Tài liệu Luận án tiến sĩ sàng lọc và biểu hiện gen mã hoá protein ức chế protease củacủa vi sinh vật liên kết hải miên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THỊ HỒNG SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THỊ HỒNG SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium QT2 THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường 2. PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc Hà Nội, 2020 LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường, nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam- Nhà Khoa học mẫn cán, người thầy mẫu mực- người đã giúp tôi định hướng nội dung, giúp đỡ về tinh thần, kiến thức chuyên môn, cơ sở vật chất và chỉ bảo tận tình giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn để hoàn thành Luận án trong suốt những năm qua. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Chủ nhiệm đề tài ĐTĐLCN.17/14 “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên tại biển miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện và sàng lọc các chất hoạt tính sinh học mới” đã định hướng cho luận án của tôi và quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã cử tôi đi học, tập thể Trung tâm sinh học Phân tử Nghĩa Đô, Ths.NCS Tôn Thất Hữu Đạt, phòng quản lý tổng hợp Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã tạo điều kiện cho tôi làm việc, hoàn thành các thủ tục giấy tờ và hoàn thiện các nội dung trong nghiên cứu này. Tôi trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS. Trần Thị Hồng i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một số kết quả lần đầu tiên được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS. Trần Thị Hồng ii MỤC LỤC Lời cảm ơn ...................................................................................................................i Lời cam đoan ...............................................................................................................ii MỤC LỤC .................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .................................................................... ix MỞ ĐẦU ......................................................................................................................1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1. Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên .................................................................. 3 1.1.1. Giới thiệu về hải miên................................................................................................... 3 1.1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên ......................................................................................... 6 1.2. Sơ lược về metagenomics ........................................................................................... 14 1.3. Chất ức chế protease (PIs) ......................................................................................... 19 1.3.1. Sơ lược protease ............................................................................................................ 19 1.3.2. Chất ức chế protease và phân loại ................................................................................ 20 1.3.3. Cơ chế hoạt động của PIs.............................................................................................. 25 1.3.4. Ứng dụng của chất ức chế protease .............................................................................. 28 1.3.5. Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sịnh vật liên kết với hải miên trong và ngoài nước..................................................................................................................... 31 1.4. Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris ................................ 35 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 37 2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................................... 37 2.1.1 Vật liệu….. .................................................................................................................... 37 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu….. ............................................................................................. 39 2.1.3. Hóa chất…. ................................................................................................................... 39 2.1.4. Máy móc thiết bị ........................................................................................................... 39 2.1.5. Dung dịch và môi trường sử dụng ................................................................................ 40 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 42 2.2.1. Phương pháp tách DNA metagenome của VSV liên kết hải miên ............................... 43 iii 2.2.2. Định danh hải miên bằng sinh học phân tử .................................................................. 43 2.2.3. Phân tích dữ liệu metagenomics ................................................................................... 43 2.2.4. Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế plasmid mang gen PIs ................................................................................................... 47 2.2.5. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E. coli (DE3) ................................................................................................ 48 2.2.6. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris .............................................................................. 49 2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease ......................................................... 50 2.2.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PIs tái tổ hợp ....................................................................................................................... 52 2.2.9. Phân tích thống kê......................................................................................................... 52 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 53 3.1. Thu thập mẫu hải miên .............................................................................................. 53 3.2. Kết quả tách chiết DNA metagenome ....................................................................... 54 3.2.1. Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị ...................................................................................................................... 54 3.2.2. Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử .......................................................... 55 3.3. Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị, Việt Nam bằng tin sinh học ................................................................................................ 56 3.3.1. Lắp ráp reads của DNA metagenome ........................................................................... 56 3.3.2. Kết quả dự đoán gen ..................................................................................................... 58 3.3.3. Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen ............................................................... 60 3.3.4. Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị ................................................................................... 64 3.3.5. Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ liệu (CSDL) metagenomics ......................................................................................... 71 3.4. Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ Escherichia coli................................................................................................................................. 75 3.4.1. Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PI-QT ................................ 76 iv 3.4.2. Thiết kế vectơ biểu hiện pET-32a(+) mang gen PIs ..................................................... 78 3.4.3. Biểu hiện gen PIs trong E. coli chủng BL21(DE3) ...................................................... 79 3.4.4. Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp PI-QT ở trạng thái tan cao nhất ................................................................................................ 81 3.4.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E. coli và nhận diện bằng khối phổ ........................................................................................................................ 87 3.4.6 Thử hoạt tính ức chế của protein tái tổ hợp PI-QT với protease .................................. 89 3.5. Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ nấm men Pichia pastoris .............................................................................................................. 91 3.5.1. Tạo plasmid pPIC9 mang gen PI-QT ........................................................................... 91 3.5.2. Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT ..................................... 92 3.5.3. Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P. pastoris SMD1168........................................ 93 3.5.4. Kết quả thử hoạt tính ức chế của protein PI-QT biểu hiện trong nấm men ................................................................................................................................ 96 3.5.5. Kết quả phát hiện chất ức chế protease bằng điện di trên gel SDSPAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1 % ........................................................................ 97 3.5.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện P. pastoris SMD 1168 [pPIC9/PI-QT] ..................................................................................................... 98 3.5.7. Tinh sạch protein PI-QT tái tổ hợp biểu hiện trong nấm men P. pastoris qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharore 4B .................................................. 104 3.5.8. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PI-QT......................................................... 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 112 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ.......................................................... 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 114 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile Amp Ampicillin BLAST bp, kb, kDa CFU Basic Local Alignment Search Tool Base pair, Kilo base, Kilo dalton Colony forming units CSDL Cơ sở dữ liệu CTAB Cetyl trimêtylamôni brômua ĐC Đối chứng DN Đà Nẵng DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate đtg Đồng tác giả DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr FA Ethidium bromide AntiFoam HMA High microbial abundance IAA 3-Indolebutyric acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KH&CN LB: LMA Khoa học và Công nghệ Luria-Bertani Low microbial abundance mRNA Messenger RNA NCBI National Center for Biotechnology Information P. pastoris PCR Pichia pastoris Polymerase Chain Reaction PIs Protein inhibitors QT Quảng Trị vi RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease SCUBA Self contained underwater breathing apparatus SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris-Acetic-EDTA Taq polymerase TBS TE Polymerase Thermus aquarius Tris-buffered saline Tris- EDTA TFA Axit trifluoroacetic TQ Trung Quốc VSV Vi sinh vật vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2. Chất ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên…………… Bảng 2.1. Thành phần của bản gel polyacryamide .................................................................... 42 Bảng 3.1. Chất lượng của DNA tổng số tách từ các mẫu hải miên biển 32 Quảng trị .................................................................................................................... 54 Bảng 3.2. Kết quả lắp ráp DNA metagenome của mẫu QT2 ..................................................... 57 Bảng 3.3. Kết quả dự đoán, cluster genes và kiểm tra tính toàn vẹn của gen (mẫu QT2) ................................................................................................................. 59 Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả chú giải chức năng gen (QT2) ...................................................... 60 Bảng 3.5. Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia vesparium QT2 theo giới và ngành............................................................................ 65 Bảng 3.6. Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia vesparium QT2 đến lớp và bộ.................................................................................... 66 Bảng 3.7. Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia vesparium QT2 đến họ; chi........................................................................................ 68 Bảng 3.8. Kết quả sàng lọc các gen có hoạt tính protease inhibitor từ CSDL metagenomics QT2 ......................................................................................... 71 Bảng 3.9 Gen có hoạt tính sinh học mới (so với ở Việt Nam) ................................................. 73 Bảng 3.10 So sánh hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch thu hồi biểu hiện trong P. pastoris SMD1168 và E. coli BL21(DE3) ............................................................................................................... 106 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc cơ thể hải miên và các mô ......................................................................... 4 Hình 1.2. Sơ đồ đại diện cho hải miên asconoid ..................................................................... 4 Hình 1.3. Vai trò của vi sinh vật với hải miên ......................................................................... 8 Hình 1.4. Ba trạng thái liên kết chung củ VSV và hải miên ................................................... 10 Hình 1.5. Ba cách truyền và thu nhận VSV để thiết lập và duy trì các cộng đồng VSV liên kết hải miên ............................................................................ 11 Hình 1.6. Ba chất ức chế protease có sẵn trên thị trường ........................................................ 20 Hình 1.7. Một vài họ PPI quan trọng ....................................................................................... 23 Hình 1.8. Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibitor) .............................................................. 26 Hình 1.9. Cơ chế ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II ............................................................ 27 Hình 1.10. Serpin ức chế protease ............................................................................................. 28 Hình 2.1. Cấu trúc vectơ pET-32a(+) ...................................................................................... 38 Hình 2.2. Cấu trúc vectơ pPIC9............................................................................................... 39 Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm tách DNA của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị ................................................................................................ 54 Hình 3.2. Điện di đồ trên gel agarose 1 % ............................................................................... 56 Hình 3.3. Kết quả tinh sạch dữ liệu QT2 ................................................................................. 57 Hình 3.4. Phân bố độ dài contig sau lắp ráp ............................................................................ 58 Hình 3.5. Phân bố độ dài gen................................................................................................... 59 Hình 3.6. Phân loại chức năng gen trên cơ sở dữ liệu COG ................................................... 61 Hình 3.7. Phân nhóm chức năng của enzyme trên cơ sở dữ liệu CAZy.................................. 62 Hình 3.8. Kết quả phân loại trên cơ sở dữ liệu KEGG ............................................................ 63 Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8 % ................................................... 64 Hình 3.10. Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 theo giới và ngành ......................................................................... 66 Hình 3.11. Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị theo chi ................................................................. 69 Hình 3.12. So sánh trình tự axít amin của protein PI-QT với các trình tự tương đồng trên cơ sở dữ liệu NCBI ....................................................................... 76 Hình 3.13. Mối phát sinh quan hệ gen của protein PI-QT với các serpin ix khác. (B) Cấu trúc protein của PI-QT đã được dự đoán bằng SWISS-MODEL. (C) Cấu trúc protein của PI-QT đã được dự đoán bằng (PS)2-v2 ................................................................................................. 77 Hình 3.14. (A) –Gel agarose của vectơ cắt bằng EcoRI/NotI, (B) – Gel agarose của plasmid tái tổ hợp ([pET-32a(+)/PI-QT]) được cắt bằng enzyme EcoRI/ NotI........................................................................................ 78 Hình 3.15. A- Kết quả điện di PAGE 12,6 % kiểm tra E. coli BL21(DE3)/[pET-32a(+)/PI-QT] biểu hiện ở 37 oC ............................................... 80 Hình 3.16. Kiểm tra trạng thái của protein PI-QT biểu hiện ..................................................... 80 Hình 3.17. Protein PI-QT biểu hiện trong E. coli dưới các nồng độ IPTG khác nhau ................................................................................................................. 81 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tạo protein PI-QT tan.................................. 83 Hình 3.19. (A)- Điện di SDS- PAGE 12,6 % kiểm tra khả năng tan của protein ở OD600= 0,6 trước khi cảm ứng; (B)- Trạng thái protein PI-QT (% tan) và hàm lượng protein tạo ra khi OD600 trước cảm ứng khác nhau......................................................................................... 84 Hình 3.20. Sử dụng đệm đẩy cột imidazole 100 mM, 250 mM, 300 mM, 500 mM .................................................................................................................... 86 Hình 3.21. Kết quả Western blot và kết quả loại bỏ đuôi dung hợp TRxHis-tag ra khỏi protein PI-QT bằng thrombin trên gel SDS- PAGE 12.6 % .......................................................................................................... 88 Hình 3.22. Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với Trypsin và Elastase trên đĩa thạch ........................................................................... 90 Hình 3.23. Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với ɑ-Chymotrypsin trên đĩa thạch ................................................................................ 90 Hình 3.24. Điện di đồ trên gel agarose 1 % sản phẩm cắt mở vòng vectơ pPIC9 (a) và cắt kiểm tra plasmid [pPIC9/PI-QT] .................................................. 91 Hình 3.25. Điện di đồ trên gel agarose 1% sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pPIC9/PI-QT và sản phẩm PCR bằng cặp mồi AOX1 ............................................ 92 Hình 3.26. Kết quả kiểm tra kiểu hình và kiểu gen nấm men mang gen PI- QT ............................................................................................................................ 92 x Hình 3.27. Đường cong sinh trưởng của các dòng P. pastoris tái tổ hợp theo thời gian ........................................................................................................... 94 Hình 3.28. Điện di đồ protein PI-QT biểu hiện trong P. pastoris SMD1168 [pPIC9/PI-QT] ....................................................................................... 95 Hình 3.29. Đồ thị tương quan giữa hàm lượng protein ngoại lai tạo ra với mật độ tế bào nấm men tái tổ hợp............................................................................ 95 Hình 3.30. Định tính khả năng ức chế protease của protein biểu hiện ...................................... 96 Hình 3.31. Kết quả thử hoạt tính ức chế protease của dịch chiết thô P. pastoris SMD1168 không mang gen PI-QT ....................................................... 97 Hình 3.32. Điện di SDS-PAGE 12,6 % đồng trùng hợp với cơ chất casein 0.1 % và xử lý bằng enzyme trypsin ....................................................................... 98 Hình 3.33. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo protein PI-QT (mg/L) trong nấm men P. pastoris ............................................................... 99 Hình 3.34. Khảo sát nhiệt độ biểu hiện của P. pastoris SMD 1168 [pPIC9/PI-QT] ......................................................................................................... 100 Hình 3.35. Khảo sát pH trong quá trình biểu hiện P. pastoris SMD 1168[pPIC9/PI-QT] ................................................................................................. 102 Hình 3.36. Nồng độ methanol cảm ứng trong biểu hiện P. pastoris tái tổ hợp ........................................................................................................................... 103 Hình 3.37. Điện di SDS – PAGE 12,6 % protein PI-QT qua màng cut off 30 kDa và qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B .......................................... 105 Hình 3.38. Hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch biểu hiện trong nấm men P. pastoris SMD1168 ............................................................. 105 Hình 3.39. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hợp chất PI-QT ............................................. 106 Hình 3.40. Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến hợp chất PI-QT ..................................................... 107 xi BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN THỊ HỒNG SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG , VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2020 1 MỞ ĐẦU Chất ức chế protease (PI), một tác nhân có thể làm cho protease mất khả năng thủy phân protein thành peptide được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong y dược như: điều trị kháng phân hủy sợi huyết (antifibrinolytic); ức chế angiotensin trong điều trị tăng huyết áp; ngăn chặn sự nhân lên của một số virus (HIV, viêm gan C…. Ví dụ về các thuốc ức chế protease là saquinavir (tên thương hiệu: Invirase) và ritonavir (tên thương hiệu: Novir) được sử dụng chủ yếu trong điều trị HIV/AIDS. Chúng được dùng như một phần của một loại cocktail đa thuốc và đã được chứng minh là có khả năng làm giảm đáng kể mức độ virus HIV trong máu. Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện các phân tử protein mới có hoạt tính ức chế đặc hiệu các protease đích khác nhau, liên quan đến các loại bệnh là một hướng nghiên cứu được quan tâm hiện nay. Hải miên và các vi sinh vật liên kết với hải miên được xem là một nguồn để phát hiện và khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học mới phục vụ chế tạo thuốc, các peptide có hoạt tính ức chế protease là một trong số đó. Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật liên kết hải miên thuộc loại không nuôi cấy được nên hạn chế khả năng khai thác chúng. Nhờ kỹ thuật metagenomic, với sự hỗ trợ của thiết bị giải trình tự gen hiệu năng cao và công cụ tin sinh cho phép phát hiện các gen, cụm gen có chức năng mã hóa cho các PI, cho phép khai thác được các PI từ các vi sinh vật chưa nuôi cấy được. Đến nay tại Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về hải miên, từ việc phân lập vi sinh vật trên hải miên, đến tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ nhóm vi sinh vật này. Tuy nhiên, vẫn còn chưa có nghiên cứu nào sử dụng công cụ metagenomics và công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới để phát hiện, sàng lọc các gen có hoạt tính sinh học, trong đó có hoạt tính ức chế protease và biểu hiện các gen này trong hệ Escherichia coli và nấm men Pichia pastoris. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án với tên đề tài: “Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam”. 2 Mục tiêu của đề tài luận án Phát hiện và sàng lọc gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên thu nhận từ biển Miền Trung, Việt Nam bằng phương pháp metagenomics. Sau đó biểu hiện gen chọn lọc in vitro và xác định hoạt tính. Nội dung nghiên cứu 1. Tách DNA của vi sinh vật liên kết với hải miên, xác định nồng độ DNA và độ tinh sạch, lựa chọn mẫu giải trình tự metagenomics. 2. Phân tích dữ liệu metagenomics mẫu đã giải trình tự bằng các công cụ tin sinh học. Đánh giá đa dạng sinh học của vi sinh vật liên kết với hải miên. Từ CSDL metagenomics khai thác gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức chế protease. 3. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease trong hệ biểu hiện Escherichia coli và hệ biểu hiện nấm men Pichia pasroris. 4. Đánh giá hoạt tính ức chế protease của protein tái tổ hợp. Những đóng góp mới của luận án 1. Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên của mẫu hải miên QT2 thu nhận tại vùng biển Quảng Trị (Miền Trung), Việt Nam. Cơ sở dữ liệu thu được có ý nghĩa về mặt khoa học góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển Việt Nam và có tiềm năng khai thác nguồn gen trên để ứng dụng vào thực tiễn. 2. Thu nhận được gen mới PI-QT mã hóa cho PIs và biểu hiện thành công ở E. coli và P. pastoris. Hoạt tính ức chế protease của protein biểu hiện đã được đánh giá và kết quả thu được cho thấy protein PI-QT tái tổ hợp từ E. coli có hoạt tính ức chế trypsin, ức chế ɑ-chymotrypsin và protein từ P. pastoris thể hiện hoạt tính ức chế trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin. 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên 1.1.1. Giới thiệu về hải miên Hải miên là một ngành động vật đa bào nguyên thủy, có cấu trúc tế bào tách biệt và là nhóm động vật sống bám, tuy nhiên một số loài có khả năng vận động nhờ vào tế bào chất hay roi. Hải miên có thể sống trong các loại môi trường khác nhau ở biển và trong tất cả các vùng khí hậu. Từ các vùng cực và ôn đới, đến hệ sinh thái rạn san hô nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tính đến năm 2019, khoảng 9.125 loài hải miên nói chung được chấp nhận có trong danh sách của Cơ sở dữ liệu hải miên thế giới (Http://www.marinespecies.org). Vì vậy, các quần thể hải miên có sự khác biệt về sự đa dạng, sự phong phú và mật độ. Các loài hải miên được chia thành 4 lớp: Calcarea (hải miên đá vôi), Demospongia (demosponges), Hexactinellida (hải miên thủy tinh), và Homoscleromorpha. Lớp lớn nhất là Demospongia, gồm khoảng 83,4 % tất cả các loài được biết. Trong số các loài hải miên được biết đến, chỉ có khoảng 250 loài là sống trong nước ngọt (van Soest et al., 2012). Hải miên có các hình dạng khác nhau, từ hình cầu, hình ống, hình bình hoặc phân nhánh và kích thước cũng khác nhau, từ một vài milimet (hải miên Cliona celata), đến vài mét (hải miên Xestospongia muta). Phần lớn hải miên là động vật ăn lọc, trừ các loài ăn thịt cư trú ở môi trường biển sâu nghèo dinh dưỡng (Lee et al., 2012). Hình dáng cơ thể chung của loài ăn lọc được chuyên môn hóa cho lọc nước để lấy dinh dưỡng, hô hấp và bài tiết. Phụ thuộc vào thiết kế của hệ thống lọc nước, hải miên được chia thành: (1) Asconoid, khi cơ thể hải miên có hình trụ rỗng, bề mặt có các lỗ nhỏ; (2) Syconoid, khi bề mặt cơ thể hải miên có xen kẽ các túi chui vào trong và lồi ra ngoài, làm tăng tỉ lệ giữa diện tích và thể tích; hoặc (3) Leuconoid, khi cơ thể hải miên được tạo thành bởi các kênh dẫn nước bao gồm rất nhiều các khoang hình cầu nối với nhau bởi các ống giống như mao mạch (Hình 1.1 và 1.2) (Cavalcanti & Klautau., 2011; Webster & Thomas., 2016). 4 Hình 1.1. Cấu trúc cơ thể hải miên và các mô. (Nguồn: Cavalcanti & Klautau., 2011). (A): Asconoid; (B): Syconoid; (C): Leuconoid. Mô liên kết: mesophyl (màu xám), lớp bề mặt (pinacoderm) và một lớp tế bào bên trong hình thành bởi các tế bào hình roi (choanoderm: màu đen). Hình 1.2. Sơ đồ đại diện cho hải miên Asconoid. (Nguồn: Webster &Thomas., 2016). Nước biển đi vào hải miên thông qua các lỗ nhỏ (ostia) vào lớp bề mặt (pinacoderm). Các tế bào roi choanocyte được sắp xếp thành vòng tròn lót hệ chuyển nước của hải miên và chịu trách nhiệm di chuyển nước qua hải miên cho đến khi thải ra qua các lỗ thoát nước (osculum). Vi sinh vật môi trường là các tế bào màu xanh, trong khi mật độ cộng đồng vi sinh vật liên kết có trong mô liên kết màu đỏ. 5 Cấu trúc cơ thể hải miên được giữ vững bởi mô liên kết và các loại tế bào khác nhau. Các thành phần khung riêng biệt làm cho hải miên có cấu trúc toàn vẹn được cấu tạo từ các gai (spicules), canxi (calcareous) hoặc silic (siliceous), chitin hoặc sợi collagen (collagenous spongin) (Hentschel et al., 2012). Thành phần hóa học, sự khác biệt cấu trúc và kích thước gai là các đặc điểm hình thái quan trọng để phân loại hải miên. Lớp Demospongia và Homoscleromorpha có sợi collagen hoặc các gai hoặc cả hai. Lớp Homoscleromorpha cũng có đại diện không có gai nhưng có sợi collagen. Lớp hải miên đá vôi và hải miên thủy tinh có canxi hoặc silic, tương ứng (van Soest et al., 2012). Là loài ăn lọc, hải miên xử lý hàng trăm lít nước biển một ngày, vì vậy thức ăn của chúng bao gồm VSV, sinh vật nhân chuẩn nhỏ, các hợp chất hữu cơ nhỏ... (de Goeij et al., 2013). Thức ăn được tế bào roi và lớp bề mặt của hải miên bắt giữ, và chuyển đến các tế bào mô liên kết và tiêu hóa bởi tế bào khởi thủy (archaeocytes). Tiếp theo, các sản phẩm của thức ăn đã được tiêu hóa được phân bố đến các tế bào mô liên kết khác và cuối cùng các thứ không được tiêu hóa và sản phẩm bài tiết được trục xuất ra khỏi hải miên thông qua các kênh thở ra (exhalant) hoặc mặt ngoài qua ngoại tế bào (exocytosis) (Maldonado et al., 2012). Hải miên có sự đa dạng cao và là một thành phần quan trọng của quần thể sinh vật đáy biển, từ cửa sông, bờ biển đến biển sâu. Nhóm này là một trong những nguồn các hợp chất hoạt tính sinh học từ biển nổi bật nhất, với khoảng 4851 hợp chất (năm 2014), đóng góp gần 30 % tổng số các hợp chất tự nhiên từ biển được phát hiện. Trong 10 năm từ 2001 đến 2010, hơn 2400 các sản phẩm tự nhiên mới được phát hiện từ 542 chi và 671 loài hải miên (Mehbub et al., 2014). Rất nhiều hợp chất nhận được từ hải miên, gồm terpenoids, alkaloids, peptides, và polyketides... (Tung et al., 2009; Utkina & Denisenko., 2011; Kalinin et al., 2012) và chúng có nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học, được sử dụng như các chất kháng sinh, kháng ung thư, kháng virus, chống viêm và chống độc (Hirashima et al., 2010; Joseph & Sujatha., 2011; Li et al., 2013; Perdicaris et al., 2013). Do sự tương đồng cao của một số hợp chất nhận được từ hải miên với các chất trao đổi thứ cấp của VSV đã biết, người ta tin rằng ít nhất một số chất hoạt tính sinh học là do 6 VSV liên kết sản sinh. Việc định vị các chất trao đổi thứ cấp trong các vi sinh vật cộng sinh đã ủng hộ giả thiết này (Wilson et al., 2014). 1.1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên Vi sinh vật liên kết hải miên được tìm thấy cả trong và ngoài tế bào hải miên, nằm trong mô liên kết hoặc trong lớp ngoài của hải miên. Các vi khuẩn và cổ khuẩn gồm ngành Thaumarchaeota và các ngành vi khuẩn Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Proteobacteria (Alpha-, Beta-, Gamma-, và Delta-), Planctomycetes, Verrucomicrobia, và Poribacteria (Hentschel et al., 2012). Từ nghiên cứu giải trình tự thông lượng cao về quần xã VSV liên kết hải miên, số lượng ngành VSV trong một hải miên tăng từ 23 ngành (Webster et al., 2010) lên đến 47 ngành (Reveillaud et al., 2014). Theo số liệu mới nhất gần đây, hơn 60 ngành VSV đã tìm được từ các mẫu hải miên biển theo phân loại của Silva và hơn 70 ngành theo phân loại của Greengenes (Moitinho-Silva et al., 2017). Nhìn chung, VSV liên kết hải miên có các loại tương tác khác nhau, có lợi hoặc có hại, từ việc là nguồn thức ăn, ký sinh, gây bệnh, đến hỗ sinh và hội sinh (Hình 1.3) (Taylor et al., 2007; Lafi et al., 2009). Vi khuẩn liên kết hải miên được chia ra thành các nhóm: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn dị dưỡng, cổ khuẩn oxi hóa ammonia. Ba loại liên kết rộng rãi của vi khuẩn với hải miên gồm: (1) Lượng lớn các quần thể vi khuẩn đặc hiệu hải miên trong mô liên kết hải miên; (2) Các quần thể nhỏ vi khuẩn bên trong tế bào riêng biệt; (3) Các quần thể vi khuẩn không đặc hiệu giống với các quần thể trong môi trường nước xung quanh (Mares et al., 2017). VSV nhân chuẩn là một trong những thành phần quan trọng và đa dạng của các hệ sinh thái biển; tuy nhiên, chúng được đánh giá thấp so với các VSV khác. Trong hải miên, chủ yếu là thấy nấm men. Trái ngược với các cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên, các nghiên cứu về sự liên kết giữa nấm và hải miên vẫn còn rất khiêm tốn (Rodríguez-Marconi et al., 2015; Naim et al., 2017). Các sinh vật nhân chuẩn khác như "SAR" - một nhánh bao gồm Stramenopiles, Alveolates và Rhizaria cũng đã được phát hiện trong hải miên (Burki el al., 2007; Webster et al., 2004; Sipkema & Blanch., 2009). Tuy nhiên, cộng đồng các VSV nhân chuẩn