Tài liệu Luận văn thạc sĩ khoa học nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ.ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh bắc giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thanh Loan ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA SPECIOSA (CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG” LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thanh Loan ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA SPECIOSA (CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : Hướng dẫn 1: TS. Đồng Thị Kim Cúc Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Thanh Hương Hà Nội - 2019 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác. Các số liệu chưa từng được công bố trong luận án, luận văn nào trước đây. Mọi dữ liệu trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên! Tác giả Nguyễn Thanh Loan i Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô và các cán bộ công tác tại Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Học viện. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đồng Thị Kim Cúc và TS. Nguyễn Thị Thanh Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cho tôi trong quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể các cán bộ, anh chị em, bạn bè, đồng nghiệp trong Trung Tâm thực nghiệm Sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Luận văn này được thực hiện bởi sự cho phép của Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Thực nghiệm sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao và được thực hiện từ nguồn kinh phí đề tài “Nghiên cứu đánh giá, bảo tồn nguồn gen cây Sâm Núi Dành phân bố trên địa bàn Tỉnh Bắc Giang” Luận văn có sự động viên và giúp đỡ của gia đình tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 9 tháng 10 năm 2019 Tác giả Nguyễn Thanh Loan ii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Viết đầy đủ Viết tắt DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) Cs Cộng sự BA Benzyladenine (6-Benzyladenine) CT Công thức ĐC Đối chứng Ki Kinetin IBA Indole-3-butyric acid MS Murashige và Skoog (1962) NAA Naphthaleneacetic acid TB Trung bình TN Thí nghiệm CV% Hệ số biến động (Correlation ò Variance) LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0,05 (Leant Significant Difference) MTN L Mg Môi trường nền lít miligram iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................... 1 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI .............................................................................. 2 3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................ 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH ............................. 3 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA ... 5 1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ ...................................................................... 6 1.3.1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật .................... 6 1.3.2. Bộ gene lục lạp ...................................................................................... 7 1.3.3. Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân ............................................ 7 1.3.4. Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống nhân sâm. .. 9 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH .................................................................................................... 10 1.5. TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP ... 11 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................11 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................12 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 14 2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THƠI GIAN NGHIÊN CỨU . 14 2.1.1.Đối tượng ..............................................................................................14 2.1.2.Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................14 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................14 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...................................................................... 14 2.2.1. Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài Sâm Núi Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập được trên địa bàn tỉnh Bắc Giang......................................................................................................14 2.2.2. Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ Sâm Núi Dành 15 2.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương pháp nuôi cấy invitro 15 2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 15 2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa.................................15 2.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài bằng các marker đặc trưng-Barcode....................................................................................16 iv 2.3.3. Phương pháp phân tích định tính một số nhóm hoạt chất có dược tính trong loài Sâm Núi Dành......................................................................................19 2.3.4. Phương pháp nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành ..................20 2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................25 2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................25 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................... 26 3.1. THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM THU THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG. ..................................... 26 3.1.1. Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang ........26 3.1.2. Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành. ........................28 3.2. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG CỦ SÂM NÚI DÀNH .............................................................................................................. 32 3.3. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÂM HOM VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO..36 3.3.1. Phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom ........................................................................................36 3.3.2. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro .............................................................................40 3.3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm .............................................................51 CHƯƠNG 4 . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 54 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................... 54 4.2. KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 55 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1. Danh sách các mồi ITS .......................................................................14 Bảng 3.1. Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm .............................................................28 Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu Sâm nghiên cứu ...........30 Bảng 3. 3. Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu ..............................31 Bảng 3.4 . Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành dưới 3 năm tuổi ....32 Bảng 3.5. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành từ 3-5 năm tuổi .......33 Bảng 3.6. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành trên 5 năm tuổi .......33 Bảng 3.7. Một số hình ảnh của phản ứng định tính một số nhóm chất................34 Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ hom giâm ...............36 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây hom Sâm Núi Dành............37 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch bệnh ................................................................................................40 Bảng 3. 11. Ảnh hưởng của Ki đến khả năng tái sinh chồi..................................42 Bảng 3. 12. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm Núi Dành .....................................................................................................................45 Bảng 3. 13. Ảnh hưởng của MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ ............46 Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của ½MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ ........46 Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của môi trường MS và IBA đến sự hình thành rễ .........47 Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của môi trường ½MS và IBA đến sự hình thành rễ ......48 Bảng 3. 17. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới chất lượng bộ rễ ..........................50 Bảng 3. 18. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây Sâm Núi Dành in-vitro....51 Bảng 3.19. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S1 trong NCBI ....................................................................................................................64 Bảng 3.20. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S2 trong NCBI ....................................................................................................................65 Bảng 3.21. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S3 trong NCBI ....................................................................................................................66 Bảng 3.22. Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S4 trong NCBI ....................................................................................................................67 vi DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. a) Cây Sâm Núi Dành , b) Cây Sâm Đắng ..........................................26 Hình 3.2. Củ Sâm Núi Dành và củ Sâm Ngọt (Sâm Nam) ..................................27 Hình 3.3. Các dạng lá Sâm thu tại tỉnh Bắc Giang ..............................................27 Hình 3.4. a) Quả Sâm Núi Dành b) Quả Sâm Đắng ..........................................27 Hình 3. 5. Hom Sâm Núi Dành được xử lý qua các công thức thí nghiệm .........37 Hình 3.6. Động thái tăng trưởng số chồi/hom .....................................................38 Hình 3.7. Động thái tăng trưởng chiều dài của chồi hom giâm ...........................39 Hình 3.8. Động thái tăng trưởng số lá/chồi ..........................................................39 Hình 3. 9. Mẫu Sâm Núi Dành sau 2 tuần trên môi trường tái sinh ....................42 Hình 3. 10. Chồi Sâm Núi Dành trên các CT môi trường nhân nhanh ................44 Hình 3. 11. Ảnh hưởng của môi trường và nồng độ các hoocmon tăng trưởng đến khả năng hình thành rễ .........................................................................................49 Hình 3. 12. Chồi Sâm ra rễ trên môi trường có bổ sung 1 mg/l IBA + 0,4 mg/l THT ......................................................................................................................50 Hình 3. 13. Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh ............................................51 Hình 3.14. Cây Sâm Núi Dành in-vitro ra cây trên các công thức giá thể ..........52 vii MỞ ĐẦU 1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ở Việt Nam, trong tổng số 3.948 loài cây thuốc có khoảng 87,1% là các loài mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu ở các quần xã rừng, số còn lại là cây trồng. Mỗi năm ngành Y dược tiêu thụ 30-50 tấn dược liệu các loại phục vụ chữa bệnh hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 lượng dược liệu được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trong nước, vì thế nhu cầu cây thuốc trong nước là rất lớn. Năm 2016, Viện Dược liệu đã công bố tổng số 5117 loài cây thuốc đã được phát hiện [1]. Sâm Núi Dành là một loài cây thuốc phân bố ở chân Núi dành thuộc huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Hiện nay cho thấy do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên Sâm Núi Dành bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt. Theo Sách đỏ Việt Nam (2007), loài này được xếp ở mức độ sẽ bị nguy cấp bởi nơi cư trú của chúng bị thu hẹp do rừng thường xuyên bị chặt phá; loài bị khai thác nhiều để làm thuốc có thể dẫn đến cạn kiệt [2]. Một nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn kiệt nguồn gen quý này là do cây Sâm Núi Dành rất khó nhân giống. Hạt nảy mầm rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vùng phân bố của Sâm không đa dạng. Việc bảo tồn loài sâm quý này đang ở mức báo động, cần sự chung tay góp sức của các cấp, ngành và người dân địa phương. Một trong những mục tiêu quan trọng của đề tài là nhân giống vô tính được loài Sâm Núi Dành nhằm lưu giữ, bảo tồn nguồn gen quý của loài Sâm này do nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác ồ ạt. Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống Sâm Núi Dành có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách. Nguồn cung cấp cây giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp nhân giống truyền thống: giâm cành, gieo hạt nhưng hệ số nhân giống đạt rất thấp, hạt gần như không nảy mầm ngoài tự nhiên. Để cải thiện hệ số nhân giống cây Sâm này, chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm thiết lập quy trình nhân giống vô tính loài Sâm Núi Dành có nguồn gốc từ tỉnh Bắc Giang. Nuôi cấy 1 mô tế bào thực vật là một trong những công cụ hữu hiệu cho việc nhân giống và bảo tồn này. Nó cho phép trong thời gian ngắn nhất, nhân nhanh với quy mô lớn và cây có độ đồng đều cao, sạch bệnh và giữ được đặc tính di truyền của bố mẹ. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu, đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành (Callerya speciosa (Champ. ex Benth) Schot) phân bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang”. 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Nghiên cứu, điều tra, thu thập các mẫu Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang. Xác định chính xác tên loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp sinh học phân tử và xác định thành phần một số hoạt chất trong củ Sâm Núi Dành ở các độ tuổi khác nhau. - Xây dựng được quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và công nghệ in-vitro. 3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học bước đầu về nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành. - Các kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là tài liệu tham khảo trong việc nghiên cứu, giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH Sâm Núi Dành là một đối tượng chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam và trên thế giới. Vì vậy, việc tiếp cận các kết quả nghiên cứu còn hạn chế, việc định hướng các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước cũng khó khăn. Sâm Núi dành được biết đến qua một số bài báo của tác giả Trần Đình Dũng, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Theo bài viết của tác giả, trong sách “Đại Nam nhất thống chí”, có ghi: “Tên nỏ sản xuất tại Yên Thế. Sâm Nam sẵn ở đỉnh núi Chung Sơn. Cỏ thi cũng có ở Chung Sơn”. Núi Chung Sơn được nhắc tới đó là Núi Dành, nay phần lớn thuộc xã Liên Chung và phần còn lại thuộc địa phận xã Việt Lập, huyện Tân Yên. Những câu chuyện quanh loài Sâm quý này được người dân sinh sống dưới chân Núi dành kể lại. Theo ông Nguyễn Văn Được, 72 tuổi ở thôn Hậu, nhà ngay dưới chân Núi dành cho biết: “Núi dành xưa kia toàn cây de với giàng giàng, mỗi lần Lý trưởng kiếm được củ sâm thì mừng lắm, hiện ở góc vườn nhà tôi còn một khóm sâm, mỗi năm nó chỉ ra một đốt từ đó mọc rễ và ra củ nên củ không lớn, tôi cũng đã từng nhân thử giống Sâm Núi dành nhưng không thành công, và cũng đã nhiều lần thử du nhập những giống sâm khác về trồng nhưng không sống được có lẽ do thời tiết và thổ nhưỡng không hợp”. Ông Nguyên Khắc Lư, 62 tuổi, ở thôn Hậu, xã Liên Chung tâm sự, gần hai chục năm trước ông nhận đất trồng rừng ở chân Núi dành. Trong một lần cuốc đất thấy bật lên những củ nhỏ, mùi thơm, nếm thử thấy ngọt mát, vốn gia đình có nghề làm thuốc Đông y nên ông Lư biết mình gặp may khi tìm thấy gốc Sâm Núi dành và ông giữ gìn từ đó cho tới bây giờ. Theo ông Lư, loại sâm này phải trên 10 năm tuổi dùng mới hữu dụng. Những căn bệnh thông thường như ho cảm sốt, đau đầu, nhất là đối với trẻ nhỏ dùng chút ít là khỏi [3]. Bằng phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, các tác giả Đồng Thị Kim Cúc và cộng sự, đã xác định được Sâm Núi Dành thuộc họ đậu (Fabaceae), chi Callerya có tên khoa học Callerya speciosa (Champ.) Schot., [4]. 3 Đặc điểm nông sinh học: Thân: Sâm Núi Dành thuộc dạng cây dây leo hoặc trườn, thường dài 4 5 m hoặc hơn, cành non có lông màu bạc; Rễ củ nạc, có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và vị ngọt mát. Lá kép lông chim lẻ, trục chính của lá dài 6-15 cm, mang 3-7 lá chét; lá chét hình bầu dục dài hay trái xoan, cỡ 3-8 x 1-3 cm, 2 mặt có lông tơ màu trắng, gân bên có 5-6, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới lá xanh nhạt. Hoa: Cụm hoa chùm, mọc ở đầu cành hay nách lá, dài đến 30 cm, cuống hoa và đài đều có lông nhung trắng. Hoa to, mọc đơn độc trên đốt trục cụm hoa, dài 2,5-3 cm. Đài hình chuông, 5 mảnh dính với nhau, cỡ 9 x 12 cm, mặt ngoài có lông, mép có 4 răng; tràng 5 cánh không đều nhau, tiền khai hoa cờ: cánh cờ (ở trên) lớn nhất, có màu sắc đẹp hơn và ở ngoài cùng, 2 cánh bên nhỏ hơn, trong cùng là 2 cánh thìa dính lại với nhau ở đáy tạo thành cấu trúc tương tự như cái thuyền con mang kèm nhị và nhụy. Cánh hoa màu trắng ngà, cánh cờ không có lông, 2 bên gốc có cục chai. Nhị 10, 9 chiếc dính lại với nhau ở phần chỉ nhị thành 1 bó bao quanh nhụy, 1 chiếc rời. Bầu nhụy lớn, 1 ô, mang 2 dãy noãn, khi phát triển được sẽ tạo ra quả. Bầu hình thuôn, dài bằng nhị. Quả đậu, dẹp, cỡ 9-18 x 1,2-1,6 x 0,7-0,8 cm, có lông nâu phủ dầy. Hạt 2-3, hình trứng, cỡ 1 cm. Củ sâm có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và có vị hơi ngọt. Sinh học, sinh thái: Mùa ra hoa tháng 6-8, quả tháng 9-12 [4]. Giá trị sử dụng: Rễ củ được đào ở những cây trên 1 năm tuổi, phơi khô, thái mỏng, tẩm nước gừng hoặc mật ong, sao vàng dùng làm thuốc; có tác dụng trị đau vùng lưng, khớp, thông kinh hoạt lạc, bổ nhuận phế, chữa cơ thể suy nhược, kém ăn, ho nhiều đờm, nhức đầu, bí tiểu tiện [5]. 4 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA Ting Yin và cộng sự đã phân lập được flavonoid millettiaspecoside A, millettiaspecoside B, millettiaspecoside C, millettiaspecoside D, khaephuoside B, seguinoside K, ablbrissinoside B từ phân đoạn n-butanol của dịch chiết cồn củ Callerya speciosa (Champ.) [6], [7]. Zong XK và cộng sự đã phân lập được thêm 5 chất từ dịch chiết cồn 95o củ Callerya speciosa: Isoliquitigenin, maackiain, pterocarpin, medicarpin, homopterocapain [8]. Ping Ding và cộng sự đã phân lập được thêm 13 chất từ phân đoạn ether và ethyl acetat dịch chiết củ M. speciosa: docosanoic acid, tetracosane, octadecane, hexacosanoic acid, β-sitosterol acetate, β-sitosterol, syringin, maackiain, ormononetin, ψ-baptigenin, rotundic acid, pedunculoside và daucosterol. Trong đó có β-sitosterol acetate, syringin, ψ-baptigenin, rotundic acid và pedunculoside là những chất lần đầu tiên được công bố có mặt trong cây [9]. Wang Cheng – wen đã định lượng được hàm lượng flavonoid tổng trong dịch chiết chloroform rễ củ Millettia speciosa lên đến 5,52 mg/g dược liệu [10]. Jun Cheno và cộng sự đã phân lập được 3 isoflavon glycosid từ thân loài Callerya nitida (Millettia nitida var. hirsutissima) gồm: formononetin 7O-b-D-(6-ethylmalonyl)- glucopyranoside (hirsutissimiside A); 5Omethylgenistein 7-O-a-L- rhamnopyranosyl-(1→6)-b-D-glucopyranoside (hirsutissimiside B); retusin 7,8-di- O-b-Dglucopyranoside (hirsutissimiside C) [11]. Ito Chihiro và cộng sự đã phân lập được các isoflavonoid từ dịch chiết aceton của thân và hạt loài Callerya atropurpurea (Millettia atropurpurea) gồm: isoformonotein, sayanedine, prunetin, formonotein, auriculasin, millepurone, vestitol và millepurpan [12]. Fang Song-Chwan và cộng sự đã phân lập được 6 flavonoid từ thân loài Callerya reticulata var. reticulata (Millettia reticulata Benth.) gồm: (-) epicatechin; narigenin; 5,7,3’,5’- tetrahydroxy flavone; formononetin; 5 isoliquirtigenin và genistein [13]. Theo Đỗ Tất Lợi, loài M. speciosa có chứa tinh bột và alkaloid [14] 1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ 1.3.1. Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của thế giới sinh vật. Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa. Sự xuất hiện và phát triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa – PCR [15] đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA. Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở thực vật. Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gene: bộ gene trong nhân, bộ gene ty thể và bộ gene lạp thể. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở các bộ gene này xảy ra không đồng đều. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở mỗi bộ gene đã được đánh giá thông qua việc quan sát các thay thế nucleotide ở hàng loạt thực vật một và hai lá mầm [16]. Bộ gene ty thể có mức độ thay thế nucleotide thấp nhất, trung bình khoảng (0,2 - 1,1) × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Bộ gene lạp thể có mức độ thay thế nhanh hợn chút ít, khoảng (1,1 – 2,9) × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Trái lại, bộ gene trong nhân có tỷ lệ thay thế nucleotide nhanh hơn gấp 150 lần so với bộ gene ty thể (đến 31,5 × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Nghiên cứu đánh giá về tỷ lệ thay thế nucleotide dựa trên các dữ liệu trình tự từ lúa và ngô cũng cho kết quả tương tự như Wolfe và cộng sự. Tỷ lệ thay thế nucleotide ở những cây này khác về căn bản so với sự tiến hóa nhanh chóng của các phân tử ty thể ở động vật. Trong lịch sử tương đối ngắn của hệ thống học phân tử, lúc đầu các nhà nghiên cứu tập trung tương đối nhiều vào bộ gene lục lạp, tuy nhiên điều đó 6 đã thay đổi khi các khảo sát về sau đã chuyển hướng sang các trình tự gene trong nhân [17]. 1.3.2. Bộ gene lục lạp Bộ gene lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông thường được đặc trưng bởi phân tử dạng vòng. Bộ gene này bé nhất trong số ba bộ gene, khoảng 135-160kb [18] với hai phân đoạn lặp đảo [inverted repeat (IR) segments] chia phần phân tử còn lại thành một vùng LSC (large single-copy region) và một vùng SSC (small single-copy region). Thành phần, kích thước, cấu trúc và trình tự của bộ gene lục lạp đã được xác định là có mức độ bảo tồn cao trong các nghiên cứu về tiến hóa [19]. Tính bảo tồn cao này chỉ ra rằng bất kỳ thay đổi nào về cấu trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan mạnh mẽ đến quan hệ phát sinh. Các phần khác nhau của bộ gene tiến hóa theo các tỷ lệ khác nhau và tương đối chậm ở mức độ trình tự nucleotide. Những vùng không mã hóa của bộ gene lục lạp tiến hóa nhanh hơn những vùng mã hóa [16]. Các đột biến ở DNA lục lạp thường là các thay thế nucleotide hay sự sắp xếp lại. Các đột biến tăng đoạn hay mất đoạn tích lũy trong vùng không mang mã xảy ra với tỷ lệ ngang với sự thay thế nucleotide và chính kiểu đột biến này làm tăng cường tính đa dạng của các vùng không mang mã. Phần lớn các gene lục lạp là loại gene đơn bản trong khi các gene trong nhân là thành viên của những họ đa gene. Tính bảo tồn cao của DNA lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng nó để xây dựng lại mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực vật [20],[17]. Có thể thấy những gene mã hóa và không mã hóa ở lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh như sau: 1.3.3. Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân Bộ gene trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực vật (1.1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gene. Phần lớn các nổ 7 lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự DNA ribosome trong nhân. Cấu trúc căn bản của DNA ribosome là một đơn vị lặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene. Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống bên ngoài vùng sao mã (ETS), tiếp theo là gene 18S mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ và gene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gene nhỏ hơn là 5,8S. Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách rời những gene vừa đề cập. Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở các thực vật: gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S là khoảng 160bp. Ngược lại, chiều dài của các khoảng trống giữa các gene biến động từ 1 đến 8kb. Họ gene rDNA chứa các vùng bảo tồn cao như 18S, 26S có thể sử dụng để suy luận các quan hệ phát sinh ở các mức độ phân loại cao. Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể. Các trình tự 18S rDNA thường được sử dụng rộng rãi hơn các trình tự 26S. Cho dù cả hai vùng cùng được có dải ứng dụng rộng như nhau nhưng kích thước trên 3000bp của 26S rDNA đã cản trở các nhà nghiên cứu, đặc biệt là trong việc giải trình tự toàn bộ gene. Trái lại, kích thước của 18S rDNA khoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng PCR và giải trình tự. Thực tế cho thấy hình thể cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự rbcL ở nhiều mức độ phân loại ở thực vật hạt kín. Cho dù rất có tiềm năng trong việc xây dựng cây quan hệ phát sinh ở thực vật, vùng 18S rDNA vẫn chưa được tận dụng trong hệ thống học thực vật hạt kín [17]. Gene 26S rDNA thường được lưu ý là ứng viên cho việc thay thế gene 18S rDNA. Khi so sánh có thể nhận thấy toàn bộ gene 26S rDNA tiến hóa nhanh gấp từ 1,6 đến 2,2 lần và cung cấp các đặc điểm mang tính thông tin nhiều hơn 3 lần so với 18S rDNA. 8 Gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng các mồi định vị trên các gene 18S và 26S rDNA. Gene 5,8S rDNA hiếm khi được sử dụng để suy luận quan hệ phát sinh bởi tính bảo tồn cao và kích thước bé (164-165bp). Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật có hạt cũng tương đương với gene 18S rDNA. Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rDNA với gene 5,8S rDNA còn ITS 2 phân cách gene 5,8S rDNA với gene 26S rDNA. Vùng ITS hiện hữu một cách rộng rãi dưới 700bp ở các thực vật có hoa [21]. Vùng ITS chứa các trình tự bảo tồn cao nên rất nhiều mồi tổng thể được thiết kế cho việc khuếch đại và giải trình tự đã được mô tả. Các trình tự ITS1 và ITS2 vốn giàu GC làm cho việc giải trình tự trở nên khó khăn. Khó khăn trong việc giải trình tự biến động theo các nhóm thực vật và việc cho thêm DMSO hay BSA vào PCR hay phản ứng giải trình tự là việc bổ sung mang lại hiệu quả cao [22]. Việc căn trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín chỉ ra rằng các trình tự ITS1 và ITS2 đa dạng hơn trình tự của các gene rDNA. Các trình tự ITS biến động một cách hiệu quả cho phép giải quyết những câu hỏi về quan hệ phát sinh ở những taxon có quan hệ họ hàng gần. Theo đó, rất nhiều các bài báo thể hiện sự thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa sử dụng các trình tự ITS [23],[24]. Hơn nữa, vùng ITS được di truyền theo kiểu từ cả cha và mẹ khiến cho nó cũng có thể được sử dụng để thăm dò sự lai chéo [25]. 1.3.4. Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống nhân sâm. Tại Hàn Quốc, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại chi Panax đã được triển khai nhiều và đạt được nhiều kết quả mang tính ứng dụng cao. Trường đại học tổng hợp Hàn Quốc. Thư viện BAC (bacterial artificial chromosome) gồm 106.368 dòng với chiều dài trung bình khoảng 98,61kb[26]. Từ thư viện BAC các nhà khoa học đã thiết kế các chỉ thị phân tử SSR và thành công trong việc xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu trong phân biệt các giống sâm của Hàn Quốc và trên thế giới. Trường đại học Chung Ang Hàn Quốc đã nghiên cứu sự khác nhau giữa các loài nhân sâm bằng chỉ thị phân tử RAPD. Kết quả mồi OP-5A cho băng đơn ADN với các mẫu nhân. 9 Mồi chỉ thị RAPD13B chỉ sự khác nhau giữa các loài sâm [27]. Trường đại học William & Mary của Mỹ đã nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm Mỹ và nghiên cứu chọn giống Sâm bằng chỉ thị phân tử [28]. Năm 2011, Lee và cộng sự đã phát triển một chỉ thị SCAR dẫn xuất từ ISSR để nhận dạng các chủng sâm P.ginseng có đặc tính tốt phục vụ cho chọn giống. 34 trong số 85 mồi ISR hình thành locus đa hình. Các mồi UBC-821, UBC-868 và UBC-878 làm nảy sinh các băng đa hình giữa các chủng P.ginseng và cho phép phân biệt chúng với các mẫu P.quinquefolius và P.notoginseng [29]. Tác giả Hongtao Wang – Trung tâm nghiên cứu và sản xuất Sâm của Hàn Quốc đã nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu phân biệt giống sâm Chunpoong với các giống Sâm khác. Giống sâm Chunpoong là một giống nhập nội chất lượng cao và chất lượng cao trong số chín giống nhân sâm Hàn Quốc. Trung tâm đã nghiên cứu quy trình kiểm định giống Chunpoong bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự ADN của ty lạp thể (COX2) trên vị trí intron I và intron II. Chỉ thị phân tử SNP đặc hiệu đã được nghiên cứu dùng phân biệt giống nhân sâm Chunpoong với các giống nhân sâm khác một cách đơn giản và chính xác [30]. Từ năm 2012 đến nay Trung tâm Ươm tạo và Hỗ trợ doanh nghiệp Khoa học công nghệ đã hợp tác nghiên cứu giải trình tự hệ gen lục lạp của Sâm Ngọc Linh với Trường đại học Quốc gia Seuol Hàn Quốc. Cuối năm 2015 tác giả Nguyễn Văn Binh, cán bộ của Trung tâm đã nghiên cứu giải trình tự hoàn thiện genome lục lạp trên Sâm Ngọc Linh [31]. Kết quả này đóng vai trò rất quan trọng trong việc nghiên cứu mối quan hệ di truyền của Sâm Ngọc Linh với các loài khác trong họ Araliaceae và là cơ sở dữ liệu cho việc thiết kế các chỉ thị phân tử đặc trưng cho loài. 1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH Nguyễn Ngọc Dung là một trong những tác giả đầu tiên nghiên cứu nhân giống vô tính Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học thông qua tái sinh từ mô sẹo [32]. Năm 2010, Dương Tấn Nhật và cộng sự cũng tiến hành 10 nhân giống vô tính cây Sâm Ngọc Linh thông qua con đường phát sinh cơ quan [33]. Mô sẹo được cảm ứng ở các mẫu củ Sâm Ngọc Linh cắt mỏng trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày. Môi trường tốt nhất cho tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ. Số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao nhất trên môi trường Sh bổ sung1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 2,0 g/l thanh hoạt tính. Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, môi trường ½MS đực bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA, 50 g/l sucrose và 2 g/l thanh hoạt tính. Nguyễn Bảo Triệu và công sự cũng đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro Sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ sung 1,0mg/l 2,4D, 0,2 mg/l TDZ và trên môi trường SH bổ sung 1.0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA. Mai Trường và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tạo và nhân giống phôi sôma Sâm Ngọc Linh trong môi trường lỏng [34]. Hoàng Xuân Chiến và cộng sự đã thử nghiệm khả năng tạo củ in vitro và xác định hàm lượng saponin ở các cây trồng thử nghiệm 17 tháng tuổi [35]. Các hệ phức hợp của GA/ABA và auxin/cytokinin trong quá trình hình thành củ cũng được tác giả khảo sát. Nồng độ ABA thích hợp nhất cho quá trình tạo củ là 3,0 mg/l. GA3 ức chế khả năng tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh. Các chồi cây Sâm Ngọc Linh được cảm ứng để tạo củ thành công trên môt trường SH có bổ sung 1,0 mg/l NAA và 2,0 mg/l BA trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày. Nồng độ đường sucrose tốt nhất cho quá trình tạo củ là 50 g/l. Hàm lượng saponin trong củ của những cây 17 tháng tuổi nuôi trồng ngoài tự nhiên cũng đã được xác định là G-Rb1 (0,21%), G-Rg1 (0,17%) MR2 (0,77%) [35]. 1.5. TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 2008, Huang và cs đã nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy mô Millettia speciosa Champ. (tên gọi khác của Cellerya speciosa Champ.): Họ đã tìm được môi trường nền là MS + 1,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA kết quả cho tỷ lệ cảm ứng tạo chồi có thể đạt 100%. Sau khi cấy 20 ngày, các chồi nách bắt đầu nảy mầm và phát triển bình thường. Với môi trường nhân nhanh là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA, sau nuôi cấy 30 ngày cho hệ số nhân đạt 7,0, sự sinh trưởng và phát triển của chồi là bình thường. Môi trường tạo 11