Tài liệu Luận văn nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn bacillus thuringiensis phân lập tại thái nguyên​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------------------------------- TRẦN CHUNG DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------------------------------- TRẦN CHUNG DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Trương Phúc Hưng Cơ quan: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Trương Phúc Hưng giáo viên hướng dẫn khoa học, người đã tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các thí nghiệm trong phạm vi luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Di truyền vi sinh vật viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong quá trình tôi thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo, các đồng nghiệp, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Học viên Trần Chung Dũng LỜI CAM ĐOAN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii Tôi xin cam đoan đã thực hiện toàn bộ công trình này dưới sự hướng dẫn của TS. Trương Phúc Hưng. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong một luận văn nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2019 Tác giả Trần Chung Dũng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iii STT Viết tắt Viết đầy đủ 1 Bp Base pair 2 DNA Deoxyribonucleotide a xid 3 E.coli Escherichia coli 4 kDa Kilo Dalton MỤC LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iv Lời cảm ơn...................................................................................................................... i Lời cam đoan ..................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh mục các bảng ......................................................................................... vii Danh mục các hình ......................................................................................... viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu. .................................................................................................. 2 2.1. Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thurigiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao tại Thái Nguyên........................................................................................................ 2 2.2. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis...................................................................................................... 2 2.3. Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập. .......................................................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................................. 2 3.1. Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn B. thuringiensis từ các mẫu đất thu tại Thái Nguyên có khả năng diệt sâu. .................... 2 3.2. Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao. .............. 2 3.3. Tối ưu điều kiện nuôi cấy và tạo chế phẩm sinh học từ loài vi khuẩn B. thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao....................................................................... 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 I. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) ................................................... 3 1.1. Lược sử nghiên cứu và ứng dụng Bt ...................................................................... 3 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt trên thế giới ....................................... 3 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt tại Việt Nam ...................................... 5 1.2. Đại cương về vi khuẩn Bt ....................................................................................... 6 1.2.1. Sự phân bố của Bt ............................................................................................... 6 1.2.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn v 1.2.3. Phân biệt B.thuringiensis với các loài khác trong chi Bacillus......................... 8 1.2.4. Đặc điểm sinh hóa ............................................................................................... 9 1.2.5. Phân loại Bt........................................................................................................ 10 1.2.6. Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var. kurstaki ................................... 11 1.2.7. Tính chất nuôi cấy ............................................................................................. 12 1.3.1. Độc tố của Bt ..................................................................................................... 13 1.3.2. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng ......................................... 15 II. Tổng quan về sâu tơ (côn trùng thử nghiệm) ............................................. 17 III. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis .......... 19 3.1. Phương pháp lên men bề mặt ................................................................. 20 3.2. Lên men chìm .......................................................................................... 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 23 2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 23 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 23 2.1.2. Hóa chất và thiết bị............................................................................................ 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 24 2.2.1. Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis ................................................. 24 2.2.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch ..................................................................................................................... 25 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học................................................................. 25 2.2.4. Phương pháp lên men vi sinh vật.................................................................. 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 28 3.1. Phân lập, tuyển chọn và phân loại các chủng Bacillus thuringiensis ................. 28 3.1.1. Phân lập các chủng B. thuringiensis.................................................................. 28 3.1.2. Sự đa dạng hình thái tinh thể các chủng B. thuringiensis phân lập................. 29 3.1.3. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh.......................................................... 30 3.2. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng Bacillus thiringiensis phân lập .................................................................................................... 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vi 3.3. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt trong phòng thí nghiệm ............................... 32 3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng của chủng TC2.5 .......... 32 3.3.2. Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm .......................................................................... 34 3.3.3. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ của chế phẩm Bt – TC2.5 ........................... 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus .................. 8 Bảng 1.2. Phân loại độc tố Cry1 ở Bt var. kurstaki và côn trùng đích....................... 11 Bảng 3.1. Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis ...... 25 Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ sau 3 ngày thử nghiệm .......................... 27 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của chủng TC 2.5 ............... 28 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng TC 2.5 ..................... 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1A. Chủng Bt mang bào tử và tinh thể. ............................................................ 7 Hình 1.1B. Hình dạng tế vào và tinh thể một số dưới loài Bt . .................................... 7 Hình 1.2. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H......... 10 Hình 1.3. Cấu trúc không gian 3 chiều của protein Cry 2Aa..................................... 13 Hình 1.4. Cơ chế tác động của độc tố.......................................................................... 15 Hình 1.5. Chu kỳ sống của sâu tơ Plutella xylostella ................................................. 16 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus thuringiensi ............................ 24 Hình 3.2. Hình ảnh tế bào sinh dưỡng, bào tử và tinh thể của vi khuẩn Bt quan sát dưới kính hiển vi quang học ............................................................................... 26 Hình 3.3. Hình ảnh ngưng kết của chủng TC 2.5 (2) và chủng đối chứng 4D4(1) ... 27 Hình 3.4. Chế phẩm Bt dạng bột sau khi lên men. ..................................................... 30 Hình 3.5. Thử hoạt tính diệt sâu tơ với chế phẩm Bt-TC2.5...................................... 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nhu cầu lương thực toàn cầu tăng nhanh trong những năm gần đây và được dự đoán tiếp tục tăng do sự gia tăng của dân số thế giới. Một trong những giải pháp cho vấn đề lương thực toàn cầu là cải thiện năng suất mùa màng bằng cách cải tạo giống và tối ưu hoá các quy trình sản xuất trong nông nghiệp. Tuy nhiên, sản lượng nông nghiệp hàng năm giảm mạnh do sự tàn phá của sâu hại với uớc tính khoảng 16-18%. Thực tế thiệt hại có thể giảm bớt bằng cách kiểm soát côn trùng gây hại. Trong các phương pháp kiểm soát dịch hại thì thuốc trừ sâu hoá học được sử dụng rộng rãi và phổ biến để bảo vệ mùa màng. Tuy nhiên, có rất nhiều vấn đề liên quan đến việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học trong nông nghiệp. Thuốc trừ sâu hoá học không chỉ làm giảm hiệu quả đối với côn trùng đích do hình thành sự kháng thuốc mà còn tiêu diệt cả những loại côn trùng có ích, qua đó làm mất cân bằng sinh thái. Hơn nữa, việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học trong thời gian dài dẫn đến chất độc tích lũy trong môi trường từ đó tác động xấu đến môi trường cũng như sức khỏe con người. Do đó, vấn đề cấp thiết là tìm ra một loại thuốc trừ sâu mới thân thiện với môi trường và không ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis được kỳ vọng có thể thay thế hoặc sử dụng bổ sung cho thuốc hoá học bởi những ưu điểm của chúng như có tính đặc hiệu cao đối với côn trùng đích, an toàn và đặc biệt thân thiện với môi trường. Bacillus thuringiensis là vi khuẩn đất, hiếu khí gram dương, mang các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả tiêu diệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh. Thái Nguyên là một tỉnh miền núi trung du, nằm trong vùng trung du và miền núi Bắc Bộ, có diện tích tự nhiên là 3.562,82 km2 . Với địa hình thấp dần từ núi cao xuống núi thấp, trung du, đồng bằng theo hướng Bắc – Nam làm cho 2 khí hậu Thái Nguyên chia thành ba vùng rõ rệt trong mùa đông: vùng lạnh, vùng lạnh vừa, vùng ấm và hai mùa rõ rệt mùa mưa và mùa khô. Do ảnh hưởng của địa hình, đất đai ở Thái Nguyên được phân hoá đa dạng. Kết cấu của đất, điều kiện khí hậu và đặc điểm về địa hình đã tạo ra cho Thái Nguyên sự đa dạng về thực vật, động vật, cũng như các loài vi sinh vật trong đó có vi khuẩn B.thuringiensis. Theo một số nghiên cứu thì Thái Nguyên[4] là một trong những tỉnh có sự phân bố của nhiều chủng Bt có hoạt tính diệt sâu cao. Chính vì vậy, việc tìm kiếm, sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính cao tại Thái Nguyên từ đó sản xuất chế phẩm Bt là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài“ Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên”. 2. Mục tiêu nghiên cứu. 2.1. Tuyển chọn được một số chủng Bacillus thurigiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao tại Thái Nguyên. 2.2. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis. 2.3. Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập. 3. Nội dung nghiên cứu. 3.1. Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn B. thuringiensis từ các mẫu đất thu tại Thái Nguyên có khả năng diệt sâu. 3.2. Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao. 3.3. Tối ưu điều kiện nuôi cấy và tạo chế phẩm sinh học từ loài vi khuẩn B. thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) 1.1. Lược sử nghiên cứu và ứng dụng Bt 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt trên thế giới Thuốc trừ sâu sinh học Bt có tiềm năng để thay thế thuốc trừ sâu hoá học nhờ vào những đặc điểm ưu việt như thân thiện với môi trường và không gây hại cho sức khoẻ con người. Bt được sử dụng một cách có hiệu quả trong nông nghiệp, quản lý rừng, kiểm soát muỗi và diệt sâu hại. Lịch sử của Bt bắt đầu từ khi Loius Pasteur phát hiện ra 1 loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm ông đặt tên là Bacillus bombyces. Năm 1901 nhà khoa học nhật bản Sigetane Ishiwata phát hiện ra Bt khi ông nghiên cứu bệnh dâu tằm, bệnh này gọi là bệnh “sotto”. Ông quan sát thấy tằm chết trước khi vi khuẩn này phát triển và cho rằng tằm chết là do độc tố chứ không phải do nhiễm khuẩn, đó là những quan sát sớm nhất về tính gây bệnh của loài vi khuẩn này và đặt tên là Bacillus sotto. Năm 1911, nhà khoa học Đức, E. Berliner phân lập được loài vi khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải, Anagasta kuehniella. Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức được mang tên Bacillus thuringiensis do được phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringien của Đức [3]. Chế phẩm Bt được sử dụng từ những năm 1950 [26]. Một trong những ứng dụng thành công nhất của chế phẩm Bt kiểm soát Lepidoptera tại những khu rừng phía nam nước Mỹ sử dụng chủng HD-1, hoặc Bt subsp. Kurstaki sản xuất độc tố Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2A. Qua đó, giảm rõ rệt sử dụng thuốc trừ sâu hóa học [26], [27], [28], [29]. Chế phẩm Bt đã được thương mại bởi nhiều công ty để bảo vệ cây trồng trong nông nghiệp tiêu diệt một số sâu hại cây trồng như Lymantria dispar, Choristoneura fumiferana. Giữa những năm 1970 và 1990, B. thuringiensis 4 subsp aizawai mà đặc hiệu đối với ấu trùng của một số loài sâu hại như Spodoptera spp..., và các dưới loài khác như tenebrionis and san-diego [30], có tác dụng tiêu diệt bọ cánh cứng đã được thương mại hoá. Sau đó các chủng Bt với những độc tố khác nhau đã được giới thiệu. Ví dụ: 4 chủng Bt mới có tên LMG P-12592, LMG P-12593, LMG P-12594, and LMG P-13493 được chứng minh là có tác dụng tiêu diệt sâu hại thuộc bộ cánh vảy. Công nghệ sinh học đã phát hiện các chủng vi khuẩn mang gen tái tổ hợp để biểu hiện gen mã hoá protein Cry. Các thao tác về gen đã làm đơn giản hoá và cải thiện kiểm soát sâu hại chính trong nông nghiệp. Như đề cập ở trên, thuốc trừ sâu Bt rất hữu dụng để tiêu diệt côn trùng gây hại. Tuy nhiên nhiều nghiên cứu đã công bố sự phát triển của tính kháng độc tố Bt của Bacillus thuringiensis dẫn đến làm giảm hiệu quả của độc tố Bt đối với côn trùng gây hại. Mặt khác chế phẩm Bt chỉ có tác dụng tiêu diệt sâu sinh sống trên bề mặt cây trồng mà không thể diệt được các loại sâu đục thân. Hơn nữa, chế phẩm Bt dễ bị mất hoạt tính dưới tác động của các yếu tố của môi trường như ánh sáng mặt trời. Chính vì vậy cây trồng chuyển gen đã được phát triển và được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Cây trồng chuyển gen đầu tiên là cây thuốc lá được sản suất trong năm 1983 sử dụng Agrobacterium tumefaciens [31]. Vài năm sau, gen Cry mã hoá protein có tác dụng bảo vệ cây cà chua, thuốc lá và bông được biểu hiện trong cây trồng [32]. Trong năm 1995, Cây cà chua sản xuất protein Cry3A để kiểm soát sâu hại lần đầu tiên được thương mại hóa ở Mỹ. Ngô và bông sản xuất Cry 1A có tác dụng tiêu diệt côn trùng cánh vảy cũng được trồng trong những năm tiếp theo. Sau đó, nhiều loại cây trồng như lúa, ngô, bông, cà chua đã được chuyển gen Cry từ vi khuẩn Bt có tác dụng tiêu diệt nhiều loại côn trùng gây hại quan trọng [32], [33], [34]. Ví dụ, gen của vi khuẩn Bt (Cry1Ac, Cry1Ab, Cry2Ab, and Cry1F) của cây bông được biểu hiện và thương mại hoá tại 11 quốc gia trong năm 2009 [35]. Năm 2009, ngô Bt biểu hiện nhiều gen (Cry1Ab, Cry1F, 5 Cry3Bb1, VIP3A, ry34Ab1/Cry35Ab, Cry2Ab) được thương mại hoá tại nhiều quốc gia. Trong năm 2010, diện tích trồng bông chuyển gen Bt toàn cầu là 19,6 triệu hecta tăng 4,6 triệu hecta so với năm 2009. Bốn quốc gia là Mỹ, Argentina, Ấn Độ và Canada có diện tích trồng cây chuyển gen Bt chiếm 90% diện tích cây trồng chuyển gen Bt toàn cầu [35]. Cuối năm 2013, cây trồng chuyển gen được trồng trên 28,8 triệu hecta. Từ năm 1996 đến 2012, giá trị của cây trồng chuyển gen Bt ước tính đạt 68,9 tỷ USD, chiếm 60% giá trị của cây trồng chuyển gen toàn cầu. Tính riêng năm 2012, giá trị cây trồng chuyển gen đạt khoảng 12 tỷ USD so với 18,7 tỷ USD của giá trị cây trồng chuyển gen toàn cầu [36]. 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt tại Việt Nam Ở Việt Nam thuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được ứng dụng đầu tiên tại Viện Bảo vệ Thực vật năm 1971. Nguyễn Công Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính là những người đầu tiên mở đường nghiên cứu Bt tại Việt Nam. Năm 1973, Viện Sinh vật đã tiến hành sản xuất Bt bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm. Năm 1973-1976, Bt đã được sản xuất chủ yếu trên môi trường đặc với giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác như: bã khô lạc, bột đậu tương, bột cá... Các chế phẩm này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả tốt đẹp. Năm 1975, chế phẩm Bt đã được sản xuất theo phương pháp lên men chìm trong nồi lên men tự tạo tại Phòng Sinh học thực nghiệm thuộc phân viện Viện Khoa học đóng tại thành phố Hồ Chí Minh. Năm 1982, Viện Công nghệ thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men là 5m3.Trong thời kỳ này đã bắt đầu sản xuất và áp dụng thành công chế phẩm Bt đã khiến cho các nghiên cứu Bt mở đầu khá thuận lợi và tốt đẹp [ 3]. Trong những năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt được mở rộng hơn. Hiện đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt như: Viện Công nghệ Sinh 6 học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Công nghiệp Thực phẩm... Tuy vậy cho tới nay ở nước ta vẫn chưa có cơ sở sản xuất thuốc trừ sâu Bt trên quy mô công nghiệp. Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng Bt phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli từ các chủng Bt aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các protein tái tổ hợp thu được đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng. Năm 2000, Võ Thị Thứ và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein cry4A diệt ấu trùng muỗi. Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông [1]. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông...[ 9], [10]. Năm 2003, Phan Đình Pháp và cộng sự đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen, đến năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [11]. 1.2. Đại cương về vi khuẩn Bt 1.2.1. Sự phân bố của Bt Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ phát triển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc…Sự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích. Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng. Bt được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều môi trường khác nhau. Meadows phân chia ra 3 ổ sinh 7 thái phổ biến của Bt trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [13]. Bt dễ dàng phát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng. Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng không nảy mầm và nhân lên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên. 1.2.2. Đặc điểm hình thái Bt là thành viên của nhóm 1, chi Bacillus, là khuẩn gram dương, tế bào dạng hình que, kích thước 3-6μm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Vi khuẩn hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào. Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn...Bt có khả năng sinh nội bào tử để chống lại những điều kiện bất lợi. Quá trình sống của Bt chia thành 3 giai đoạn: * Thể dinh dưỡng: Hình que, 2 đầu tù, thường đứng riêng hoặc có thể tạo thành chuỗi. Sinh sản bằng cách phân chia theo chiều ngang. * Nang bào tử: Tế bào trưởng thành, dạng hình trứng dài, to hơn thể dinh dưỡng, một đầu hình thành bào tử hình tròn (bầu dục), đầu kia hình thành tinh thể. * Bào tử và tinh thể: Nang bào tử phát triển, vỡ ra giải phóng bào tử và tinh thể. Bào tử là dạng sống tiềm ẩn của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hóa chất, áp suất thẩm thấu cao. Màng ngoài là phần sót lại cuả tế bào mẹ, chiếm khoảng 2-10% khối lượng khô của bào tử. Lớp áo bào tử có cấu tạo bởi 3-15 lớp, chủ yếu là protein sừng. Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim, proteinaza, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém với các cation. Dưới áo bào tử là lớp vỏ bào tử.Vỏ bào tử chứa một lượng lớn peptidoglycan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7-10 % dipicolinat canxi không chứa axit teicoic. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20 atm, lượng chưa nước là 70 %. Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinh cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, nang bào tử, bào tử chất và vùng nhân. 8 A B Hình 1.1A. Chủng Bt mang bào tử và tinh thể [24]. a Lông roi b Tế bào chứa bào tử và tinh thể c. Protein tinh thể độc Hình 1.1B. Hình dạng tế vào và tinh thể một số dưới loài Bt) [24]. (A) Tế bào vi khẩn Bt (B) Hình dạng protein tinh thể của B. kustaki (C) Hình dạng protein tinh thể của B.isragensis Tinh thể là một loại protein có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm chiếm khoảng 25% khối lượng khô của tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp, ovan, lập phương hoặc hình dạng không xác định… Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể cùng thoát ra ngoài [3],[13]. 1.2.3. Phân biệt B.thuringiensis với các loài khác trong chi Bacillus Các loài thuộc chi B. cereus gồm B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. megaterium. Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B. weihenstephanensis và B. pseudomycoides [2], [3]. Việc sinh ra protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại bào tử tinh thể. Bảng 1.1. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus Đặc điểm Bc Bt Bmy Ba Bme 9 Nhuộm Gram + (a) + + + + + + + + + Khả năng chuyển động +/- (b) +/- - (c) - +/- Phản ứng khử nitrate + +/- + + - (d) Phân hủy tyrosine + + +/- - (d) +/- Kháng lysozyme + + + + - Phản ứng với lòng đỏ + + + + - Lên men glucose kị khí + + + + - Phản ứng V-P + + + + - Sinh Axít từ mannitol - - - - + Làm tan huyết + + + - (d) - Sinh protein tinh thể - + - - - Phản ứng catalase trứng Chú thích: + (a): 90-100% số chủng phản ứng dương tính +/- (b): 50-50% số chủng phản ứng dương tính - (c): 90-100% số chủng phản ứng âm tính - (d): hầu hết các chủng phản ứng âm tính 1.2.4. Đặc điểm sinh hóa Bt không lên men trên môi trường arrabinoza, xylose, manitol nhưng tạo axit trong môi trường có chứa glucose, có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Không sử dụng axit citric, không khử muối sunphat. Bt có khả năng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ dao động từ 15 – 45ºC. Nhiệt độ tối ưu là 20-30°C. Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của là pH = 7. Bt có khả năng oxy hóa hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden – Meyerhoff – Panas [3]. 10 1.2.5. Phân loại Bt Bt được chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau:  Khả năng hình thành enzyme leucitinase  Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng  Đặc tính huyết thanh học  Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương ứng Cho đến nay, khoá phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp huyết thanh được De Barjac và Bonnefoi đề nghị vào năm 1962, sau đó được Lauren và Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương pháp đáng tin cậy được trung tâm quốc tế Bt đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu Bt trên thế giới từ năm 1982 [2], [3]. Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết. Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Dưới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được. Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác của Bt [3], [13]. Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn chưa phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn. Chính vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng.