Tài liệu Luận văn đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm paecilomyces sp.​

Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ chương trình nào trước đó. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng Sinh viên thực hiện Lê Trần Quang Huy a năm 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời nói đầu tiên em xin chân thành cảm ơn tới Ban Lãnh Đạo, toàn thể quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, trường Đại Học Công Nghệ TPHCM, những người đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là những hành trang vô cùng quý giá, là bước đầu tiên cho em bước vào sự nghiệp sau này trong tương lai. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô TS. Nguyễn Thị Hai người đã hướng dẫn trực tiếp, giúp đỡ, động viên và tận tình quan tâm em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Bên cạnh đó em cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy Thành, người đã tạo điều kiện tốt nhất về máy móc, trang thiết bị, hóa chất cho em trong suốt quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm. Cảm ơn đến các bạn những người đã tận tình giúp đỡ, chia sẽ những kiến thức vô cùng bổ ích cho tôi để tôi có thể hoàn thành đồ án một cách tốt nhất. Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, chỉ dựa vào kiến thức hạn hẹp cùng với thời gian ngắn ngủi nên chắc chắn không tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự góp ý của quý Thầy, Cô để kiến thức của em ngày càng hoàn thiện hơn và rút ra được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập và làm việc sau này. Và lời nói cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ, anh chị và những người thân trong gia đình đã luôn sát cánh, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho con trong suốt quá trình học tập cũng như là hành trang trong tương lai. Kính chúc quý Thầy, Cô và mọi người luôn vui vẻ, hạnh phúc, dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc. Em xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng Sinh viên thực hiện Lê Trần Quang Huy b năm 2015 Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. a 1. Tính cấp thiết của đề tài.................................................................................1 2. Mục đích nghiên cứu .....................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3 1.1 Giới thiệu về tuyến trùng thực vật .............................................................3 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng thực vật ................................................3 1.1.2 Khái quát về tuyến trùng thực vật ...........................................................3 1.1.3 Phân loại tuyến trùng thực vật ...............................................................5 1.1.4 Hình thái, cấu tạo và hình thức sinh sản của tuyến trùng thực vật ........6 1.1.4.1 Về hình thái .........................................................................................6 1.1.4.2 Về cấu tạo ............................................................................................7 1.1.4.3 Hình thức sinh sản ...............................................................................9 1.2 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. ........................................................9 1.2.1 Phân loại .................................................................................................9 1.2.2 Đặc điểm hình thái ................................................................................10 1.2.3 Đặc điểm sinh học.................................................................................11 1.2.4 Vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. .............................11 1.2.5 Tình hình gây hại của tuyến trùng Meloidogyne spp. trên một số loại cây trồng .............................................................................................................12 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây lúa .........................12 1.2.5.2 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà rốt .....................13 1.2.5.3 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây tiêu ........................13 1.2.5.4 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà chua..................13 1.3 Một số biện pháp phòng trừ tuyến trùng thực vật .................................14 1.3.1 Chọn giống ............................................................................................14 1.3.2 Ngăn ngừa .............................................................................................14 1.3.3 Luân canh .............................................................................................14 1.3.4 Biện pháp canh tác ...............................................................................15 1.3.5 Biện pháp hóa học ................................................................................15 1.3.6 Biện pháp vật lý ....................................................................................15 1.3.7 Biện pháp sinh học ................................................................................16 1.4 Giới thiệu về nấm kí sinh Paecilomyces sp. .............................................16 1.4.1 Vị trí phân loại và phân bố của nấm Paecilomyces sp. ........................16 1.4.2 Đặc điểm hình thái, sinh học của nấm Paecilomyces sp. .....................17 1.4.3 Độc tố của nấm Paecilomyces sp. ........................................................18 1.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ... ...............................................................................................................19 1.4.4.1 Ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng ...........................................................19 1.4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng ....................................19 1.4.4.3 Ảnh hưởng của pH môi trường..........................................................20 1.4.4.4 Ảnh hưởng của độ thoáng khí ...........................................................20 1.4.5 Cơ chế tác động của chủng nấm Paecilomyces sp. lên tuyến trùng ....20 ii Đồ án tốt nghiệp 1.4.6 Một số sản phẩm trị tuyến trùng của nấm Paecilomyces sp. vào thực tiễn đời sống .......................................................................................................21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 24 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................24 2.2 Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất .................................................24 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................24 2.2.2 Thiết bị ..................................................................................................24 2.2.3 Hóa chất ................................................................................................25 2.3 Các môi trƣờng đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính, nuôi cấy ............25 2.3.1 Môi trường PDA (Potato D - Glucose Agar) ......................................25 2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương, 2000 - 2001) ..........................25 2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất ................................................26 2.3.4 Môi trường cảm ứng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase: ............................................................................................................26 2.3.5 Môi trường Czapeck - Dox ...................................................................26 2.3.6 Môi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006) .............................27 2.3.7 Môi trường WA khảo sát khả năng kí sinh tuyến trùng trên đĩa petri ..27 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................27 2.4.1 Phương pháp làm phòng ẩm nuôi cấy để quan sát của J.T.Dunean ....27 2.4.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. .......................................................................................................28 2.4.3 Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm Paecilomyces sp. .................................................................................................... ...............................................................................................................28 iii Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.1 Xác định khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải ............................................................................................28 2.4.3.2 Xác định khả năng tổng hợp enzyme protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải ....................................................................................................29 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy Paecilomyces sp. trên môi trường cảm ứng sinh enzyme chitinase .................................................................................................29 2.4.5 Xác định hoạt độ enzyme chitinase bằng phương pháp DNS ...............29 2.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ..................................................................................32 2.4.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ...........................................................................................................32 2.4.6.2 Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các môi trường khác nhau ............................................................................................33 2.4.7 Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ..................................................................................34 2.4.8 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) ...............................................................................................................35 2.4.9 Đánh giá khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. trên đĩa petri ................................................................................................35 2.4.10 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 36 3.1 Đặc điểm hình thái, sinh học của chủng Paecilomyces sp. phân lập được .36 3.2 Tốc độ tăng trưởng của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy.......37 3.3 Khả năng sinh enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trường thạch ...........................................................................................................38 3.4 Hoạt tính chitinase trên môi trường cảm ứng của nấm Paecilomyces sp. ..39 iv Đồ án tốt nghiệp 3.5 Khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trường thạch. ..........................................................................................................40 3.6 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. .....................................................................................................................42 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ....................................................................................................44 3.8 Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đối với nấm Paecilomyces sp. ....................................................................................................47 3.9 Khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. của chủng nấm Paecilomyces sp. đã chọn ..............................................................................49 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 52 4.1 Kết luận ......................................................................................................52 4.2 Kiến nghị ....................................................................................................52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 53 v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PDA: Potato D – Glucose Agar TCA: Trichloacetic Acid WA: Water Agar vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Một số hình dạng của tuyến trùng thực vật .................................................7 Hình 1.2 Cấu tạo của tuyến trùng thực vật .................................................................8 Hình 1.3 Con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. ...................................... 10 Hình 1.4 Vòng đời của tuyến trùng sần rễ............................................................... 12 Hình 1.5 Đặc điểm đại thể và vi thể của nấm Paecilomyces sp .............................. 18 Hình 1.6 Sản phẩm Bio- Nematon có khả năng phòng trừ tuyến trùng .................. 21 Hình 1.7 Chế phẩm TKS – NEMA trị tuyến trùng ................................................. 22 Hình 1.8 Chế phẩm sinh học BIO PEST phòng trừ tuyến trùng ............................. 22 Hình 1.9 Chế phẩm sinh học Palila 500 WP ........................................................... 23 Hình 2.1 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. dưới kính hiển vi soi nổi 40X ...... 24 Hình 2.2 Phản ứng hóa học thuốc thử DNS ........................................................... 30 Hình 2.3 Xác định hoạt tính enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomyces sp ... 32 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Paecilomyces sp. phân lập được................. 36 Hình 3.2 Đường kính khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy .................................................................................................................................. 37 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy ................................................................................................ 39 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy ................................................................................................ 41 Hình 3.5 Nấm Paecilomyces sp. phát triển ở các pH 5, 6, 7, 8 sau 14 ngày ........... 43 Hình 3.6 Nấm Paecilomyces sp. phát triển trên các môi trường khác nhau sau 14 ngày .......................................................................................................................... 46 Hình 3.7 Nấm Paecilomyces sp. bị ức chế khi xử lý các loại thuốc sau 15 ngày .................................................................................................................................. 48 Hình 3.8 Con cái Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi .................................................................................. 50 Hình 3.9 Túi trứng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi ......................................................................... 51 vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 2.1 Dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine .......................................... 30 Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA qua các ngày sau cấy ...................................................................................................................... 37 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. ...... 38 Bảng 3.3 Kết quả xác định hoạt tính chitinase trên môi trường cảm ứng của nấm Paecilomyces sp ....................................................................................................... 40 Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. ..... 40 Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày ............................................................................................................. 42 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nám Paecilomyces sp. qua các ngày ........................................................................ 44 Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của 5 loại thuốc đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua 10 NSC, 15 NSC ................................................................... 47 Bảng 3.8 Hiệu lực kí sinh con cái và trứng Meloidogyne spp. của nấm Paecilomyces sp ....................................................................................................... 49 Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày ....................................................................................................... 42 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày ................................................................................ 44 viii Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Tuyến trùng thực vật là nhóm sinh vật gây hại rất nguy hiểm cho các loại cây trồng. Hàng năm chúng làm giảm 10 – 20% năng suất cây trồng trên thế giới. Powell (1984) cho biết: chỉ tính riêng tuyến trùng sần rễ gây hại trên cây thuốc lá năm 1982 vùng Bắc Carolina đã làm giảm 0,77% sản lượng, gây thiệt hại 8 ngàn 932 USD. Ở Việt Nam mức độ gây hại của tuyến trùng đã ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng. Các loại bệnh do tuyến trùng gây ra và lây lan trong môi trường đất gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến sản lượng và chất lượng của cây và ảnh hưởng đến giá trị của sản phẩm. Chúng gây hại cho nhiều loại cây trồng như cà rốt, khoai tây, bầu bí, chanh, hành, cà chua, tiêu, cà phê…, các loại cây cảnh, cây dược liệu. Tuyến trùng gây hại trên các bộ phận khác nhau của thực vật có thể là thân, lá hoặc rễ do chúng có kích thước hiển vi, khả năng di chuyển cao. Tuyến trùng có phổ kí chủ rộng nhất được biết đến cho đến nay là Meloidogyne, chúng gây ra tổn thất kinh tế lớn cho các cây trồng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Bên cạnh đó, việc lạm dụng thuốc trừ sâu hay thuốc hóa học diệt tuyến trùng ngày càng nhiều không những làm tăng tính kháng thuốc, mà còn tiêu diệt hệ thiên địch, gây ra những dịch hại mới, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Từ thực tế đó, các biện pháp quản lý dịch hại theo hướng sinh học ngày càng được phát triển. Trong những năm gần đây, một loạt các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh côn trùng. Các chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâu hại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS., 2002). Trên thế giới đã sản xuất sử dụng thành công nhiều loại chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng gây hại mang lại hiệu quả cao (Burges H.D.,1998; Butt T.M and Copping L.,2000). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài này vẫn còn khá hạn chế. 1 Đồ án tốt nghiệp Xuất phát từ thực tế trên, sinh viên quyết định thực hiện đề tài : “Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp.”. 2. Mục đích nghiên cứu Chọn ra được chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng phòng trừ tuyến trùng gây hại cây trồng. 3. Nội dung nghiên cứu Khảo sát khả năng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Paecilomyces sp. thu nhận được. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện in vitro. Đánh giá khả năng gây chết tuyến trùng Meloidogyne spp. của nấm Paecilomyces sp. 2 Đồ án tốt nghiệp 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về tuyến trùng thực vật 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng thực vật Tuyến trùng thực vật đã được tìm thấy từ giữa thế kỷ 18. Lần đầu tiên Needham (1743) đã phát hiện ra tuyến trùng thực vật trên bông lúa mì, khi quan sát những hạt lúa mì bị dị tật, teo lại ông đã phát hiện ra hàng loạt các động vật dạng sợi di chuyển xoắn vặn trong nước, mà ông cho rằng chúng là những động vật nước và chúng có thể được gọi là giun hoặc lươn giống như những con lươn giấm được quan sát khoảng 90 năm trước đó. Đến năm 1945, những công bố của ông đã giúp con người biết đến tuyến trùng như là một loài động vật đa dạng nhất trên hành tinh. Từ những năm 1960 tại Mỹ và nhiều nước khác trên thế giới, tuyến trùng học nói chung và tuyến trùng thực vật nói riêng đã trở thành môn khoa học nghiên cứu các quy luật sinh thái học, phát triển của tuyến trùng, nhất là các loài tuyến trùng ký sinh thực vật. Sự đa đạng về chủng loài, số lượng cá thể cũng như đặc điểm môi trường sống đã góp phần phong phú thêm cho ngành tuyến trùng học trên thế giới. Ở Việt Nam công trình nghiên cứu đầu tiên về tuyến trùng thực vật do nhà khoa học người Hungary – Tiến Sỹ Andrassy công bố năm 1970 về hơn 30 loài tuyến trùng ký sinh thực vật và tuyến trùng sống tự do trong đất quanh rễ cây trồng thuộc hai bộ Tylenchida và Dorylaimida. Mặc dù nghiên cứu tuyến trùng chỉ mới bắt đầu từ những năm 1970 trở lại đây nhưng đã khẳng định được vai trò to lớn của tuyến trùng về cả phương diện tuyến trùng gây hại (tuyến trùng thực vật) và có lợi (tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng, tuyến trùng sống tự do trong đất, nước) trong nông nghiệp và sinh thái môi trường ở nước ta. 1.1.2 Khái quát về tuyến trùng thực vật Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật không xương sống có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật. Nhóm tuyến trùng này có một số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở động vật và các nhóm sinh thái khác như: có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, tạo ra các vết thương bề mặt và bên trong thân, rễ 3 Đồ án tốt nghiệp thực vật, kích thước của trứng lớn so với kích thước cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực tiếp với thực vật đang phát triển. Trải qua quá trình tiến hóa tuyến trùng đã thích nghi và có mặt trong hầu hết các bộ phận của thực vật như: rễ, thân, lá, hoa, quả, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất. Tuyến trùng ký sinh thực vật có những tập quán dinh dưỡng rất khác nhau, một số loài dinh dưỡng trên những mô ngoài của thực vật, một số khác xâm nhập vào các mô sâu hơn, một số khác có thể làm cho cây chủ tạo ra những nguồn dinh dưỡng đặc biệt tại nơi chúng ký sinh. Khi bị tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, khả năng quang hợp bị biến đổi hoặc bị phá hủy, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện do quá trình di chuyển, châm chích và hút dinh dưỡng trên cơ thể thực vật. Ngoài tác hại trực tiếp như trên, tuyến trùng còn tạo điều kiện, liên kết, hoặc tương hỗ với các tác nhân gây bệnh khác như nấm, vi khuẩn và virus, gây nên các bệnh khác nhau cho thực vật. Người ta thấy rằng khi cây bị tuyến trùng xâm nhiễm thì dễ dàng bị héo Fusarium hơn so với cây không bị tuyến trùng xâm nhiễm (Roberts và cộng sự, 1985; Porter và Powell, 1967). Ảnh hưởng của tuyến trùng bướu rễ lên mức độ bệnh thối rễ do tác nhân gây bệnh như Phytophthora parasitica (Powell và Nusbaum, 1960), Pythium spp., Fusarium spp., Rhizoctonia solani (Brodie và Cooper, 1964) và Thielaviopsis basicola (Fichter và cộng sự, 2005) thì thấy rằng khi có sự hiện diện của tuyến trùng M. incognita làm gia tăng mức độ mẫn cảm của cây trồng với tất cả các nấm gây bệnh này.  Quá trình gây bệnh bên trong rễ của tuyến trùng trải qua 3 giai đoạn:  Giai đoạn 1: Khi tuyến trùng mới bắt đầu xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, rễ vẫn còn màu sáng, chức năng của rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều.  Giai đoạn 2: Rễ chuyển sang màu nâu, chức năng dinh dưỡng và vận chuyển nước của rễ đã bị ảnh hưởng, xảy ra quá trình hoại sinh, tạo điều kiện cho nấm, vi khuẩn xâm nhập và có thể gây thêm các bệnh khác cho cây.  Giai đoạn 3: Rễ chuyển thành màu đen, chức năng của rễ bị phá hủy hoàn toàn. 4 Đồ án tốt nghiệp Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây vàng lá, còi cọc mà còn ở những cây còn xanh tốt do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, chức năng của rễ chưa bị hủy hoại (Nguyễn Ngọc Châu và 14 ctv., 1990) Tuyến trùng thực vật có mặt ở khắp nơi trên các tầng đất canh tác đối với các loại cây hoa màu, trong vườn ươm và trên đồng ruộng. Mật độ tuyến trùng cao ở độ sau từ 6 – 15 cm, nhiệt độ thích hợp cho tuyến trùng phát triển là ở 25 – 280C, ẩm độ khoảng 60%, trong điều kiện khô hạn hoặc ngập nước lâu dài tuyến trùng kém phát triển. Ngoài ra các yếu tố như địa hình, tác nhân sinh học hay các hoạt động của con người cũng ảnh hưởng đến cấu trúc quần xã tuyến trùng. 1.1.3 Phân loại tuyến trùng thực vật Theo động vật chí Việt Nam, dựa vào các đặc điểm về hình thái, tập quán sinh sống, đặc tính sinh vật học, mối quan hệ giữa các nhóm tuyến trùng thực vật đối với cây trồng mà chúng được chia làm 4 bộ khác nhau:  Bộ Tylenchida: gồm hầu hết các loài tuyến trùng là đại diện cho các nhóm ký sinh ở các phần khác nhau của thực vật, là nhóm tuyến trùng đông đảo nhất và có tầm quan trọng ngành sản xuất nông nghiệp.  Bộ Aphelenchida: gồm khoảng 500 loài, các loài tuyến trùng ký sinh ở các phần trên mặt đất của cây như lá, hoa, hạt.  Bộ Dorylaimida: gồm các loài thuộc họ Longidoridae là nhóm tuyến trùng ngoại ký sinh thực vật, một số loài có khả năng mang truyền virus.  Bộ Triplonchida: gồm các loài của 2 họ Trichodoridae và Diphterophoridae là nhóm ngoại thực vật, nhiều loài có khả năng mang truyền virus. Về hình thức ký sinh trên thực vật, tuyến trùng có thể chia làm 3 nhóm: + Ngoại ký sinh: sử dụng kim chích để lấy dinh dưỡng còn cơ thể nằm ngoài mô thực vật, không xâm nhập vào bên trong. + Bán nội ký sinh: chỉ phần trước cơ thể tuyến trùng xâm nhập vào trong rễ, còn phần sau cơ thể tuyến trùng vẫn ở ngoài rễ, phình to ra. 5 Đồ án tốt nghiệp + Nội ký sinh: đã xác định 17 loài ký sinh gây bệnh tổn thương rễ (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 2000), toàn bộ tuyến trùng xâm nhập vào rễ. Nhóm này được chia 2 nhóm nhỏ:  Nội ký sinh di động: tuyến trùng di chuyển từ mô này đến mô khác bên trong để châm chích, hút dinh dưỡng, tạo thành các khối u sưng, điển hình là giống Meloidogyne spp.  Nội ký sinh cố định: không có khả năng di chuyển, chúng dinh dưỡng tại một nơi cố định bên trong mô rễ và trở nên phình to (con cái). 1.1.4 Hình thái, cấu tạo và hình thức sinh sản của tuyến trùng thực vật 1.1.4.1 Về hình thái Tuyến trùng thực vật có kích thước thân nhỏ, dạng giun, dài 0,2 – 2,5 mm, nhỏ nhất là loài Greeffiella minutum, cơ thể dài 82 µm, nhưng đa số nhỏ hơn 2 mm. Hình dáng của chúng rất đa dạng và có liên quan chặt chẽ với đặc tính sinh sống của cây. Ví dụ như loài Tylenchulus (hình quả lê), Helicotylenchus (dạng giun/xoắn), Pratylenchus (dạng giun), Heterodera (hình quả chanh), Hirschmanniella (hình giun/dài), Meloidogyne (hình cầu/bầu). Các loài tuyến trùng sống trên lá có hình sợi chỉ nằm trong các gian bào của tế bào thực vật. Loại phá hủy mô tế bào thì có dạng là hình trụ, hình thoi sống ở trong rễ hoặc trong đất 6 Đồ án tốt nghiệp Tylenchulus (hình quả lê) Meloidogyne (hình cầu/bầu) (Nguồn: plpnemweb.ucdavis.edu) Pratylenchus (hình giun) Heterodera (hình quả chanh) (Nguồn: nematode.unl.edu) (Nguồn:pest.ceris.purdue.edu) Hình 1.1 Một số hình dạng tuyến trùng thực vật 1.1.4.2 Về cấu tạo Theo Eoshenko và Nguyễn Vũ Thanh (1981) cơ thể tuyến trùng được chia làm 3 phần:  Phần đầu: còn gọi là vùng môi, gồm đầu và chính giữa có miệng chích hút, xung quanh là các cơ quan xúc giác. Hai đầu hơi nhọn hoặc hình tròn dẹt.  Phần giữa: từ eo thắt ở phần đầu đến lỗ hậu môn con cái hoặc đến huyệt sinh dục ở con đực.  Phần đuôi: bắt đầu từ hậu môn. Hình dáng của đuôi là một đặc điểm quan trọng để phân loại tuyến trùng. Có nhiều dạng khác nhau: hình kim nhọn, hình thoi thon dài, có mấu gai hoặc không. 7 Đồ án tốt nghiệp Bao bọc toàn bộ cơ thể tuyến trùng là lớp vỏ cutin tương đối bền vững và có thể co giãn, trên vỏ cutin có các lỗ của hệ tiêu hóa, sinh dục, bài tiết, một số các lỗ khác của các cơ quan tiết hoặc thụ cảm khác nhau. Hệ thống thần kinh trung ương cũng liên quan rất chặt chẽ với vách thân. Hệ thần kinh của tuyến trùng gồm các bó thần kinh chạy dọc dưới da và được các vòng dây thần kinh nối liền với nhau. Bộ máy tiêu hóa của tuyến trùng thực vật gồm ống ruột, bắt đầu từ miệng và kết thúc ở hậu môn nằm về phía bụng. Hệ sinh sản của con cái và đực rất khác nhau:  Con cái: gồm có buồng trứng, ống dẫn trứng, tử cung, lỗ giao phối ở giữa thân.  Con đực: gồm tinh hoàn duy nhất, ống dẫn tinh và gai giao phối ở ruột dưới. Ở một số loài, con đực có vây đuôi giúp cho quá trình giao phối. Hình 1.2 Cấu tạo của tuyến trùng thực vật (Nguồn: thesoilhuggersjourney.wordpress.com) 8 Đồ án tốt nghiệp 1.1.4.3 Hình thức sinh sản Tuyến trùng phần lớn sinh sản hữu tính là chủ yếu. Tỷ lệ đực cái phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến quá trình sinh sản và phát triển qua các giai đoạn từ tuyến trùng non lên tuyến trùng trưởng thành để phân giới đực cái (loài Meloidogyne spp.; Globodera rostochiensis; Heterodera avenae). Tuyến trùng đẻ trứng là chủ yếu, trứng được hình thành trong cơ thể mẹ và phát triển trong tế bào trứng. Một trứng đã thụ tinh là trứng có một nhân với các nhiễm sắc thể, sau đó thực hiện quá trình phân chia nhân tế bào.Trứng sau khi thụ tinh, một số phát triển trong vỏ trứng (loài Meloidogyne spp.), một số khác nằm trong cơ thể mẹ (loài Heterodera spp.), vỏ cơ thể mẹ chuyển thành nang và tuyến trùng non phát triển trong đó, sau đó chui ra ngoài ở tuổi 2 trong điều kiện ngoại cảnh phù hợp. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. 1.2 1.2.1 Phân loại Giới: Animalia Ngành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ: Tylenchida Họ: Heteroderidae Giống: Meloidogyne Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne được Berkeley phát hiện đầu tiên vào năm 1855 trên cây dưa chuột ở Anh, là đại diện cho nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật quan trọng nhất, chúng gây hại hơn 3.000 loài thực vật trên toàn thế giới, bao gồm hầu hết các cây trồng quan trọng như rau màu, đậu đỗ, ngũ cốc, cây hòa thảo, cây bụi và cây ăn quả, thảo mộc và nhiều loài cây cảnh thân gỗ (Malcolm và Charles, 2000). Tuyến trùng gây giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng sản phẩm cây trồng. Cho đến nay đã thống kê khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong 9 Đồ án tốt nghiệp đó có 4 loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M. hapla. Đây là các loài phân bố rộng và gây hại lớn ở các vùng nông nghiệp trên thế giới. Ngoài ra, một số loài khác mặc dù cũng gây hại quan trọng nhưng chúng chỉ gây hại ở 1 – 2 cây trồng và phân bố hẹp. 1.2.2 Đặc điểm hình thái Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne spp. có đặc điểm sau: Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn tới dạng quả lê, màu trắng, ít vận động. Không có giai đoạn u nang. Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12 – 15 µm. Lỗ bài tiết nằm trước tới khoang giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích. Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chất đặc sệt để bảo quản trứng, đẻ trứng ra ngoài. Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ. Có kinh chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18 – 25 µm. Tuyến hầu chủ yếu nằm ở phần bụng đến ruột. Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25 – 33 µm, ống dẫn dài từ 7 – 11 µm. Có tinh hoàn duy nhất. Ấu trùng: trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra trong một bọc gelatin (còn gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ. Ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2 (J2) có dạng cân đối hình giun, dài khoảng 0,4 – 0,5 mm. Kim chích và vùng đầu kitin hóa yếu, đuôi hình chóp. Hình 1.3 Con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. (Nguồn: clfs.umd.edu) 10