Tài liệu Luận văn thạc sĩ bảo vệ thực vật chẩn đoán và đặc điểm sinh học của begomovirus hại ớt

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VN HÀ THỊ THỦY CHẨN ĐOÁN VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BEGOMOVIRUS HẠI ỚT LUẬN VĂN THẠC SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VN HÀ THỊ THỦY CHẨN ĐOÁN VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BEGOMOVIRUS HẠI ỚT Ngành : Bảo vệ thực vật Mã sốố : 8.62.01.12 Người hướng dẫẫn khoa học : PGS. TS. Hà Viếốt Cường HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng Tác giả Hà Thị Thủy i năm 2018 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Hà Viết Cường, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, khuyến khích em nỗ lực trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viê ̣n nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm. Em xin gửi lời cảm ơn tới các bà con nông dân tại nhiều nơi đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng Tác giả Hà Thị Thủy ii năm 2018 MỤC L Lời cam đoan......................................................................................................................i Lời cảm ơn........................................................................................................................ii Mục lục.............................................................................................................................iii Danh mục từ viết tắt.........................................................................................................vi Danh mục bảng..............................................................................................................viii Danh mục hình..................................................................................................................x Trích yếu luận văn............................................................................................................xi Thesis abstract................................................................................................................xiii Phần 1. Mở đầu................................................................................................................1 1.1. Giới thiệu...............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu..............................................................................................2 1.2.1. Mục tiêu.................................................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu..................................................................................................................2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn..........................................................2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học...................................................................................................2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn...................................................................................................3 Phần 2. Tổng quan tài liệu..............................................................................................4 2.1. Khái quát chung về ớt............................................................................................4 2.1.1. Nguồn gốc.............................................................................................................4 2.1.2. Phân loại................................................................................................................4 2.1.3. Đặc điểm thực vật học...........................................................................................5 2.1.4. Tình hình sản xuất ớt trên thế giới.........................................................................5 2.1.5. Tình hình sản xuất ớt tại Việt Nam.......................................................................7 2.1.6. Lợi ích đối với sức khỏe........................................................................................7 2.2. Những nghiên cứu trong nước và thế giới.............................................................8 2.2.1. Một số nghiên cứu về virus hại ớt.........................................................................8 2.2.2. Một số begomovirus hại cà chua.........................................................................10 2.2.3. Một số begomovirus hại ớt..................................................................................11 2.3. Đặc điểm chung của Begomovirus......................................................................13 2.3.1. Lịch sử phát hiện, phân bố và đa dạng của begomovirus....................................13 iii 2.3.2. Đặc điểm hình thái...............................................................................................14 2.3.3. Cấu trúc genome của begomovirus.....................................................................14 2.3.4. Cấu trúc của phân tử DNA-A..............................................................................15 2.3.5. Cấu trúc của phân tử DNA-B..............................................................................16 2.3.6. Đặc điểm của vùng IR.........................................................................................17 2.3.7. Phân loại các begomovirus..................................................................................17 2.3.8. Tái sinh của begomovirus....................................................................................18 2.3.9. Tương tác và tái tổ hơp của begomovirus...........................................................19 2.3.10. Triệu chứng bệnh do begomovirus......................................................................20 2.3.11. Môi giới truyền bê ̣nh và sự lan truyền................................................................20 2.3.12. Thiệt hại kinh tế do begomovirus gây ra.............................................................21 2.3.13. Phòng chống........................................................................................................22 2.4. Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR.............................................................................22 2.5. Kĩ thuật Agroinoculation.....................................................................................23 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.............................................................25 3.1. Địa điểm nghiên cứu...........................................................................................25 3.2. Thời gian nghiên cứu...........................................................................................25 3.3. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu............................................................................25 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................25 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................25 3.4. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................27 3.5. Phương pháp........................................................................................................28 3.5.1. Điều tra đồng ruộng.............................................................................................28 3.5.2. Thu mẫu...............................................................................................................28 3.5.3. Chiết DNA tổng số..............................................................................................28 3.5.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction).....................................................29 3.5.5. Điện di sản phẩm PCR........................................................................................29 3.5.6. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens khả biến (competent cells)............................30 3.5.7. Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến............................................................30 3.5.8. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng phương pháp xung điện.......................................................................................30 3.5.9. Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation.......................................31 iv 3.5.10. Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn......................................................................32 3.5.11. Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng Elisa...............................................................33 3.5.12. Giải trình tự.........................................................................................................35 Phần 4. Kết quả và thả̉ luu ̣n.......................................................................................36 4.1. Điều tra bệnh hại ớt tại Hà Nội và phụ cận.........................................................36 4.1.1. Triệu chứng bệnh virus trên ớt............................................................................36 4.1.2. Điều tra bệnh virus trên ớt ở một số địa điểm tại Hà Nội năm 2017...................37 4.2. Phát hiện các virus trên ớt bằng phương pháp Elisa...........................................38 4.2.1. Phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA....................................................39 4.2.2. Phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA..............................................48 4.2.3. Phát hiện CMV (Cucumber mosaic virus) trên ớt bằng DAS-ELISA................55 4.2.4. Phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA..............................................61 4.3. Phát hiê ̣n các Begomovirus và PepYLCVNV b̉ng PCR...................................67 4.3.1. Phát hiện begomovirus bằng PCR dùng mồi chung............................................67 4.3.2. Phát hiện TYLCKaV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu...........................................69 4.3.3. Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu......................................71 4.4. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV Được bằng lây nhiềm nhân tạo .............................................................................................................................73 4.4.1. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV được bằng lây nhiềm nhân tạo dùng kĩ thuật Agroinoculation.............................................................................73 4.4.2. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn................................................................................................................77 4.5 Đă ̣c trưng phân tử của PepYLCVNV mẫu VNP1500.........................................78 4.5.1. Hoàn thiện giải trình tự mẫu PepYLCVNV (VNP1500)....................................78 Phần 5. Kết luận và kiến nghị.......................................................................................86 5.1. Kết luận...............................................................................................................86 5.2. Kiến nghị.............................................................................................................87 Tài liệu tham khảo...........................................................................................................88 Y v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu A. tumefaciens AS ATP Bb CP CTAB ddNTP DNA Dntp dsDNA E. coli EDTA ICTV IR Kb LB ORF PCR RCA RE Rep RNA Rnase SDS SsDNA TAE Taq Vir β- ME ChiVMV CMV PMMoV PepMoV PVMV PepYMV TMV TYLCTHV TYLCVs Từ viết tắt Agrobacterium tumefaciens Acetosyringone Adenosine triphosphate Base pair Capsid protein Cetryl Ammonium Bromide Dideoxynucleoside triphosphate Deoxyribonucleic acid Deoxynucleoside triphosphate Double strand DNA Escherichia coli Ethylene diamine tetra acetic acid International Committee on Taxonomy of Viruses Itergenic region Kilo base Luria and Bertani Open reading frame Polymerase Chain Reaction Rolling circle amplification Restriction enzyme Replication protein Ribonucleic acid Ribonuclease Sodium Dodecyl Sulphate Singe strand DNA Tris – acetate – EDTA Thermus aquatic Virulence region Beta- Mercaptoethanol Chilli veinal mottle virus Cucumber mosaic virus Pepper mild mottle virus Pepper mottle virus Pepper veinal mottle virus Pepper yellow mottle virus Tobacco mosaic virus Tomato yellow leaf curl Thailand virus Tomato yellow leaf curl viruses vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Diện tích, năng suất ớt trên thế giới trong giai đoạn 2010-2012.................6 Bảng 1.2. Sản lượng ớt ở một số nước trên thế giới trong giai đoạn 2010-2012 .....................................................................................................................6 Bảng 3.1. Các kít ELISA phát hiện virus ớt (Viện DSMZ).......................................33 Bảng 4.1. Triệu chứng virus trên ớt...........................................................................36 Bảng 4.2. Mức độ xuất hiện các triệu chứng virus trên ớt ở các giai đoạn khác nhau ở một số địa điểm tại Hà Nội năm 2017...........................................38 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA.............................41 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................42 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................43 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................44 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................45 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................46 Bảng 4.3. Kết quả phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp)...................47 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA.......................49 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............50 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............51 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............52 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............53 Bảng 4.4. Kết quả phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).............54 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA...................................56 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).........................57 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).........................59 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).........................60 Bảng 4.5. Kết quả phát hiện CMV trên ớt bằng DAS-ELISA (tiếp).........................60 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA.......................62 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp).............63 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp).............64 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp).............65 Bảng 4.6. Kết quả phát hiện Begomovirus trên ớt bằng TAS-ELISA (tiếp).............66 vii Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt và cà chua bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1...............................................................68 Bảng 4.8. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt và cà chua bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TYKa-A–F1/R1............................................................................70 Bảng 4.11. Lây nhiễm nhân tạo bằng agroinoculation DNA-A của PepYLCVNV mẫu VNP1500 trên cây cà chua và thuốc lá cảnh N. benthamiana..............................................................................................75 Bảng 4.12. Lây nhiễm nhân tạo bằng agroinoculation DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV mẫu VNP1500 trên cà chua và thuốc lá N. benthamiana...............................................................................................76 Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra các mẫu cà pháo nguồn bằng PCR sử dụng că ̣p mồi đặc hiệu VNP93–A-F1/VNP1500–A-R1 và cặp mồi 1500–B– F1/R2.........................................................................................................77 Bảng 4.14. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên ớt, cà chua và mô ̣t số cây chỉ thị..............................................................................................77 Bảng 4.15. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào XL1 Blue bằng xung điện...................................................................................................78 Bảng 4.16. Kết quả giải trình tự bổ sung mẫu PepYLCVNV (VNP1500).................79 Bảng 4.17. Đặc điểm phân tử DNA-A của mẫu PepYLCVNV VNP1500..................83 Bảng 4.18. Đặc điểm phân tử DNA-B của mẫu PepYLCVNV VNP1500..................84 viii DANH MỤC HÌN Hình 2.1. Hình thái phân tử geminiviruses................................................................14 Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus................................15 Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của begomovirus..............................................16 Hình 2.4. Cấu trúc phân tử DNA-B của begomovirus...............................................16 Hình 2.5. Khối u do A.tumerfaciens gây ra...............................................................24 Hình 2.6. Quá trình lây nhiễm của Ti Plasmid trong A.tumerfaciens vào cây ...................................................................................................................24 Hình 3.1. Nuôi bọ phấn trong lồng cách lilồng cách li chế tạo từ chai cocacola...........32 Hình 4.1. Các triệu chứng bệnh virus trên ớt tại các điểm điều tra...........................36 Hình 4.2. Kiểm tra Elisa trên các mẫu ớt thu thập từ trước và các mẫu mới thu thập trong năm 2017............................................................................39 Hình 4.3. Phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA..........................................48 Hình 4.4. Phát hiện Tobamovirus trên ớt bằng DAS-ELISA....................................54 Hình 4.5. Triê ̣u chứng của CMV trên ớt (Cerkauskas, 2004)....................................55 Hình 4.6. Phát hiện TYLCVs trên ớt bằng DAS-ELISA...........................................67 Hình 4.7. Triê ̣u chứng begomovirus trên ớt..............................................................69 Hình 4.8. Hình ảnh PCR kiểm tra các mẫu ớt và cà chua bằng PCR sử dụng că ̣p mồi BegoA-For1 và BegoA-Rev1......................................................69 Hình 4.9. PCR phát hiện TYLCKaV trên mẫu ớt và cà chua (dương tính với begomovirus) bằng că ̣p mồi đặc hiệu TYKa-A–F1/R1...............................71 Hình 4.10. PCR phát hiện PepYLCVNV trên mẫu ớt và cà chua (dương tính với begomovirus) bằng că ̣p mồi đặc hiệu DNA-A (VNP93–AF1/VNP1500–A-R1) và đặc hiệu DNA-B (VNP1500–B–F1/R2).............72 Hình 4.11. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường LB-Agar sau 3 ngày nuôi cấy ...................................................................................................................74 Hình 4.12. Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mô lá................................75 Hình 4.13. Số khuẩn lạc thu được sau lần biến nạp đầu tiên.......................................79 Hình 4.14. Tổ chức bộ gen của mẫu PepYLCVNV VNP1500...................................84 ix Hình 4.15. Vùng chung CR của mẫu PepYLCVNV VNP1500 với cấu trúc thứ cấp chứa điểm khởi đầu tái bản bộ gen được chỉ rõ..................................84 TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hà Thị Thủy Tên Luận văn: Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của Begomovirus hại ớt Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 8.62.01.12 Tên cơ sở đà̉ tạ̉: Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam; Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Mục đích nghiên cứu Xác định sự có mặt của Begomovirus trên các mẫu ớt thu thập tại miền Bắc, xác định đặc điểm sinh học và đánh giá tính gây bệnh của virus. Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh virus hại ớt được thu thập tại các vùng trồng ớt tại Hà Nội, sau đó được làm khô bằng hạt silicagelkít. Các mẫu được kiểm tra ELISA phát hiện virus bằng các kit ELISA do Viện DSMZ của Đức cung cấp. Các mẫu có triệu chứng đặc trưng được kiểm tra PCR. Sử dụng cặp mồi chung BegoA Rev/For phát hiện begomovirus. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/VNP1500-A-R1 và VNP1500-BF1/VNP1500-B-R2 để phát hiện đặc hiệu PepYLCVN. Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinoculation) và lây nhiễm bằng bọ phấn nhằm đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVN trên cà chua và một số cây chỉ thị. Kết quả chính và kết luận 1. Đã điều tra và thu thập các mẫu bệnh begomovirus trên ớt tại Hà Nô ̣i năm 2017 với các loại hình triê ̣u chứng . Dạng triệu chứng điển hình là triệu chứng khảm lá. Tỉ lệ nhiễm virus cao nhất tại huyện Thạch Thất trong giai đoạn quả chín đạt 43,2%. 2. Đã kiểm tra ELISA trên 81 mẫu ớt thu thâ ̣p khắp cả nước, phát hiện 2 mẫu phản ứng dương tính ChiVMV, 5 mẫu phản ứng dương tính PMMoV, 1 mẫu phản ứng dương tính PepMoV, 1 mẫu phản ứng dương tính PepYMV và 1 mẫu phản ứng dương tính TYLCVs. x 3. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus bằng cặp mồi chung BegoA-F1 và BegoA-R1 trên 14 ớt và 4 mẫu cà chua. Kết quả kiểm tra cho thấy có 6 mẫu ớt và 4 mẫu cà chua có phản ứng dương. 4. Kiểm tra PCR phát hiện TYLCKaV bằng că ̣p mồi đă ̣c hiê ̣u TYKa-A–F1/R1 trên 5 ớt và 4 mẫu cà chua. Kết quả kiểm tra cho thấy có 1 mẫu cà chua có phản ứng dương. 5. Kiểm tra PCR phát hiện PepYLCVNV bằng că ̣p mồi đặc hiệu VNP93–AF1/VNP1500–A-R1 và cặp mồi 1500–B–F1/R2 trên 9 mẫu (5 ớt và 4 mẫu cà chua). Kết quả kiểm tra cho thấy có 4 mẫu ớt và 4 mẫu cà chua có phản ứng dương với cả DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV. 6. Đã giải trình tự bổ sung và nhận được trình tự đầy đủ bộ gen mẫu PepYLCVNV VNP1500 từ 2 cấu trúc xâm nhiễm. Phân tích bộ gen cho thấy bộ gen của virus trên cấu trúc xâm nhiễm là hoàn chỉnh, đảm bảo sự xâm nhiễm hệ thống của virus trong cây. Kết hợp kết quả lây nhiễm nhân tạo và phân tích trình tự đã gợi ý có lẽ xuất hiện đột biến của virus trên cấu trúc xâm nhiễm liên quan cảm ứng triệu chứng. xi THESIS ABSTRACT Master candidate: Ha Thi Thuy Thesis title: Diagnosis and Biological Characteristics of Pepper Begomovirus Maj̉r: Plant Protection C̉de: 60.62.01.12 Educatỉnal ̉rganizatỉn: Vietnam Academy of Agriculture Sciences (VAAS); Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Materials and Meth̉ds: The viral symptomatic samples were collected on the pepper fields in Ha Noi, then were dried by silicagel. The samples were tested for the presence of viruses by ELISA using kits provided by the DSMZ Institute (Germany). PCR tests to detect begomovirus were carried out using universal and specific primers. An agro-inoculation method using Agrobacterium tumerfaciens cells harboring infectious structures and infected with Bemisia tabaci of PepYLCVNV were used to investigate the pathogenicity of these two geminivirses on pepper. Main findings and c̉nclusỉns: 1. Investigated and collected begomovirus-infected samples of peppers in Hanoi in 2017 with different types of symptoms. The most typical symptom was leaf mosaic. The highest infection rate in Thach That district during ripening was 43.2%. 2. ELISA tests on 81 symptomatic pepper samples showed 2 samples positive to ChiVMV, 5 samples positive to PMMoV infection, 1 samples positive to PepMoV infection, 1 samples positive to PepYMV, 1 samples positive to PepYMV and 1 samples positive to TYLCVs. 3. PCR detection of begomovirus was carried out with begoA-F1 and BegoA-R1 primers on 14 peppers and 4 tomato samples. The results showed that there were 6 samples of pepper and 4 samples of tomato were positive to begomovirus. 4. PCR detection of TYLCKaV by specific primers TYKa-A-F1/R1 on 5 samples of pepper and 4 tomato samples. The results showed that there were 1 tomato sample were positive to TYLCKaV. 5. PCR detection of PepYLCVNV with specific primers VNP93-AF1/VNP1500-A-R1 and 1500-B-F1/R2 primers on 9 samples (5 chili and 4 xii tomato samples). Four samples of pepper and 4 tomato samples showed that positive results for both DNA-A and B-DNA of PepYLCVNV. 6. Extra sequencing and complete sequencing of the PepYLCVNV VNP1500 genome from two infecting structures were performed. Genome analysis reveals that the viral genome on the infectious structure is complete, ensuring systematic viral infection in the plant. Incorporation of the results of infection and sequencing suggested the emergence of mutations in the invasive structure associated with symptomatic induction. xiii PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. GIỚI THIỆU Họ Geminiviridae là họ virus thực vật lớn nhất, có khoảng 200 loài (Fauquet and Stanley, 2005). Trong đó begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng. Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) có hình thái phân tử dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb (Fauquet and Stanley, 2005). Các begomovirus không truyền qua hạt giống nhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Picó at al., 1996). Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh xoăn vàng lá cà chua–một bệnh được xem là nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới. Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lá hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ có thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử (Moriones and Navas-Castillo, 2000). Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có nhiều cây dại (Green et al., 2001; Ha, 2007). Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có mặt của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứng bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Học viện nông nghiệp Việt Nam) thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV). Do begomovirus hại ớt là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu. 1 Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:“Chẩn đ̉án và đặc điểm sinh học của Beg̉m̉virus hại ớt ” 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu (i) Xác định được sự có mặt của begomovirus trên các mẫu ớt thu thập được tại Hà Nội; (ii) Đánh giá được tính gây bệnh của một begomovirus mới phân lập từ ớt và cà chua là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) bằng lây nhiễm nhân tạo. 1.2.2. Yêu cầu 1. Điều tra đồng ruộng bệnh virus trên ớt - Điều tra bệnh; thu thâ ̣p mới các mẫu cây ớt biểu hiê ̣n triê ̣u chứng. 2. Phát hiện các virus trên ớt bằng ELISA 3. Phát hiện các begomovirus và PepYLCVNV bằng PCR - Phát hiện begomovirus bằng PCR dùng mồi chung - Phát hiện TYLCKaV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu - Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu 4. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng agroinoculation sử dụng cấu trúc xâm nhiễm đã được xây dựng từ trước và bọ phấn 5. Đặc trưng phân tử của PepYLCVNV - Hoàn thiện giải trình tự bộ gen mẫu virus PepYLCVNV VNP1500 được xây dựng trên cấu trúc xâm nhiễm 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN 1.3.1. Ý nghĩa kh̉a học - Đã xác định được thành phần virus nói chung và begomovirus nói riêng trên số lượng lớn mẫu ớt thu thập tại miền Bắc. - Đã cung cấp thông tin và định hướng nghiên cứu tiếp về tính gây bệnh của một begomovirus phân lập từ ớt và cà chua là Pepper yellow leaf curl VietNam virus (PepYLCVNV). 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Xác định sự phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của begomovirus đã xác định được. - Góp phần đề xuất biện pháp phòng trừ bệnh do begomovirus hại ớt một cách hợp lý, an toàn với con người và môi trường. - Cung cấp dẫn liệu cho đào tạo và giảng dạy về phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của PepYLCVNV. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ỚT 2.1.1. Nguồn gốc Ớt đã là một phần trong ẩm thực của loài người ít nhất là 7500 năm trước Công nguyên. Có những bằng chứng khảo cổ ở các khu vực ở tây nam Ecuador cho thấy ớt đã được thuần hóa hơn 6000 năm về trước (Perry et al., 2007), và là một trong những loại cây trồng đầu tiên ở châu Mỹ. Người ta cho rằng ớt đã được thuần hóa ít nhất năm lần bởi những cư dân tiền sử ở các khu vực khác nhau của Nam và Bắc Mỹ, từ Peru ở phía nam đến Mexico ở phía bắc và một số vùng của các bang Colorado và New Mexico bởi các dân tộc Pueblo Cổ đại (Bosland, 1996). Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO, 2012) cây ớt được xem là một trong những cây trồng quan trọng của vùng nhiệt đới. Diện tích trồng ớt thế giới vào khoảng 1.914.685 ha cho mục đích lấy quả tươi với sản lượng 31.171.567 tấn. Các nước nhập khẩu và xuất khẩu quan trọng nhất bao gồm: Ấn Độ, Mexico, Trung Quốc, Pakistan, Thổ Nhĩ Kỳ (Than et al., 2008). Cây ớt có mặt ở nước ta, được du nhập từ Trung Quốc, Ấn Độ. Diện tích phân bố khá rộng rãi, tập trung ở miền Bắc và miền Trung, ở miền Nam diện tích trồng ớt còn phân tán. 2.1.2. Phun l̉ại Chi Capsicum có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Hoa Kỳ và đã có mặt khắp thế giới bao gồm các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, và các vùng khí hậu ôn đới (Pickersgill, 1997). Theo Bosland and Votava (2000) cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae), chi Capsicum. Hiện nay có ít nhất 25 loài hoang dại được biết đến và 5 loài được thuần hóa bao gồm: - Capsicum frutescens, bao gồm cả ớt Tabasco - Capsicum chinense, bao gồm cả loài ớt cay nhất như naga, habanero và Scotch bonnet - Capsicum pubescens, bao gồm cả ớt rocoto Nam Mỹ 4 - Capsicum baccatum, bao gồm cả ớt cay Nam Mỹ - Capsicum annuum, bao gồm nhiều loại khác nhau như Bell pepper, Paprika, Cayenne, Jalapexnos và Chiltepin. Các loài cây trồng trong chi Capsicum thường được phân biệt theo đặc điểm hoa và quả (Lipert et al., 1996). 2.1.3. Đặc điểm thực vật học Theo Mai Thị Phương Anh (1999): - Thân: ớt là cây thân bụi 2 lá mầm, thân thường mọc th̉ng, đôi khi có thể gặp các dạng (giống) có thân bụi, nhiều cành, chiều cao trung bình 0,5-1,5m, có thể là cây hàng năm hoặc cây lâu năm nhưng thường được gieo trồng là cây hàng năm. - Rễ: Ban đầu ớt có rễ cọc phát triển mạnh với rất nhiều rễ phụ, rễ cọc chính đứt, một hệ rễ chùm phát triển mạnh, vì thế nhiều khi lầm tưởng ớt có hệ rễ chùm. - Lá: Thường ớt có lá đơn mọc xoắn trên thân chính, lá có nhiều hình dạng khác nhau, nhưng thường gặp nhất là dạng lá móc, trứng ngược, mép lá hình răng cưa. Mặt trên lá phụ thuộc vào các loài khác nhau, một số có mùi thơm. Lá thường mỏng có kích thước trung bình 1,5-12,0cm x 0,5-7,5cm. - Quả: Thuộc loại quả mọng có rất nhiều hạt với nhiều thịt quả nhăn và chia làm 2 ngăn. Các giống khác nhau có kích thước quả, hình dạng, độ nhọn, màu sắc, độ cay (hăng) và độ mềm của thịt quả rất khác nhau. Quả chưa chín có màu xanh, khi chín chuyển thành màu vàng, hoặc đỏ. - Hạt: Hạt có dạng thận và màu vàng rơm, chỉ có hạt của C.pubescens có màu đen. Hạt có chiều dài khoảng 3-5mm. Một gam hạt ớt cay có khoảng 220 hạt. 2.1.4. Tình hình sản xuất ớt trên thế giới Tr̉ng các cuy họ Cà S̉lanaceae, ớt được c̉i là cuy có tầm quan trọng thứ hai chỉ sau cuy cà chua (Ỷ̉n et al., 1990). Chuu Á được c̉i là vùng đất gia vị của thế giới, được biết đến bởi nguồn gốc xuất xứ, nơi sản xuất, tiêu thụ và xuất khẩu hàng đầu của hầu hết các l̉ại gia vị. Trên thế giới có kh̉ảng 70 l̉ài cuy trồng làm gia vị thì đều được trồng chủ yếu ở Chuu Á nổi tiếng với các nước như Ấn Độ, Việt Nam, Trung Quốc, Ind̉nesia, Thái Lan, v.v… (Ch̉mchal̉w, 2001). 5