Tài liệu Luận văn sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của một số loài thực vật định hướng nghiên cứu nguyên liệu có tiềm năng chống tăng đường huyết trên mô hình động vật​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ----------------------------- DƯƠNG MINH TRÍ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU NGUYÊN LIỆU CÓ TIỀM NĂNG CHỐNG TĂNG ĐƯỜNG HUYẾT TRÊN MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 60420201 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN NGỌC HỒNG TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2017 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. Nguyễn Ngọc Hồng (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP. HCM ngày 11 tháng 11 năm 2017 Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ) TT 1 2 3 4 5 Họ và tên PGS TS. Nguyễn Tiến Thắng TS. Nguyễn Hoàng Dũng TS. Võ Đình Lệ Tâm PGS TS. Thái Văn Nam TS. Nguyễn Thị Hai Chức danh Hội đồng Chủ tịch Phản biện 1 Phản biện 2 Ủy viên Ủy viên, Thư ký Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa (nếu có). Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV PGS TS. Nguyễn Tiến Thắng TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc lập – Tự do – Hạnh phúc TP. HCM, ngày 30 tháng 08 năm 2017 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: DƯƠNG MINH TRÍ Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 27/04/1993 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 1541880013 I- Tên đề tài: SÀNG LỌC HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU NGUYÊN LIỆU CÓ TIỀM NĂNG CHỐNG TĂNG ĐƯỜNG HUYẾT TRÊN MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT II- Nhiệm vụ và nội dung: Nhiệm vụ: Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và hướng đến khả năng làm ổn định đường huyết của một số loài cây mọc phổ biến ở Việt Nam góp phần hỗ trợ điều trị tiểu đường. Nội dung: Sàng lọc khả năng chống oxy hóa của một số loài thực vật và nghiên cứu khả năng ổn định đường huyết của các mẫu có hoạt tính chống oxy hóa tốt trên mô hình chuột tăng đường huyết cấp tính và chuột tiểu đường gây ra bởi Streptozocin. III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2017 IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/8/2017 V- Cán bộ hướng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HỒNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký) TS. Nguyễn Ngọc Hồng KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký) i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên thực hiện Luận văn Dƣơng Minh Trí ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Ngọc Hồng, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 11 năm 2017 Dƣơng Minh Trí iii TÓM TẮT Mục đích của nghiên cứu này là để đánh giá hoạt tính chống oxy h a và tiềm năng chống tăng đường huyết của cao chiết ethanol từ 20 loài thực vật ở Việt Nam Hoạt tính chống oxy h a được phân tích qua phương pháp qu t gốc tự do diphenyl- -picryl-hydrazyl và FRAP ( erric Reducing quả cho thấy PPH - ntioxidant Power Kết mẫu cao chiết ethanol từ lá chôm chôm Nephelium lappaceum) và lá ổi (Psidium guajava c hoạt tính chống oxy h a cao nhất với giá trị I phương pháp PPH lần lượt là lần so với đối chứng ascor ic acid I 50 trong g ml và 4,14 µg/ml, cao hơn 2,51 lần và 50 52 = 2,73 g ml Trong phương pháp R P giá trị chống oxy h a của cao chiết lá chôm chôm là chiết lá ổi là 5794  42 μmol e2+ L giá trị này ằng 0 μmol e2+/L và cao lần và 0 51 lần so với ascorbic acid (11390 ± 98 μmol Fe2+ L Hàm lượng polyphenol tổng c trong lá chôm chôm và lá ổi lần lượt là 3  8,45 mg GAE/g và 150,47  6,49 mg G E g khô Hàm lượng flavonoid tổng số của hai loại cao chiết lá chôm chôm và lá ổi lần lượt là  0,81 mg RE/g và 97,45  1,03 mg RE/g khô Sự ảnh hưởng của cao chiết với liều thử 00-200mg.kg-1 ở mô hình chuột tăng đường huyết cấp tính cho thấy chuột uống cao chiết ethanol từ lá chôm chôm và lá ổi ở nồng độ 150mg.kg-1 thể trọng c nồng độ glucose trong máu giảm đáng kể so với nh m chứng tăng đường huyết và tương đương với nh m chứng trắng. ao chiết ethanol từ mẫu cây này được tiếp tục thử nghiệm trên mô hình chuột tiểu đường type gây ra ởi streptozocin STZ và kết quả cho thấy vào ngày thứ của quá trình theo dõi cao chiết ethanol từ lá chôm chôm c hoạt tính tốt hơn cao chiết từ lá ổi và tương đương với nh m được sử dụng thuốc trị tiểu đường glibenclamide (10mg.kg-1 thể trọng . Những kết quả thu được trong nghiên cứu này chứng minh lá chôm chôm và lá ổi là nguồn của chất chống oxy h a tự nhiên c tiềm năng làm ổn định đường huyết ở liều dùng phù hợp. iv ABSTRACT The aim of the present study was to evaluate antioxidant activity and the antihyperglycemic potential of ethanolic extract from 20 plant species in Vietnam. Antioxidant activity were tested on the 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay and the ferric reducing/antioxidant power assay (FRAP). The results revealed that the ethanolic extract of rambutan (Nephelium lappaceum) leaves and guava (Psidium guajava) leaves have high antioxidant activities which showed an IC50 values in the DPPH method respectively of 6,85 µg/ml and 4,14 µg/ml were 2,51 and 1,52 fold higher that of ascorbic acid (IC50 = 2,73 µg/ml). In FRAP method, the antioxidant values were 6428 ± μmol e2+/L of rambutan leaves extract and 5794  42 μmol Fe2+/L of 1mg/ml concentration of sample of guava leaves extract, this values by 0.56 fold and 0.51 fold than ascorbic acid 390 9 μmol e2+/L). Total phenolic content of rambutan and guava leaves with values were 168,73  8,45 mg GAE/g of dry weight and 150,47  6,49 mg GAE/g of dry weight. Total flavonoid content of rambutan and guava leaves with values were 74,45  0,81 mg RE/g of dry weight and 97,45  1,03 mg RE/g of dry weight. Effect of oral glucose tolerance of ethanol extract of leaves was examined with dose of 100-200mg.kg-1 based on the body weight, the result showed that the mice were fed ethanol extract of Nephelium lappaceum and Psidium guajava leaves with dose of 150mg.kg-1 body weight decreased serum glucose levels significantly when compared to high glucose control group and was equivalently when compared with that of normal mice control group. The ethanol extracts from two samples were tested in type 1 streptozocin induced diabetic mice. The results showed that on day 21 of the test, ethanol extracts from rambutan leaves has a higher activity than guava leaves and was comparable to that used in the glibenclamide group (10mg.kg1 body weight). The results obtained in the present study demonstrated that Nephelium lappaceum leaves and Psidium guajava leaves are potential sources of v natural antioxidants, possibly be used for improvement of blood glucose at right dosage. vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii TÓM TẮT ................................................................................................................ iii ABSTRACT .............................................................................................................. iv MỤC LỤC ................................................................................................................. vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... x DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... xi DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................xii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................. 2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 2 Ý nghĩa khoa học ....................................................................................................... 3 Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................................... 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 4 1.1. Gốc tự do và sự stress oxy hóa .......................................................................... 4 1.1.1. Khái niệm về gốc tự do ................................................................................... 4 1.1.2. Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tiểu đƣờng .................................... 4 1.2. Hợp chất polyphenol và mối liên hệ với bệnh tiểu đƣờng .............................. 5 1.2.1. Ảnh hƣởng của các chất polyphenol lên sự hấp thụ glucose trong ruột .... 6 1.2.2. Ảnh hƣởng của polyphenol lên chức năng tế bào β tuyến tụy .................... 7 1.2.3. Ảnh hƣởng của các polyphenol lên chức năng gan để duy trì cân bằng glucose nội mô ............................................................................................................ 8 1.3. Sơ lƣợc về bệnh tiểu đƣờng ............................................................................ 10 1.3.1. Phân loại ......................................................................................................... 10 1.3.2. Các yếu tố nguy cơ dẫn đến bệnh tiểu đƣờng............................................. 12 1.3.3. Xét nghiệm hóa sinh chẩn đoán bệnh tiểu đƣờng ...................................... 15 1.3.4. Chế độ dùng thuốc trong điều trị tiểu đƣờng ............................................. 16 vii 1.3.5. Nghiên cứu điều trị tiểu đƣờng bằng thảo dƣợc trên thế giới .................. 18 1.3.6. Nghiên cứu điều trị tiểu đƣờng từ nguồn thực vật tại Việt Nam.............. 19 1.3.7. Mô hình chuột tiểu đƣờng ............................................................................ 21 1.3.7.1. Mô hình bệnh lý trên động vật thực nghiệm ........................................... 21 1.3.7.2. Mô hình tiểu đƣờng type 1 ........................................................................ 22 1.3.8. Tổng quan về một số cây trong nghiên cứu ................................................ 25 1.3.8.1. Cây xoài ....................................................................................................... 25 1.3.8.2. Cây chôm chôm .......................................................................................... 27 1.3.8.3. Cây núc nác ................................................................................................. 29 1.3.8.4. Cây ổi ........................................................................................................... 30 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 33 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ........................................................... 33 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu....................................................................................... 33 2.2.1. Nguyên liệu thực vật ..................................................................................... 33 2.2.2. Đối tƣợng động vật ........................................................................................ 36 2.2.3. Dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng cho thí nghiệm........................................ 36 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 37 2.3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu, tách chiết và thu nhận cao chiết ....................... 39 2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa ....................................... 39 2.3.2.1. Mô hình quét gốc tự do DPPH .................................................................. 39 2.3.2.2. Mô hình FRAP............................................................................................ 41 2.3.3. Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số ......... 42 2.3.3.1. Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số .......................................... 43 2.3.3.2. Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid tổng số............................................. 43 2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống tăng đƣờng huyết ...................... 44 2.3.4.1. Xác định độc tính cấp ................................................................................ 44 2.3.4.2. Khảo sát trên mô hình in vivo chuột tăng đƣờng huyết cấp tính .......... 45 2.3.4.3. Khảo sát trên mô hình in vivo chuột gây tiểu đƣờng bởi streptozocin.. 47 2.3.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng glucose trong máu .......................................... 50 viii 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................ 51 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 52 3.1. Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hóa .................................................... 52 3.1.1. Mô hình quét gốc tự do DPPH ..................................................................... 52 3.1.2. Mô hình FRAP............................................................................................... 56 3.2. Kết quả định lƣợng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số ...................... 60 3.2.1. Kết quả định lƣợng polyphenol tổng số ...................................................... 60 3.2.2. Kết quả định lƣợng flavonoid tổng số ......................................................... 61 3.3. Kết quả đánh giá khả năng chống tăng đƣờng huyết ................................... 63 3.3.1. Xác định độc tính cấp ................................................................................... 63 3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng điều hòa đƣờng huyết của các mẫu cao chiết trên mô hình chuột tăng đƣờng huyết cấp tính .................................................... 63 3.3.2.1. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây Mangifera indica ...................................................................................................... 64 3.3.2.2. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây Nephelium lappaceum.............................................................................................. 65 3.3.2.3. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây Psidium guajava ...................................................................................................................... 67 3.3.2.4. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây Oroxylum indicum ..................................................................................................................... 69 3.3.2.5. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm 4 mẫu cao chiết từ 4 cây có hoạt tính chống oxy hóa tốt .................................................................................... 71 3.3.3. Kết quả tạo mô hình chuột tiểu đƣờng type 1 bằng STZ .......................... 73 3.3.4. Kết quả thử nghiệm khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mô hình chuột tiểu đƣờng type 1.................................................................................. 74 3.3.4.1. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mô hình chuột tiểu đƣờng type 1 vào ngày thứ nhất .......................................................... 74 3.3.4.2. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mô hình chuột tiểu đƣờng type 1 vào ngày thứ 7 ................................................................ 75 ix 3.3.4.3. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mô hình chuột tiểu đƣờng type 1 vào ngày thứ 14 .............................................................. 76 3.3.4.4. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mô hình chuột tiểu đƣờng type 1 vào ngày thứ 21 .............................................................. 77 3.3.4.5. Kết quả khả năng ổn định đƣờng huyết của các mẫu trên mô hình chuột tiểu đƣờng type 1 vào các thời điểm trong 21 ngày thử nghiệm .............. 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 85 PHỤ LỤC x DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AGEs: advanced glycation endproducts. DMSO: Dimethyl sulfoxyde. DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl. EGCG: Epigallocatechin gallate. FRAP: ferric reducing/antioxidant power. G6PD: glucose-6 phosphate dehydrogenase G6Pase: glucose-6-phosphatase GAE: Gallic acid equivalent đương lượng gam acid gallic . GSH-Px: glutathione peroxidase. HbA1c: Glycosylated hemoglobin. IC50: half maximal inhibitory concentration . LDL: low density lipoprotein. NF-κB: nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells. NO: nitric oxide. RE: Rutin equivalent đương lượng gam rutin . RNS: Reactive Nitrogen Species. ROS: Reactive Oxygen Species. SOD: superoxide dismutase. STZ: streptozocin hay streptozotocin. TPTZ: 2,4,6-tripyridyl-s-triazin. PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase. xi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Tên 0 loài thực vật sử dụng trong nghiên cứu........................................ 33 Bảng 3.1. Hoạt tính qu t gốc tự do PPH của 0 mẫu cây...................................... 53 Bảng 3.2. Khả năng chống oxy h a thông qua mô hình R P của 0 mẫu cây...... 58 Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol tổng số của cây c hoạt tính chống oxy h a cao nhất ............................................................................................................................ 61 Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol tổng số của cây c hoạt tính chống oxy h a cao tốt nhất ....................................................................................................................... 62 Bảng 3.5. Nồng độ glucose máu và % ức chế sự tăng đường huyết ở các liều dùng khác nhau của các nh m thử nghiệm ........................................................................ 72 Bảng 3.6. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm........................... 74 Bảng 3.7. Nồng độ glucose máu mmol L của các nh m tại các thời điểm ........... 79 xii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của streptozocin ............................................................ 23 Hình 1.2. Sơ đồ tác động của Streptozocin .............................................................. 24 Hình 1.3. Cây xoài .................................................................................................... 26 Hình 1.4. Lá và quả chôm chôm............................................................................... 27 Hình 1.5. Lá và quả cây núc nác .............................................................................. 29 Hình 1.6. Lá và quả ổi .............................................................................................. 31 Hình 2.1. Hình ảnh 20 mẫu cây sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 36 Hình 2.2. Chuột bạch dùng cho thí nghiệm .............................................................. 36 Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ...................................................................... 38 Hình 2.4. Phản ứng giải thích sự thay dổi màu sắc của DPPH ................................ 39 Hình 2.5. Màu sắc của dung dịch DPPH chứa cao chiết có nồng độ từ cao→thấp . 40 Hình 2.6. Nhóm thử nghiệm gồm 6 con chuột ......................................................... 44 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử hoạt tính của mẫu trên chuột tăng đường huyết cấp tính ............................................................................................................ 45 Hình 2.8. Chuột được cho uống dung dịch glucose 2g.kg-1 thể trọng ...................... 47 Hình 2.9. Sơ đồ tạo mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 1 ............................. 47 Hình 2.10. Chuột được tiêm STZ vào phúc mạc bụng ............................................. 48 Hình 2.11. Sơ đồ thử nghiệm hoạt tính của mẫu trên chuột tiểu đường type 1 ....... 49 Hình 2.12. Chuột được cho uống cao chiết .............................................................. 50 Hình 2.13. Máy đo nồng độ glucose trong máu ....................................................... 50 Hình 3.1. Hoạt tính loại gốc tự do DPPH ở nồng độ 1mg/ml của dịch chiết ethanol từ 4 mẫu ..................................................................................................................... 55 Hình 3.2. Hoạt tính loại gốc tự do thông qua giá trị IC50 của dịch chiết ethanol từ 4 mẫu ............................................................................................................................ 56 Hình 3.3. Đường chuẩn Fe2+-TPTZ .......................................................................... 57 Hình 3.4. Khả năng chống oxy hóa in vitro trên mô hình FRAP của 4 mẫu có hoạt tính tốt nhất ............................................................................................................... 59 Hình 3.5. Đường chuẩn acid gallic ........................................................................... 60 xiii Hình 3.6 Đường chuẩn rutin .................................................................................... 62 Hình 3.7. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá xoài so sánh với các nh m đối chứng .................................................................................................. 64 Hình 3.8. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá chôm chôm so sánh với nh m đối chứng .......................................................................................... 66 Hình 3.9. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá ổi so sánh với nh m đối chứng. ........................................................................................................ 68 Hình 3.10. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá núc nác so sánh với nh m đối chứng .................................................................................................. 70 Hình 3.11. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm vào ngày thứ nhất ............................................................................................................................ 75 Hình 3.12. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm vào ngày thứ 7 .... ................................................................................................................................... 76 Hình 3.13. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm vào ngày thứ 14 .. ................................................................................................................................... 77 Hình 3.14. Nồng độ glucose máu của các nhóm chuột thử nghiệm vào ngày thứ 21 .. ................................................................................................................................... 78 1 MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Gốc tự do được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của cơ thể khi ở mức độ cao dẫn đến sự rối loạn và mất cân bằng của các quá trình sinh hóa và là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh tật ođ việc tìm ra những hợp chất chống oxy hóa có khả năng ức chế các gốc tự do hoặc các quá trình gián tiếp sinh ra gốc tự do là điều cần thiết. hất chống oxy h a c thể c nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc được tổng hợp h a học Tuy nhiên những hợp chất c nguồn gốc từ thiên nhiên c nhiều lợi thế hơn so với những hợp chất tổng hợp do hợp chất tổng hợp gây ra những phản ứng phụ như viêm gan và ung thư Bên cạnh đ những hợp chất c nguồn gốc từ thiên nhiên đôi khi tác dụng dược lý tốt hơn Kahkonen et al., 1999). Vấn đề liên quan đến đường huyết luôn được mọi người quan tâm đến vì lượng đường trong máu dù tăng hay giảm đi so với mức ình thường thì sẽ tác động không tốt đến sức khỏe. Chứng tăng đường huyết ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh tiểu đường ác th i quen trong ăn uống không điều độ, chế độ dinh dưỡng quá nhiều đồ ngọt đồ béo hoặc uống những loại thức uống có cồn như rượu, bia và ít hoạt động thể chất cũng ảnh hưởng đến lượng đường trong máu và dần dần sẽ hình thành bệnh tiểu đường. Với nhu cầu điều trị và dự phòng tiểu đường, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã được các tập đoàn các công ty dược phẩm nghiên cứu và phát triển. Tuy nhiên các thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là giải pháp tối ưu đối với quốc gia đang phát triển như Việt Nam nguyên nhân là giá thành điều trị cao, thuốc tổng hợp có phản ứng phụ với tác dụng không mong muốn. Từ trước đến nay, Việt Nam chưa thực sự quan tâm đúng mức đến nền y học tự cường, mang bản sắc rất riêng của dân tộc ta Đ chính là nền y học bản địa gắn với sử dụng cây thuốc Nam. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, một tiềm năng lớn về tài nguyên cây dược liệu n i riêng và tài nguyên dược liệu (thực vật động vật, khoáng 2 vật n i chung Điều này thể hiện ở sự đa dạng về chủng loại cây dược liệu (trong số hơn 000 loài thực vật Việt Nam thì có hơn 5.000 loài cho công dụng làm thuốc), phân bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý và hiếm trên thế giới. Với nguồn dược liệu phong phú và đa dạng, thế nhưng hàng năm Việt Nam vẫn phải tiêu tốn rất nhiều tiền vào việc nhập khẩu nguồn nguyên liệu từ nước ngoài. Nguy hiểm hơn các nguồn nguyên liệu nhập khẩu cũng chưa phải là nguồn nguyên liệu sạch, nguyên liệu đảm bảo cho sản xuất thuốc có nguồn gốc thảo dược. Thuốc có nguồn gốc thảo dược đang được các nước quan tâm và phát triển với ưu điểm là nguồn dược liệu sẵn có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng phụ dễ được cộng đồng chấp nhận đặc biệt là các nước kém phát triển và đang phát triển. Mục tiêu nghiên cứu Để đánh giá hiệu quả của các thuốc có nguồn gốc thảo dược thì cần phải có những nghiên cứu đánh giá tác dụng in vitro và dược lý an đầu Đề tài được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa in vitro và hướng đến khả năng làm ổn định đường huyết trên mô hình in vivo trên chuột tăng đường huyết cấp tính và chuột tiểu đường của một số loài cây mọc phổ biến ở Việt Nam. Đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm sẽ góp phần lớn trong việc sản xuất ra các chế phẩm ngăn ngừa và chữa trị nhiều loại bệnh tật cho con người trong đ c bệnh tiểu đường. Nội dung nghiên cứu - Sàng lọc khả năng chống oxy hóa của một số loài thực vật thông qua hai phương pháp phổ biến là DPPH và FRAP. - Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số của một số cây có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. - Khảo sát khả năng ổn định đường huyết của các cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất trên mô hình in vivo chuột tăng đường huyết cấp tính. 3 - Đánh giá hoạt tính làm ổn định đường huyết của các cao chiết trên mô hình chuột bị tiểu đường gây ra bởi streptozocin. Ý nghĩa khoa học Sàng lọc hoạt tính chống oxy h a của 0 mẫu cao chiết ethanol của 0 loại cây từ đ chọn ra một số mẫu cây c hoạt tính tốt nhất định hướng cho việc nghiên cứu nguyên liệu thực vật c tiềm năng ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị ệnh tiểu đường là một trong các con đường tiếp cận hợp lý Nghiên cứu hoạt tính làm ổn định đường huyết của lá ổi trên mô hình chuột ị tiểu đường ởi STZ mà chưa c tài liệu nào trong nước công ố trước đ . Nghiên cứu hoạt tính chống oxy h a chống tăng dường huyết cấp tính và làm ổn định đường huyết trên mô hình chuột ị tiểu đường ởi STZ của cao chiết ethanol lá chôm chôm mà chưa c tài liệu trong và ngoài nước công ố trước đ Ý nghĩa thực tiễn ung cấp thông tin về sự so sánh hoạt tính chống oxy h a và hoạt tính chống tăng đường huyết của một số loài cây Những nghiên cứu về hoạt tính chống oxy h a mạnh và khả năng làm ổn định đường huyết trên mô hình chuột ị đái tháo đường là cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn và ứng dụng tạo chế phẩm c tác dụng ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị ệnh tiểu đường trên người. 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.Gốc tự do và sự stress oxy hóa 1.1.1.Khái niệm về gốc tự do ác “gốc tự do” hay n i chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (Reactive Oxygen Species - ROS và Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử húng được chia thành hai nh m lớn là các “gốc tự do” và các dẫn xuất không phải gốc tự do hoặc nguyên tử c một hoặc nhiều điện tử độc thân ác “gốc tự do” là các phân tử ác dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn hydroperoxyde nitroperoxyde là tiền chất của các gốc tự do 1.1.2.Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tiểu đƣờng ơ thể con người liên tục tiếp xúc với các nguồn sản sinh ra gốc tự do ROS RNS Để đáp ứng với điều đ cơ thể có hệ thống chống oxy hóa nội sinh hoặc được bổ sung chất chống oxy hóa ngoại sinh từ chế độ ăn uống làm trung hòa các gốc tự do và giữ cân bằng nội môi của cơ thể. Sự mất cân bằng giữa gốc tự do và chất chống oxy hóa dẫn đến tạo ra một tình trạng gọi là ''stress oxy hóa'' mà một trong các kết quả của nó là sự phát triển bệnh tiểu đường. Stress oxy h a đ ng vai trò quan trọng trong sự phát triển của các biến chứng mạch máu trong bệnh tiểu đường đặc biệt là bệnh tiểu đường type 2 (Pham-Huy, 2008). ROS mức độ cao trong bệnh tiểu đường có thể do sự gia tăng sản xuất các enzyme catalase, superoxide dismutase (SOD) và glutathione peroxidase (GSHPx) làm cho các mô nhạy cảm với stress oxy hóa dẫn đến sự phát triển của các biến chứng bệnh tiểu đường (Lipinski, 2001). Sự biểu hiện quá mức của các gốc tự do gây hại cho các protein tế bào, lipid màng và nucleic acid và cuối cùng gây ra sự chết của các tế bào Tăng đường huyết cũng được cho là thúc đẩy quá trình peroxy hóa lipid của LDL (low density lipoprotein) bằng con đường superoxide. Sự tương tác của glucose với protein dẫn đến sự hình thành của hợp chất glycate hóa bền vững AGEs (advanced glycation