Tài liệu (Luận văn thạc sĩ) Bước đầu nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng (Curcumalonga L.) và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ............... ***............... BÙI ANH VĂN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ............... ***............... BÙI ANH VĂN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG KHU HỆ NẤM VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ MAI HƯƠNG Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và gia đình. Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Mai Hương người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này. Tôi xin đươc bày tỏ lòng biết ơn đến đề tài “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam: cây thuốc có củ (cây nghệ), cây công nghiệp (cà phê) nhằm tăng năng suất và chất lượng cây trồng” MS: ĐTĐLCN.14/4 thuộc chương trình Hợp tác Nghiên cứu Việt Nam – Hà Lan, do PGS.TS Lê Mai Hương chủ nhiệm đã cho tôi cơ hội được thực hiện nghiên cứu của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Trường Đại Học Thái Nguyên đã tận tình truyền đạt cho tôi kiến thức trong suốt 2 năm học tập, là nền tảng cho tôi trong quá trình nghiên cứu luận văn, là hành trang quý báu theo tôi trong suốt cuộc đời. Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Đình Luyện, Ths. Hoàng Kim Chi và tập thể cán bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình thân yêu của tôi, những người đã luôn ở bên tôi, ủng hộ động viên và là chỗ dựa vững chắc để tôi yên tâm học tập hoàn thành khóa học này. Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô, Anh, Chị và gia đình dồi dào sức khỏe, thành công trong sự nghiệp! Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc./. Tác giả luận văn ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................i LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................ii MỤC LỤC ........................................................................................................... iii DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ..................................................................... v DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................vi DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .................................................................................... viii MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1 CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3 1.1. Cây Nghệ vàng(Curcuma longa L.) ........................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật ................................................................................. 3 1.1.2. Thành phần hóa học .............................................................................. 4 1.2. Đại cương khu hệ nấm vùng rễ ................................................................... 5 1.2.1. Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizae) ............................................ 5 1.2.2. Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizae) ............................................. 6 1.2.3. Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza) ............................ 7 1.2.4. Một số loại nấm rễ khác........................................................................ 8 1.2.5. Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ................................................... 8 1.2.6. Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ.......................... 10 1.3. Vai trò khu hệ nấm vùng rễ ...................................................................... 11 1.4. Nấm vùng rễ trên cây thuốc ...................................................................... 15 1.5. Một số yếu tố tác động đến khu hệ nấm vùng rễ.................................... 15 1.5.1. Ảnh hưởng của các yếu tố lý học ..................................................... 15 1.5.2. Sự tương quan giữa các nhóm vi sinh vật với khu hệ nấm vùng rễ.17 1.6. Một số nghiên cứu về khu hệ nấm vùng rễ ............................................... 17 1.6.1. Trên thế giới........................................................................................ 17 1.6.2. Việt Nam ............................................................................................. 21 1.7. Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu các khu hệ vi sinh vật...... 23 1.7.1. Giới thiệu về công nghệ metagenomics.............................................. 23 1.7.2. Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu khu hệ vi sinh vật đất...24 CHƯƠNG II : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................... 26 iii 2.1. NGUYÊN LIỆU ...........................................................................................26 2.1.1. Mẫu nghiên cứu ..................................................................................... 26 2.1.3. Hóa chất ................................................................................................. 26 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm .................................................................................26 2.1.5. Môi trường ............................................................................................. 26 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu ..................................................................... 27 2.2.2. Phân lập bào tử AM ............................................................................ 28 2.2.3. Phân lập chủng nấm vùng rễ ............................................................... 28 2.2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM ......... 29 2.2.5. Hoạt tính sinh enzyme ngoại bào........................................................... 29 2.2.6. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................29 2.2.7. Kỹ thuật PCR ......................................................................................... 30 2.2.8. Phương pháp Tách dòng gen thông qua vector pBT ............................. 31 2.2.9. Đọc và phân tích trình tự ....................................................................... 32 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................... 34 3.1. Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh .................................................... 34 3.2. Ảnh hưởng của thời gian thu mẫu đến khu hệ nấm AM vùng rễ Curcuma longa L. ............................................................................................ 35 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến khu hệ AM ...................................... 38 3.4. Phân lập các chủng nấm vùng rễ khác ................................................... 42 3.4.1. Phân lập mẫu rễ ................................................................................ 42 3.4.2. Phân lập mẫu đất vùng rễ ................................................................. 43 3.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ........................................................... 45 CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 49 4.1. Kết Luận.................................................................................................... 49 4.2. Kiến nghị ...................................................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 50 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 56 iv DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Viết đầy đủ 1 AM Endomycorrhizae 2 EM Ectomycorrhizae 3 AEM Nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn 4 SEM Nấm rễ nội cộng sinh có màng ngăn v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. 1: Cây nghệ vàng trông tại Hưng Yên [48].............................................. 3 Hình 1. 2: Nấm rễ nội cộng sinh [47] ................................................................... 6 Hình 1. 3: Nấm rễ ngoại cộng sinh [46]................................................................ 7 Hình 3. 1: Bào tử AM phân lập từ các mẫu đất N1t và N11t ............................. 35 Hình 3. 2: Khả năng sinh enzyme ngoại bào ...................................................... 47 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1: Trình tự mồi sử dụng cho định danh các chủng nấm ........................ 30 Bảng 2. 2: Trình tự mồi cho định danh các chủng nấm AM............................... 31 Bảng 3. 1: Số lượng bào tử AM tổng số trong 100g đất phân lập ...................... 34 Bảng 3. 2: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở khoảng thời gian khác nhau. ............................................................................... 35 Bảng 3. 3: Số lượng và thành phần nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ ở điều kiện nitơ khác nhau. ............................................................................................ 40 Bảng 3. 4: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ rễ cây nghệ ............................ 44 Bảng 3. 5: Đặc điểm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ cây nghệ ............. 46 Bảng 3. 6: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập vii 47 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. 1: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất ...................... 37 Biểu đồ 3. 2: Tổng số loài và chi nấm AM có trong các mẫu đất vùng rễ ở điều kiện bón nitơ khác nhau ...................................................................................... 41 Biểu đồ 3. 3: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập ...47 viii CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU MỞ ĐẦU Khu hệ nấm vùng rễ là quần hợp nấm - thực vật đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng như nhiều hệ sinh thái. Hơn 90% các loài thực vật có quan hệ với nấm theo hình thức nấm rễ và phụ thuộc vào mối quan hệ này để tồn tại. Chúng phát triển bằng cách phát triển hệ sợi ra vùng đất bao quanh rễ và lan dần ra xung quanh, nhờ đó làm tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng, nước của hệ rễ và đồng thời làm thay đổi cấu trúc đất theo chiều hướng có lợi. Với tầm quan trọng và ý nghĩa thiết thực hình thức cộng sinh này đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiển sản xuất nông - lâm nghiệp ở nhiều nước trên toàn thế giới. Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân rễ nghệ vàng chứa tinh dầu, đặc biệt curcumin – hoạt chất quý trong y dược. Nghệ không chỉ làm gia vị để tạo màu cho món ăn mà đặc biệt nghệ còn dùng để làm thuốc, có nhiều loại nghệ nhưng nhưng nghệ vàng được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Nghệ vàng có vị đắng cay, mùi thơm hắc, tính ấm, có tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống. Nghệ vàng dùng để chữa các bệnh: viêm loét dạ dày, phong thấp, tay chân đau nhức, đặc biệt Nghệ vàng còn dùng để điều trị ung thư, tiểu đường, viêm gan B, C, kháng nấm, chống oxy hóa, sử dụng trong Mỹ phẩm và Thực phẩm [9]. Hoạt chất Curcumin trong củ Nghệ (Curcuma longa L.): Curcumin là thành phần chính của Curcuminoit – một chất trong củ Nghệ, có tên khoa học là (1E,6E)-1,7-bis(4hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5dione. Curcumin có dạng bột màu vàng được mệnh danh như một loại thần dược có khả năng phòng chống và chữa được rất nhiều loại bệnh: tác dụng chuyển hóa lipid, hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư - cảm ứng apoptosis, chống tăng sinh mạch máu ở khối u, giúp tăng cường miễn dịch, chống đông máu, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về cây nghệ, nhưng khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ thì vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu. Vì vậy 1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU đây là một hướng tiếp cận mới trong nghiên cứu toàn diện về cây nghệ trong lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Bước đầu nghiên cứu đa dạng khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng”, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật metagenomics để nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng tới khu hệ nấm vùng rễ, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định mức độ đa dạng khu hệ nấm rễ AM và đánh giá một số chỉ tiêu sinh hóa. Nội dung nghiên cứu:  Khảo sát khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ vàng: Phân lập và phân loại một số chủng nấm vùng rễ nội cộng sinh và ngoại cộng sinh.  Đánh giá ảnh hưởng hàm lượng nitơ, thời gian thu mẫu lên sự đa dạng khu hệ nấm vùng rễ dụng kỹ thuật phân tích dữ liệu metagenomics. 2 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Cây Nghệ vàng(Curcuma longa L.) 1.1.1. Đặc điểm thực vật Cây Nghệ vàng còn có tên “Uất kim”, Khương hoàng. Tên khoa học là Curcumin longa L, họ gừng (Zingiberaceae), thuộc loại cây cỏ dại cao 0,6 – 1m thân rễ thành củ hình trụ hoặc hơi dẹt, khi cắt ngang có màu vàng sẫm [9]. Cây nghệ vàng được trồng phổ biến trong nước, tuy nhiên tập trung nhiều nhất ở vùng Hưng Yên, Thanh Hóa, Bình Dương. Trên thế giới có nhiều ở Ấn Độ, Indonesia, Campuchia, Lào, Trung Quốc và một số nhiệt đới khác. Hình 1. 1: Cây nghệ vàng trông tại Hưng Yên [48]. Nghệ vàng thuộc chi Curcuma, họ gừng. Chi này có 15 loài, trong đó ở Việt Nam tìm thấy 14 loài. Theo các nghiên cứu gần đây, còn có nhiều loài khác trong chi này có hoạt chất Curcumin như C.aromatica (nghệ trắng), C.zedoaria ( nghệ đen), lượng Curcumin cao nhất (cỡ 0,3%) phổ biến nhất ở Việt Nam cho nên rất thuận lợi cho việc dùng làm nguyên liệu sản xuất Curcumin [9]. 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.2. Thành phần hóa học Bằng các nghiên cứu khoa học đã thực hiện từ năm 1988 đến nay thành phần hóa học của củ nghệ vàng đã được xác định là gồm các thành phần chính như curcumin, tinh dầu, tinh bột, v.v. Sau đây là các thành phần cụ thể:  Chất màu curcumin 0,3% - 1%, tinh thể nâu đỏ ánh tím, không tan trong nước, tan trong cồn, ete, clorofoc, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục. - Các chất màu vàng gọi chung là curcumin. Vào đầu thế kỉ XIX người ta đã chiết được curcumin tinh thể không tan trong nước, tan trong cồn, ete, dầu béo. Nhưng năm 1953 Srinivasan đã chứng minh bằng sắc kí cột silic rằng đó là hỗn hợp: - Curcumin chính thức (còn gọi là curcumin I) chiếm 60% đây là một dixeton đối xứng không no có thể coi như là diferuloyl-metan (axit ferulic là axit hydroxy-4-metoxy-3-xinamic). - Curcumin II hay demetoxy-curcumin chiếm 24% và curcumin III hay bisdemetoxy-curcumin chiếm 14% trong đó 1 hay 2 hydroxyxinamic thay cho axit ferulic. Nếu dùng sắc kí trên giấy sẽ thấy các chất curcumin khác nữa nhưng với lượng rất nhỏ. - Năm 1977, Nguyễn Khang (Đại học Dược Hà Nội) đã chiết từ bột củ nghệ sau khi đã cất lấy hết tinh dầu bằng benzen, sau đó thu hồi dung môi trong áp lực giảm và kết tinh bằng cồn etylic cho tới khi có độ chảy không thay đổi và một vết trên sắc kí lớp mỏng đã thu được 0,76 – 1,1% curcumin I tinh khiết, độ chảy 182 -183°C. Nếu chọn củ nghệ thu vào tháng 1, tháng 2 có thể đạt tới 1,5% curcumin.  Tinh dầu 1 – 5% có màu vàng nhạt, thơm. Trong tinh dầu gồm có 25% cacbua tecpenic, chủ yếu là zingiberen và 65% xeton sespuitecpenic, các chất tumeron, curcumen C15H24 một cacbon không no.  Ngoài ra còn tinh bột, canxi oxalat, chất béo. Củ nghệ chứa 8 – 10% nước, 6 – 8% chất vô cơ, 40 – 50% tinh bột nhựa. 4 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.2. Đại cương khu hệ nấm vùng rễ Trong tự nhiên, giữa các sinh vật đều có mối quan hệ với nhau, ảnh hưởng lẫn nhau tạo thành quần xã sinh vật. Trong đó, quan hệ cộng sinh là cả hai cùng sống chung và cùng tồn tại. Khi mối quan hệ đó phát triển đến mức độ cao thì hình thành một loại cộng sinh. Mycorrhiza là thể cộng sinh giữa hệ sợi nấm trong đất với rễ của thực vật bậc cao, đây là mối quan hệ cộng sinh không thể tách rời, ảnh hưởng đến nhau: Nấm không có rễ thì không thể tồn tại, cây không có nấm thì sinh trưởng phát triển kém và chết. Sự cộng sinh giữa khu hệ nấm và rễ cây mang lại lợi ích cho cả hai bên. Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên được Frank – nhà bệnh cây lâm nghiệp người Đức – đưa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh [35]. Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ). Người ta thường chia khu hệ nấm cộng sinh trong đất và rễ thành 3 loại: nẫm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh. Ngoài ra, còn có một số loại khác. 1.2.1. Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhizae) Nấm rễ nội cộng sinh là nấm với thể sợi nấm xuyên qua các tế bào rễ, thường có một phần của sợi nấm còn nằm phía ngoài nhưng chúng không tạo lớp vỏ bao ngoài rễ. Đặc trưng là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lưới Hartig. Dựa vào kết cấu sợi nấm có vách ngăn và vòi hút, người ta chia nấm nội cộng sinh thành 2 loại: - Nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM) - Nấm rễ nội cộng sinh có màng ngăn (SEM). Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular). 5 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU So với nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh rất ít loài. Năm 1989, chỉ mới phát hiện 133 loài nấm rễ nội cộng sinh [39]. Con đường xâm nhập của nấm rễ nội cộng sinh: Giai đoạn 1: Thiết lập điểm tiếp xúc và phát triển dọc theo bề mặt của rễ. Giai đoạn 2: Một hoặc nhiều sợi nấm hình thành chỗ phồng thâm nhập vào tế bào biểu bì hoặc tế bào vỏ để vào rễ. Hình 1. 2: Nấm rễ nội cộng sinh [47] 1.2.2. Nấm ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizae) Nấm rễ ngoại cộng sinh là nấm có sợi nấm bao quanh rễ dinh dưỡng chưa hóa gỗ, không xuyên qua các tế bào mô rễ mà chỉ kéo dài giữa các tế bào. Đây là một loại nấm hình thành mạng lưới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và mô sợi nấm dày đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút. Nấm rễ ngoại cộng sinh thường có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhận thấy bằng mắt thường). Đặc trưng cơ bản của chúng là:  Trên bề mặt rễ dinh dưỡng hình thành một màng nấm (mantle) do các sợi nấm đan chéo nhau.  Giữa các tế bào tầng vỏ rễ hình thành một mạng lưới do thể sợi nấm sinh trưởng mà thành. 6 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU  Do tác dụng của nấm rễ, bộ rễ ngắn, to, giòn và có màu sắc khác nhau, tán rễ và biểu bì không có lông hút, bề mặt màng có nhiều sợi nấm kéo dài ra. Guo Xiuzhen và cộng sự đã phát hiện 140 loài, danh sách các loài, chi, họ, nấm ngoại cộng sinh thường hình thành thể quả trên mặt đất như nấm gan bò (Boletus), nấm bao ngỗng (Amatina), nấm tán đỏ (Russula), nấm da (Thelephora), nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma), nấm cổ ngựa đậu màu (Poisolithus)…[11]. Con đường xâm nhập của nấm rễ ngoại cộng sinh: Giai đoạn 1: Sợi nấm tiếp xúc, nhận biết và bám chặt các tế bào biểu bì rế ở gần đỉnh rễ của rễ non tích cực phát triển. Giai đoạn 2: Ở giai đoạn này sự xâm nhập các sợi nấm hình thành lớp phủ dày đặc trên bề mặt rễ. Hình 1. 3: Nấm rễ ngoại cộng sinh [46] 1.2.3. Nấm rễ nội ngoại cộng sinh (Ectoendo mycorrhiza) Nấm rễ nội ngoại cộng sinh mang đặc trưng của 2 loại nội cộng sinh và ngoại cộng sinh về hình thái cũng như sinh lý. Chúng thường có ở các rễ cây thông (Pinaceae), cây Cáng lò (Betula alnoides), Đỗ quyên quả mọng (Arbutus) và các cây thuộc họ Lan thủy tinh (Monotropaceae) [5]. 7 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.2.4. Một số loại nấm rễ khác.  Nấm rễ giả (Pseudo mycorrhiza): nấm rễ giả thường xuất hiện ở cây lá kim, đặc biệt là các cây con vàng yếu, hoặc vườn ươm thiếu ánh sáng, có lúc trên cây có phân bón nhiều. Loại này không có lưới Hartig và màng nấm nhưng trong tế bào rễ vẫn có sợi nấm nội sinh. Có tác giả cho rằng sự hình thành sợi nấm giả là do rễ nấm ngoại cộng sinh thoái hóa dần rồi do nấm gây bệnh xâm nhiễm mà hình thành. Những nấm gây bệnh này không ảnh hưởng lớn đến cây.  Nấm rễ ngoại vi (Peritrophic mycorrhiza): là nấm chỉ phủ một lớp lưới sợi thưa ở bề mặt ngoài của rễ nhưng không xâm nhiễm vào rễ cây hoặc xâm nhiễm ở mức nhẹ. Jan-Eriknylund cho rằng đó là giai đoạn đầu của lưới Hartig. Theo Piche (1982) từ khi có lưới thưa đến khi có lưới Hartig chỉ mất 5-14 ngày. Hiện tượng này không ảnh hưởng gì đến cây [16, 23]. 1.2.5. Sự hình thành nấm cộng sinh vùng rễ  Nấm rễ nội cộng sinh: Cũng như nấm ngoại sinh, sự xâm nhiễm của nấm rễ nội cộng sinh đến từ bào tử. Bào tử trong đất, trong điều kiện thích hợp nẩy mầm, sinh trưởng, mọc ra ống mầm, rồi hình thành sợi nấm vách dày có đường kính 20–30 µm, còn sợi nấm sau khi tiếp xúc hình thành sợi nấm vách mỏng, đường kính chỉ 2–7 µm, chất kích thích sinh trưởng nấm rễ do bộ rễ tiết ra làm cho những sợi này hướng về rễ cây, tiếp xúc nhanh với rễ cây. Sau khi tiếp xúc chúng hình thành vòi bám tạo thành điểm xâm nhiễm và thành “dùi sợi nấm” chọc thủng vỏ rễ. Điểm xâm nhập thường cách đuôi rễ 0,5 –1 cm, rồi liên tục hình thành nấm rễ nội cộng sinh mới. Nói chung điểm xâm nhiễm nấm rễ nội cộng sinh là vỏ rễ cây hoặc qua lông hút mà nhiễm vào. Khả năng xâm nhập của nấm rễ nội cộng sinh phụ thuộc rất lớn vào mức độ già, non của lông hút và loài cây chủ. Rễ cỏ 3 lá (Trifolim repens) thường phải sau 3 tuần, bạch đàn và cam quýt thường phải sau 1 tháng mới bắt đầu xâm 8 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU nhiễm. Về tỷ lệ xâm nhiễm người ta thường lấy ngô làm đối chứng, sau 2 tuần tỷ lệ xâm nhiễm là 23 – 27%. Cơ chế sợi nấm xuyên qua vách tế bào tầng bỏ rễ đến nay vẫn chưa rõ. Có tác giả cho rằng sợi nấm hình thành dùi, có tác giả lại cho rằng sợi nấm sản sinh enzyme. Nói chung, sợi nấm không xuyên qua tế bào phân sinh, cũng không qua rễ cây có nốt sần cây họ Đậu [27]. Thể sợi nấm sau khi xâm nhập vào rễ có thể sinh trưởng nhanh len lỏi giữa các tế bào rồi mới vào trong tế bào, cũng có thể phát triển giữa các tế bào, nhưng không hình thành lưới Hartig như nấm ngoại sinh. Sợi nấm sau khi vào trong tế bào liền bao quanh lấy nguyên sinh chất, phân nhánh hình thành vòi hút, nhưng màng tế bào vẫn bao lấy nhánh sợi nấm và nguyên sinh chất. Cuộc sống sợi nấm trong tế bào rất ngắn chỉ mấy ngày đến mười mấy ngày là bị phân giải, nhưng tế bào nhiễm nấm vẫn sống và bị nhánh sợi nấm khác tạo ra sợi nhánh mới. Cho nên, trong tế bào ta phát hiện cả sợi nhánh, cả xác sợi nấm. Có trường hợp sợi nấm xâm nhập vào tầng vỏ ngoài không phân nhánh. Chúng chỉ phân nhánh ở tầng giữa và tầng trong của vỏ cây. Nhánh sợi nấm trong tế bào rất nhỏ chỉ 0,5 – 1,0µm. Chỗ phân nhánh là nơi trao đổi chất dinh dưỡng giữa nấm và rễ. Bởi vì ở gốc nhánh sợi nấm người ta phát hiện nhiều hạt đường và giọt dầu, và trong dịch bào phát hiện có muối photphorat và một số hợp chất hòa tan. Nhánh phân ra bị phân giải lại cung cấp cho rễ cây sử dụng [5].  Nấm rễ ngoại cộng sinh: Theo quan điểm bệnh lý học, quá trình hình thành nấm cộng sinh cũng như quá trình xâm nhiễm, chia ra các giai đoạn: tiếp xúc, xâm nhập, ủ bệnh hay phát triển và xuất hiện. Trong đất hình thành nhiều bào tử nấm, sợi nấm, xâm nhiễm vào bộ rễ, làm cho rễ cây ngừng sinh trưởng, phình lên và hình thành bao nấm, 9 CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU sau đó sợi nấm phân nhánh thành bao. Sợi nấm xâm nhiễm vào tầng vỏ của rễ dinh dưỡng, giữa tế bào hình thành mạng lưới gọi là lưới Hartig [5]. Trong một số trường hợp chúng không theo trình tự như trên mà hình thành ngay lưới Hartig rồi hình thành bào sợi nấm, hoặc có lúc không hình thành cả 2 loại này. Phần lớn nấm rễ chỉ cộng sinh với rễ dinh dưỡng. Từ hạt nảy mầm ra lá thật, cây con sinh trưởng nhờ dinh dưỡng được cung cấp từ hạt, còn sau đó cây cần dinh dưỡng trong đất. Giai đoạn này nếu bộ rễ tiếp xúc với nấm rễ, thì sự hình thành rễ - nấm rất nhanh và rất có lợi. Cho nên những năm gần đây, nhiều người dùng phương pháp cấy nấm vào cùng lúc cây con mới nảy mầm ra lá thật và có thể đạt được mục đích rễ - nấm hóa cây mầm. 1.2.6. Tính chuyên hóa của khu hệ nấm cộng sinh vùng rễ Do sự chọn lọc và tính thích nghi khác nhau, phạm vi tồn tại cây chủ khác nhau. Một số loài nấm hình thành trên nhiều loài cây. Một số loài chỉ cộng sinh trên một vài loài cây. Chengming (1995) chia những loài sống trên 5 loại cây gồm 10 loài thuộc Amanita, Cantharenlus; những loài sống trên 2 – 3 loại cây như Boletus, Ramaria; chỉ sống trên 1 loại cây có Suillus, Russula. Có loài như Pisolithus tinctorius sống trên 72 loài cây, nấm mục rỗng mọc đất (Cenococcum geophyllum) mọc trên 75 loài cây hạt trần. Cùng một loài nấm nhưng chủng khác nhau cũng có tính chuyên hóa khác nhau. Nấm Lactarius deliciosus có 3 kiểu chuyên hóa khác nhau (thông, vân sam, lãnh sam). Có loài phạm vi cây chủ rất hẹp là nấm bụng màu trắng (Hymenogaster albellus) chỉ có ở cây Bạch đàn. Ngoài việc chọn loài cây thích hợp, các loài cây khác nhau có lúc cũng chọn nấm thích hợp. Một số loài cây có thể dùng nhiều loài nấm khác nhau để hình thành rễ nấm, thậm chí trên rễ của một loài cây có rất nhiều loài nấm cộng sinh. Có nhiều loài cây như Thông 5 lá, Dương, Bạch đàn không có tính chuyên 10