Tài liệu Luận văn Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki forest virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã thụ thể neurokinin 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ 1 PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ 1 PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 604270 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) .......................................................... 3 1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm ............ 3 1.1.2 Các hệ thống vector ................................................................................... 4 1.1.3 Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein ....................................... 9 1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) .................. 13 1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV) ...................................................................... 13 1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản ........................................... 14 1.2.3 Tiềm năng ứng dụng khác của hệ vector SFV .......................................... 17 1.2.4 Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV .................................... 19 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................... 23 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 27 2.2.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp................................................. 28 2.2.2 Phương pháp tách chiết plasmit. ........................................................ 29 2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trong quá trình phân lập và nhân dòng ........................................................................................................... 29 2.2.4 Thiết kế mồi. ..................................................................................... 30 2.2.5 Khuếch đại gen nhờ phản ứng PCR (polymerase chain reaction) ....... 31 2.2.6 Cắt ADN sử dụng enzym giới hạn và chống tự nối/đóng vòng. ......... 31 2.2.7 Tạo các đoạn ADN sợi đôi và các linker từ các đoạn oligonucleotit... 32 2.2.8 Phản ứng nối các đoạn ADN ............................................................. 33 2.2.9 Sàng lọc khuẩn lạc............................................................................. 34 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp ................................................... 35 3.2 Cải tiến vector pSFV ............................................................................ 37 3.3 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản........... 43 3.4 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến.......... 46 3.5. Sàng lọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1. ................................ 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận .......................................................................................................... 52 Kiến nghị ........................................................................................................ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 53 Tài liệu tiếng Anh .......................................................................................... 53 Tài liệu tiếng web............................................................................................ 57 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Bốn họ thụ thể chính .............................................................................. 3 Hình 2. Quy trình và thời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện khác nhau.............................................................................. 9 Hình 3. Hệ gen SFV tự nhiên............................................................................ 13 Hình 4. Cấu trúc vector pSFV cơ bản ............................................................... 15 Hình 5. Cấu trúc vector pHelper ....................................................................... 15 Hình 6. Mô hình hoạt động của hệ vector SFV ................................................. 16 Hình 7. Cấu trúc của vector pJET1.2 ................................................................ 23 Hình 8. Vị trí các mồi trên cADN mã cho thụ thể NK1..................................... 25 Hình 9. Trình tự vị trí nhân dòng đa điểm của đoạn O-M7 ............................... 25 Hình 10. Sơ đồ nghiên cứu tạo hệ vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8 ........... 27 Hình 11. Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cải tiến ......................................................................................... 27 Hình 12. Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cơ bản .......................................................................................... 28 Hình 13. Đường cong sinh trưởng của E.coli DH5α ......................................... 35 Hình 14. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mã vỏ capsit của SFV .............. 38 Hình 15. Một phần kết quả giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV ....................................................................................... 39 Hình 16. Vị trí của đoạn chèn thứ 2 trong pHelper............................................ 39 Hình 17. Ảnh điện di đoạn chèn 2 trên gel agarrose 1%. ................................... 40 Hình 18. Ảnh điện di sản phẩm colony PCR kiểm tra khuẩn lạc mang vùng cải biến ............................................................................................................. 41 Hình 19. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M7 ...................... 42 Hình 20. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M8 ...................... 43 Hình 21. Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA polymerase ....................................................................................................... 43 Hình 22. Ảnh điện di sản phẩm cắt pSFV đã mở vòng bằng SmaI .................... 45 Hình 23. Ảnh điện di sản phẩm cắt thu cADN mã cho NK1 từ pJET1.2 ........... 46 Hình 24. Ảnh điện di cADN mã cho NK1 (XhoI/Klenow/ XbaI) sau khi tinh sạch .................................................................................................................. 47 Hình 25. Ảnh điện di mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8.................................... 48 Hình 26. Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1. ........................................................................................................ 50 Hình 27. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809 ................................... 51 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Một số promoter được bổ sung vào các vectơ biểu hiện ......................... 6 Bảng 2. Trình tự, kích thước một số đuôi ái lực .................................................. 8 Bảng 3. Các vị trí cắt của một số protease phổ biến ............................................ 8 Bảng 4. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu.......................................... 24 Bảng 5. Trình tự các oligonucleotit sử dụng trong nghiên cứu .......................... 24 Bảng 6. Phản ứng cắt với enzym giới hạn ......................................................... 31 Bảng 7. Điều kiện của phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN ..................... ..32 Bảng 8. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu bằng ...................... 33 Bảng 9. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu dính ....................... 33 Bảng 10. Điều kiện của phản ứng nối linker ..................................................... 34 Bảng 11. Tần số biến nạp của một số lô tế bào khả biến ................................... 36 Bảng 12. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV ....................................................................................... 38 Bảng 13. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt thu đoạn chèn 2 ..................... 40 Bảng 14. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8 ................................................................. 41 Bảng 15. Quy trình cho phản ứng nhân dòng đoạn cADN mã hóa cho thụ thể NK1 ................................................................................................................. 44 Bảng 16. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV bằng SmaI ............. 44 Bảng 17. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV đã mở vòng bằng XhoI ................................................................................................................. 45 Bảng 18. Thành phần và điều kiện của phản ứng chống tự đóng vòng của pSFV ................................................................................................................ 46 Bảng 19. Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính ........ 47 Bảng 20. Quy trình mở vòng pSFV cải biến và kiểm tra hiệu suất mở vòng .... 48 Bảng 21. Quy trình tạo 1 đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến .................... 49 Bảng 22. Thành phần và điều kiện của phản ứng colony PCR để xác định khuẩn lạc tái tổ hợp pSFV-NK1........................................................................ 50 BẢNG CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) GPCR Thụ thể kết cặp G- protein kb kilobase (= 1000 bp) LB Lubertani Broth NK1 Neurokinin-1 Nu Nucleotit OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) ARN Axit ribonucleic SFV Semliki Forest Virut SOC Super Optimal broth with Catabolite repression TAE Đệm Tris/Axit acetic/EDTA BẢNG VIẾT TẮT CÁC AXIT AMIN Ala (A): alanin Leu (L): leucin Arg (R): arginin Lys (K): lysin Asn (N): asparagin Met (M): methionin Asp (D): axit aspartic Phe (F): phenylalanin Cys (C): cystein Pro (P): prolin Gln (Q): glutamin Ser (S): serin Glu (E): axit glutamic Thr (T): threonin Gly (G): glycin Try (W): trytophan His (H): histidin Tyr (Y): tyrosin Ile (I): isoleucin Val (V): valin Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học MỞ ĐẦU Mặc dù là một ngành mới ra đời nhưng những thành tựu mà công nghệ sinh học phân tử (molecular biotechnology) đã mang lại là rất lớn. Những bước phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học phân tử trong các lĩnh vực như điều chế dược liệu, tạo ra kháng thể đơn dòng, sản xuất vacxin, thành công trong giải trình tự hệ gen người... đã góp phần đắc lực giúp con người trong công cuộc đấu tranh chống bệnh tật và không ngừng cải thiện, nâng cao chất lượng cuộc sống. Ngày nay, biểu hiện protein tái tổ hợp là một phần quan trọng của công nghệ sinh học phân tử với nhiều ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược. Biểu hiện được protein quan tâm trên tế bào động vật và người có thể giúp thiết lập những mô hình điều trị bệnh bằng liệu pháp gen, bao gồm cả điều trị ung thư. Biểu hiện protein tái tổ hợp đặc biệt là các protein thụ thể kết cặp G-protein (Gprotein coupled receptor, viết tắt là GPCR) phục vụ hữu ích cho các nghiên cứu phát triển thuốc, tìm hiểu cấu trúc và chức năng sinh học của các thụ thể, qua đó làm sáng tỏ các con đường truyền tin nội bào. Các protein thụ thể kết cặp Gprotein liên quan trực tiếp đến sự phát sinh nhiều bệnh lý ở người, là “đích” có vai trò quan trọng bậc nhất trong các chương trình sàng lọc các dược chất mới . Các nhà khoa học luôn mong muốn xây dựng được các hệ thống biểu hiện GPCR chủ động ở mức độ cao để dùng cho các nghiên cứu dược lý học phân tử, các thí nghiệm sàng lọc để phát hiện các dược chất mới và phát triển dược phẩm. Trên thế giới, một số hệ thống biểu hiện GPCR tiềm năng đã được thiết lập và thử nghiệm, chẳng hạn như hệ thống dịch mã phi tế bào, các hệ thống biểu hiện ở tế bào nhân sơ (E.coli và Halobacterium salinarum) và nhân chuẩn (nấm men, côn trùng và động vật có vú). Một số GPCR đã được biểu hiện thành công trên các hệ thống này ở mức độ cao từ 1 đến 10 mg/l môi trường nuôi cấy [19]. Trong các hệ thống biểu hiện trên, hệ thống sử dụng hệ vector Semliki Forest Virut (SFV) được ghi nhận là một trong những hệ thống có nhiều đặc điểm ưu việt và giàu tiềm năng ứng dụng [34]. Tuy vậy, hiện nay SFV không 1 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học được thương mại hóa rộng rãi do sự độc quyền sử dụng tại một số phòng thí nghiệm của các hãng dược phẩm (như Roche, Novartis). Với tiềm năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực sinh – y – dược và hệ vector SFV cơ bản được tặng từ GS. Kenneth Lundstrom (hãng dược phẩm Roche, Thụy Sĩ) và nguồn cADN mã hóa cho thụ thể kết cặp G-protein neurokinin 1 (NK1) của người Việt Nam đã được phân lập và nhân dòng thành công từ đề tài ĐT-PTNTĐ.2011-G/04, chúng tôi đề xuất và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam” với mục tiêu lâu dài là xây đựng được hệ thống biểu hiện các protein GPCR có thể được dùng như một công cụ công nghệ sinh học hiệu quả trong các nghiên cứu về sinh học thụ thể ở người Việt Nam sau này, đồng thời phục vụ cho các nghiên cứu dược lý học, sàng lọc và phát triển dược phẩm ở cấp độ phân tử và tế bào. 2 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) 1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm Thụ thể là một lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào, truyền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tin nội bào dẫn đến đáp ứng tế bào giúp cơ thể đáp ứng kịp thời với sự thay đổi của môi trường. Để thực hiện được chức năng đó, thụ thể có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hoặc một số phân tử tín hiệu đặc thù được gọi là phối tử (ligand) và phức hệ “ligand – thụ thể” sẽ khởi đầu một quá trình truyền tin nội bào và gây nên đáp ứng tế bào [3]. Có 4 họ thụ thể chính (Hình 1), trong đó thụ thể kết cặp G-protein (viết tắt là GPCR) là họ protein lớn và đa dạng nhất ở người [33]. Thụ thể kết cặp Gprotein là nhóm thụ thể xuyên màng sinh chất và hoạt động nhờ sự kết cặp với một loại protein hoạt động bởi liên kết với GTP (tức là G-protein). GPCR dẫn truyền tín hiệu cho nhiều dạng phối tử, bao gồm các hóc môn, peptit thần kinh, các chemokine…Trong cơ thể, các GPCR được biểu hiện trên hầu hết các kiểu tế bào và ước tính có đến 1000 GPCR khác nhau ở người [52]. Hình 1. Bốn họ thụ thể chính (nguồn: Gunnar Schulte, 2008 [18]) Sự thay đổi về mật độ cũng như trạng thái hoạt hóa của các GPCR là nguyên nhân trực tiếp gây nên nhiều bệnh cấp tính và mãn tính như tiểu đường, các bệnh tim, trầm cảm, viêm nhiễm và ung thư [31]. Các GPCR là đích tác động chính của hơn 50% các loại dược phẩm đang được sử dụng trong điều trị. 3 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Riêng năm 2001, nhóm thuốc này đem đến doanh thu trên 30 tỷ USD và ước tính con số hiện nay còn cao hơn [25]. Mặc dù GPCR có ý nghĩa thực tiễn to lớn song có hai trở ngại lớn khi sử dụng các GPCR tự nhiên (native) trong các nghiên cứu dược lý học phân tử và sàng lọc thuốc. Thứ nhất là các GPCR tự nhiên thường chỉ được biểu hiện ở mức độ rất thấp (khoảng vài fmol/mg protein màng tế bào) nên thường không sẵn có để dùng cho các thí nghiệm sàng lọc. Thứ hai là trong các mô hình thử nghiệm ở các động vật thí nghiệm, các GPCR thường đồng thời tồn tại ở nhiều dạng phụ (subtype) khác nhau hoặc các dạng biến thể (variants/polymorphic alleles) khác nhau, dẫn đến có thể có những nhận định nhầm về khả năng tương tác của các “thuốc thử” (test compound) với các thụ thể đích nếu đối tượng thí nghiệm lấy mẫu ngẫu nhiên không đại diện cho nhóm phổ biến nhất (các alen kiểu dại). Có thể nhận thấy những khó khăn trên có thể được khắc phục bằng việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền nhằm biểu hiện các GPCR tái tổ hợp của người. Các GPCR tái tổ hợp được biểu hiện ở mức độ cao sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein. Chính bởi vậy, xây dựng các hệ thống biểu hiện GPCR nhanh và hiệu quả là một hướng nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng và mang lại nhiều lợi ích thiết thực trong sàng lọc và nghiên cứu phát triển dược phẩm. 1.1.2 Các hệ thống vector Ý tưởng về vector mang gen ngoại lai bắt nguồn từ các plasmit vi khuẩn. Vector là phân tử ADN có khả năng tự tái bản, tồn tại độc lập trong tế bào chủ và mang các gen cần chuyển. Sau khi vector ngoại lai được đưa vào tế bào chủ, chúng sử dụng bộ máy sao chép của tế bào chủ để nhân bản đến số lượng cần thiết và biểu hiện các gen chúng mang [1]. Đến nay, đã có hơn 2600 vector được chia làm 3 nhóm chính là plasmit (nguồn gốc từ vi khuẩn), phagơ (nguồn gốc từ virut) và nhiễm sắc thể nhân tạo [46]. Chuyển gen vào các tế bào động vật có thể tiến hành bằng cách gây nhiễm các phagơ mang gen tái tổ hợp quan tâm hoặc chuyển gen trực tiếp thông qua plasmit. Có rất nhiều vector biểu hiện trên động vật có vú có nguồn gốc từ virut 4 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học được dùng trong sản xuất protein, liệu pháp gen và phát triển vacxin mới (Phụ lục-1). Hiệu quả biểu hiện gen đặc biệt là trong các tế bào động vật có vú không đơn thuần thể hiện ở tốc độ sản xuất protein mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như các nhân tố kiểm soát phiên mã và dịch mã, quá trình biên tập và sự ổn định của ARN, số lượng bản sao của gen ngoại lai, khả năng gây độc của các protein tái tổ hợp với tế bào cũng như các đặc tính di truyền của tế bào chủ. Giá trị của vector ở chỗ nó được thiết kế sao cho thuận tiện với mục đích sử dụng. Không có hệ vector nào toàn năng cho chuyển gen và biểu hiện mà cần có sự chọn lựa tùy theo mục đích và kích thước của đoạn gen được tạo dòng [66]. Các vector liên tục được cải tiến thuận lợi cho việc chuyển gen, sản xuất và thu hồi protein ngoại lại một cách hiệu quả. Dưới đây tóm lược một số xu hướng cải tiến vector phổ biến và ý nghĩa của chúng. 1.1.2.1 Tạo các vector ADN từ hệ gen virut có bản chất ARN Nhiều virut có hệ gen ARN có tiềm năng phát triển thành các vector biểu hiện mạnh. Các phiên bản vector ADN của virut ARN được thiết lập là một bước cải tiến lớn đem lại các hệ thống biểu hiện mạnh hơn (đặc biệt ở tế bào động vật có vú), dễ dàng thao tác với các enzym và thuận lợi cho quá trình chèn các đoạn ADN ngoại lai đồng thời hạn chế được các bước xử lý trong điều kiện chuyên biệt dành cho ARN và dịch mã ARN có mũ đầu 5’ trong ống nghiệm [6]. Nhiều nghiên cứu xây dựng vector ADN dựa trên hệ vector ARN gốc đã được tiến hành, chẳng hạn như các hệ vector ADN có nguồn gốc từ ARN hệ gen của virut Sindbis [54]. 1.1.2.2 Thêm hoặc cải tiến các vùng điều khiển Những hiểu biết ngày càng sâu sắc về các trình tự mã cho các tín hiệu điều khiển quá trình phiên mã, biên tập mARN và dịch mã có thể thêm vào vector giúp chúng ta chủ động điểu khiển hiệu suất biểu hiện theo ý muốn. Trình tự Kozak GCC(A/G) CCATGG ở động vật có xương sống hoặc trình tự tương đương CAAAACATG ở côn trùng bất cứ khi nào xuất hiện đều làm tăng hiệu suất dịch mã ARN [1]. Ngoài ra, đoạn trình tự này còn khuyến 5 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học khích loại bỏ các vùng có thể ức chế dịch mã nằm ngược dòng ATG hay vùng cấu trúc thứ cấp ở đầu 5’ không mã hóa [15]. Lựa chọn các trình tự tăng cường hay các promoter mạnh có hiệu suất phiên mã cao để thêm hoặc thay thế cho promoter gốc của vector sẽ giúp tắng cường mức độ biểu hiện protein. Bảng 1 trình bày một số promoter có thể thêm vào vector biểu hiện trên động vật có vú. Bảng 1. Một số promoter được bổ sung vào các vector biểu hiện (nguồn: Gerstein, 2001 [15]) Promoter Hệ vector gốc Độ mạnh* EF-1α Nhân tố kéo dài 1α ở người 40-160 CMV Cytomegalovirut 4 RSV Virut LTR rous sarcoma 2 SV40 muộn Gen muộn của virut simian 40 1.1 SV40 sớm Gen sớm của virut simian 40 1 * Promoter SV40 sớm được coi là có độ mạnh là 1để so sánh với các promoter khác. Nhiều tín hiệu kết thúc phiên mã của sinh vật nhân sơ đã được nghiên cứu và được sử dụng rộng rãi trong các vector biểu hiện . Ở sinh vật nhân chuẩn, trình tự ATCAAA(A/T)TAGGAAGA đã được xác định là vùng kết thúc phiên mã của chín gen được nghiên cứu [36]. Đuôi polyadenin – polyA (50-250 phân tử adenyl nối tiếp nhau) thêm sau mARN có vai trò quan trọng giúp ổn định và dịch chuyển ARN từ nhân ra tế bào chất để dịch mã. Mặc dù trình tự polyA cách xa điểm khởi đầu dịch mã nhưng nó có tác dụng tăng cường sự tái hoạt động của ribosom nên trực tiếp làm tăng cường hiệu suất dịch mã [1]. Có một số tín hiệu polyadenin hóa hiệu quả đã được sử dụng trong vector biểu hiện của động vật có vú có nguồn gốc từ gen mã cho hoóc môn tăng trưởng của bò, β- globin chuột, đơn vị phiên mã sớm của SV40 và gen mã cho thymidine kinase của Herpes simplex. Các mã kết thúc (TAG, TAA, TGA) cũng có thể xem xét để thêm vào sau vùng nhân dòng đa điểm nhằm tăng cường sự kết thúc dịch mã trong trường hợp các đoạn cài mã gen ngoại lai thiếu các mã này hoặc để tăng hiệu quả hoạt động của các yếu tố kết thúc dịch mã (RF) [1]. 6 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1.1.2.3 Mở rộng và đa dạng hóa các vùng nhân dòng đa điểm Các phiên bản vector đầu tiên dựa trên trình tự nguyên gốc của plasmit hoặc phage có vùng nhân dòng đa điểm (multiple cloning site-MCS) rất hạn chế. Các vị trí nhân dòng đa điểm là nơi mà các enzym giới hạn nhận biết để cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu tái bản để tránh bị cắt nhầm. Để thuận lợi cho quá trình nhân dòng gen ngoại lai, các vector gốc thường được bổ sung thêm các đoạn nối (linker) mang vị trí nhân dòng đa điểm mới. Các vị trí nhân dòng đa điểm mới phải đảm bảo không có trong trình tự gốc của vector, ưu tiên cho các enzym giới hạn tạo được đầu tương thích với nhiều enzym giới hạn khác [2]. 1.1.2.4 Thêm các vùng gen giúp sàng lọc thể tái tổ hợp Các gen kháng kháng sinh giúp chọn lọc các dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp thường được thêm vào hầu hết các vector. Các gen kháng kháng sinh hay được sử dụng là gen mã họ kháng sinh penicillin (bao gồm ampicillin) tác động ức chế hình thành thành tế bào vi khuẩn hoặc kanamycin, tetracyclin và chloramphenicol ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn thông qua ức chế sinh tổng hợp protein vi khuẩn. Các gen báo cáo (reporter genes) giúp xác định plasmit có chứa đoạn chèn gen ngoại lai mong muốn cũng có thể được cài vào vector. Gen lacZ là một gen báo cáo điển hình, mã hóa cho β-galactosidase có khả năng cắt galactose. Vị trí nhân dòng đa điểm nằm trong gen LacZ và nếu đoạn chèn được cài thành công vào vector sẽ làm bất hoạt β-galactosidase. Chính vì vậy, tế bào chứa vetor có đoạn chèn quan tâm có thể được xác định bằng phương pháp chọn khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trường chứa X-gal [2]. 1.1.2.5 Thêm các đoạn epitop và các vị trí cắt của protease Trong vài năm gần đây, một số epitop peptit và protein rất nhỏ còn được gọi là các đuôi ái lực (affinity-tag) được gắn vào protein tái tổ hợp để tăng cường sản xuất các protein này [22]. Các đuôi ái lực này có đặc điểm chung là: không gây đáp ứng miễn dịch; tinh sạch một bước bằng cột lọc có chất gắn thích hợp; có ảnh hưởng tối thiểu lên cấu trúc và hoạt động sinh học của protein tái tổ 7 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học hợp mà nó gắn vào; có thể loại bỏ dễ dàng và đặc hiệu để sản xuất các protein dạng nguyên gốc; phân tích protein tái tổ hợp đơn giản và chính xác trong quá trình tinh sạch; áp dụng được cho một số loại protein khác nhau. Mỗi loại đuôi ái lực được tinh sạch với một loại đệm đặc hiệu và trong một số trường hợp các đoạn peptit này có thể không cần loại bỏ khỏi protein đích. Các đoạn peptit nhỏ được sử dụng nhiều nhất hiện nay là poly-Arg-tag, FLAG-tag, poly-His-tag, cmyc-tag, S-tag và Strep II-tag. Trình tự của một số đuôi ái lực phổ biến được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2. Trình tự, kích thước một số đuôi ái lực Đuôi ái lực Poly-Arg Poly-His FLAG Strep II c-myc S HAT 3x FLAG Glutathione S-transferase Số axit amin 5–6 2–10 8 8 11 15 19 22 211 Trình tự RRRRR HHHHHH DYKDDDDK WSHPQFEK EQKLISEEDL KETAAAKFERQHMDS KDHLIHNVHKEFHAHAHNK DYKDHDGDYKDHDIDYKDDD DK Protein Kích thước (kDa) 0.80 0.84 1.01 1.06 1.20 1.75 2.31 2.73 26.00 Các trình tự mã hóa cho vị trí cắt của protease cũng thường được thêm vào sau trình tự của các đuôi ái lực để loại bỏ các đuôi ái lực này và thu hồi dạng protein tái tổ hợp nguyên bản. Các vị trí cắt của một số protease được trình bày trong Bảng 3. Các vị trí cắt của protease được lựa chọn sao cho không có vị trí tương tự trong protein tái tổ hợp được quan tâm. Bảng 3. Các vị trí cắt của một số protease phổ biến Protease Factor Xa Enterokinase Thrombin PreScission Trình tự nhận biết IEGR/ DDDDK/ VPR/GS LEVLFQ/GR 8 Tài liệu tham khảo [42] [40] [8] [9] Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1.1.3 Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein Biểu hiện protein tái tổ hợp đã trở thành công cụ chủ chốt trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng trong vòng 20 năm trở lại đây. Mặc dù có nhiều hệ thống biểu hiện đã được phát triển khá tốt cho các protein hòa tan trong tế bào nhân sơ và nhân thật, thì đến nay biểu hiện hiệu suất cao và chủ động các protein xuyên màng tế bào vẫn là một thách thức lớn. Khả năng biểu hiện GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới cấu trúc và hình dạng của các loại protein này. Các GPCR với 7 vùng xuyên màng được tạo ra ở mức độ thấp do yêu cầu cuộn gập, vận chuyển và khả năng gây độc tính đối với tế bào. Hình 2. Quy trình và thời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện khác nhau (nguồn: Nambi, 2003 [43]) Trong phần này, các tính chất cũng như những thành tựu của các hệ thống biểu hiện bao gồm hệ thống dịch mã phi tế bào, các vector nhân sơ và nhân chuẩn sử dụng cho việc biểu hiện mạnh các GPCR tái tổ hợp sẽ được trình bày tóm lược (xem thêm Hình 2). Đa phần trong số chúng đã được sử dụng cho việc 9 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học biểu hiện GPCR tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng: không có một hệ thống nào là toàn năng cho việc biểu hiện mức độ cao tất cả các loại GPCR. 1.1.3.1 Hệ thống dịch mã phi tế bào Hệ thống dịch mã phi tế bào được xây dựng từ dịch thủy phân E.coli hoặc dịch thủy phân tế bào mầm lúa mì. Hệ thống chứa các nhân tố tham gia phản ứng phiên mã và dịch mã đồng thời được cung cấp thêm liên tục các nucleotit, các axit amin và các hợp chất thiết yếu khác [37]. Hệ thống biểu hiện phi tế bào áp dụng để dịch mã nhanh các sản phẩm PCR mã cho các protein hòa tan đơn giản với lượng lớn cỡ hàng chục milligram một cách nhanh chóng (khoảng 4 ngày). Tuy nhiên, hệ thống dịch mã phi tế bào vẫn tồn tại nhiều hạn chế như chi phí cao, quy trình kỹ thuật phức tạp. Sự biểu hiện của các protein xuyên màng lớn, đặc biệt là các GPCR chưa từng thành công bằng sử dụng hệ thống này [26]. 1.1.3.2 Biểu hiện ở tế bào nhân sơ Ưu điểm của biểu hiện trên các tế bào nhân sơ là chi phí rẻ, đơn giản, nhanh (khoảng 11 ngày) và dễ mở rộng quy mô sản xuất các protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, hệ biểu hiện này có nhược điểm cơ bản là không có cơ chế biến đổi sau dịch mã nên các protein phức tạp và lớn, như GPCR, thường được biểu hiện ở dạng không có hoạt tính đầy đủ do không được cuộn gập chính xác hoặc được biến đổi sau dịch mã như dạng tự nhiên [43]. Tuy vậy, đến nay một số GPCR đơn giản đã được biểu hiện bởi hệ thống này nhằm nghiên cứu cấu trúc. E.coli, Halobacterium salinarum, Lactococcus lactis là những chủng vi khuẩn được dùng làm tế bào chủ biểu hiện phổ biến hơn cả. 11 GPCR gắn đuôi His ở đầu C đã được biểu hiện trên E.coli với hiệu suất biểu hiện khác nhau từ 0.1 đến 10% tổng số protein tế bào [24]. Thụ thể muscaricnic M1 và serotonin 5-HT2C đã được tiến hành biểu hiện trên H.salinarum [53]. L. lactis là một vi khuẩn Gram dương thường được sử dụng để biểu hiện các protein màng nhằm xác định dạng prokaryote nguyên gốc [28]. 10 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1.1.3.3 Biểu hiện ở nấm men Ưu điểm của biểu hiện protein tái tổ hợp ở tế bào nấm men là dễ nuôi cấy, thu được sinh khối lớn và có hệ thống biến đổi sau dịch mã gần tương đồng với tế bào động vật. Thụ thể dopamine D1A ở người đã được biểu hiện thành công ở Saccharomyces cerevisiae và được thu hồi nhờ đuôi His6 [4]. Nấm Schizosaccharomyces pombe sở hữu hệ thống truyền tín hiệu giống động vật có vú và có thể glycosyl hóa, thụ thể dopamine D2 ở người đã được biểu hiện trên màng nấm S. pombe với lượng cao gấp ba lần so với biểu hiện trên S.cerevisiae [44]. Nấm Pichia pastoris được đánh giá là chủng nấm biểu hiện gen tốt nhất bởi khả năng biến đổi sau dịch mã bao gồm glycosyl hóa, tạo các liên kết disulfit và phân cắt protein [7]. Khoảng 100 GPCR trong chương trình nghiên cứu hệ gen cấu trúc của MePNet đã được biểu hiện thành công với hiệu suất 95% ở các tế bào P.pastoris. Mặc dù vậy, thành tế bào nấm dày thường được coi là một trong những trở ngại cho hiệu suất tinh sạch và thu hồi protein tái tổ hợp. Bên cạnh đó, quy trình sản xuất GPCR ở nấm men cũng thường tốn nhiều thời gian (khoảng 18 ngày). 1.1.3.4 Biểu hiện ở các tế bào côn trùng Ưu điểm lớn nhất của biểu hiện ở các tế bào côn trùng là tế bào côn trùng sở hữu một lượng lớn các quy trình cải biến giống với động vật có vú. Thêm nữa, các tế bào côn trùng được nuôi cấy trong môi trường bán tổng hợp nên dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất protein mặc dù chi phí cao hơn so với nuôi cấy nấm men và vi khuẩn. Hệ thống vector baculovirut lây nhiễm trên tế bào côn trùng được đánh giá là một trong những hệ thống biểu hiện GPCR hiệu quả nhất [35]. Virut thuộc nhóm này được sử dụng phổ biến hơn cả là virut Autograha californica nuclear polyhedrosis (AcMNPV). AcMNPV có thể lây nhiễm các dòng tế bào côn trùng như Sf9 và Sf21 và nhân lên trong chúng. Nhờ promoter của baculovirut hoạt động mạnh, các gen ngoại lai được biểu hiện mạnh và có thể được tích lũy với 11