclerotium, Aspergillus. Các VSV này không chỉ phân giải photphat canxi mà cả photphat nhôm, sắt, mangan và các dạng khác kể cả quặng. 1.2.3. Vi sinh vật phân giải xenlulo Thủy phân xenlulo bởi enzyme từ vi sinh vật là bước quan trọng trong chu trình carbon. Mặc dù có một lượng rất lớn xenlulo nhưng chỉ một phần trăm rất nhỏ vi sinh vật có khả năng phân giải vì sự cứng cáp của thành tế bào. Có ít nhất năm cơ chế riêng biệt được sử dụng ở những loài vi sinh vật khác nhau nhằm phân giải xenlulo với sự có mặt của enzyme cellulase. Không chỉ đóng góp vai trò trong chu trình carbon tự nhiên, vi sinh vật phân giải xenlulo còn có tiềm năng lớn trong việc phân hủy xenlulo trong nước ô nhiễm (Hubbe và cs 2012; Hubbe và cs 2013)[10,11] và chuyển hóa