Tài liệu Luận án tiến sĩ phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông cửu long và sản xuất kháng thể

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHẠM CÔNG UẨN PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SỸ CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHẠM CÔNG UẨN PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SỸ CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS.HỒ THỊ VIỆT THU NĂM 2019 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS.Hồ Thị Việt Thu đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. PGS.TS.Trần Nhân Dũng, PGS.TS.Nguyễn Văn Thành, PGS.TS.Nguyễn Minh Chơn, TS.Dương Thị Hương Giang, TS.Bùi Thị Minh Diệu đã động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện các nội dung nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Công nghệ Enzyme trong suốt quá trình thực hiện luận án. Các Sinh viên, Học viên Cao học chuyên ngành thú y đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận án. Cán bộ phòng thí nghiệm Virus và Miễn dịch học của Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng; phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Công nghệ Enzyme của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án. Quý Thầy Cô và các anh chị em đồng nghiệp của Bộ môn Thú y, trường Đại học Cần thơ Quý Thầy Cô giảng dạy Chương trình Nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn tất cả người thân đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian thực hiện và hoàn thành luận án này. Tác giả Phạm Công Uẩn i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những kết quả trình bày trong luận án này là công trình nghiên cứu của NCS Phạm Công Uẩn với sự hướng dẫn của PGS.TS.Hồ Thị Việt Thu. Tất cả các số liệu, kết quả trình bày trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố riêng lẻ trong bất kỳ công trình nào trước đây. Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án PGS.TS.Hồ Thị Việt Thu NCS.Phạm Công Uẩn ii MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ…………………………………………………………………...….i Lời cam đoan………………………………………..........................................ii Mục lục………………………………………………………………………..iii Danh sách bảng……………………………………..........................................ix Danh sách hình…………………………………………………………….......xi Danh mục từ viết tắt……………………………………………………….....xiii Tóm tắt……………………………………………………………………….xv Abstract …………………………………………………………………….xvii Chương 1. Giới thiệu……………………………………………………….....1 1.1 Đặt vấn đề…………………………………………………………………..1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài……………………………………………..2 1.3 Những đóng góp mới về khoa học…………………………………………2 Chương 2. Lược khảo tài liệu………………………………………………...3 2.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan vịt do virus ….....................................3 2.2 Bệnh viêm gan vịt do virus.........................................................................4 2.2.1 Đặc điểm tác nhân gây bệnh.……………….............................................4 2.2.2 Sự xâm nhập và đường lây lan...................................................................4 2.2.3 Cơ chế sinh bệnh........................................................................................5 2.2.4 Đặc điểm dịch tễ.........................................................................................5 2.2.5 Triệu chứng và bệnh tích............................................................................6 2.2.5.1 Triệu chứng.............................................................................................6 2.2.5.2 Bệnh tích.................................................................................................7 2.2.6 Chẩn đoán và phòng bệnh..........................................................................8 2.2.6.1 Chẩn đoán................................................................................................8 2.2.6.2 Phòng bệnh..............................................................................................9 2.3 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt …………………………………….9 2.3.1 Hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt type I ………………………9 iii 2.3.2 Thành phần hệ gen của virus viêm gan vịt type I ………………………10 2.3.3 Cấu trúc hệ gen và protein của virus viêm gan vịt type I ………………10 2.3.4 Đặc tính kháng nguyên và khả năng gây bệnh của virus ……………….12 2.3.5 Xếp loại virus viêm gan vịt ……………………………………………..12 2.4 Đặc tính sinh học của virus viêm gan vịt.................................................13 2.4.1 Nuôi cấy trên phôi trứng...........................................................................13 2.4.2 Nuôi cấy trên môi trường tế bào...............................................................14 2.4.3 Nuôi cấy trên động vật cảm thụ................................................................14 2.4.4 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt........................................................15 2.5 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt do virus trong nước và trên thế giới trong thời gian gần đây ………………………………………..15 2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ……………………………………..15 2.5.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam …………………………………….16 2.6 Kháng thể IgY của gà ………………………………...............................17 2.6.1 Tính chất phân tử của kháng thể IgY ……………………………….......18 2.6.2 Đặc tính hóa lý của kháng thể IgY ……………………………………. 19 2.6.3 Sự truyền kháng thể IgY từ máu gà mẹ sang lòng đỏ trứng.....................20 2.7 Phương pháp sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà ….…………….20 2.7.1 Gây tối miễn dịch cho gà mái...................................................................20 2.7.2 Đường tiêm chủng cho gà mái..................................................................21 2.7.3 Tần số và khoảng cách giữa các lần tiêm chủng cho gà mái...................21 2.7.4 Chiết xuất kháng thể IgY..........................................................................21 2.7.5 Các phương pháp tinh sạch kháng thể IgY...............................................22 2.7.5.1 Phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sulphat ............................22 2.7.5.2 Phương pháp thẩm tích.............................. ...........................................22 2.7.5.3 Sắc ký trao đổi ion.................................................................................23 2.8 Những ứng dụng kháng thể IgY trong phòng và trị bệnh trên gia cầm .......................................................................................................23 2.9 Thành tựu phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus ở Việt Nam ……26 iv Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu...........................................28 3.1 Nội dung nghiên cứu.................................................................................28 3.2 Phương tiện nghiên cứu............................................................................28 3.2.1 Thởi gian và địa điểm...............................................................................28 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu..................................................................................29 3.2.3 Hóa chất và môi trường............................................................................29 3.3 Phương pháp nghiên cứu..........................................................................30 3.3.1 Phân lập và định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long ....................................................................30 3.3.1.1 Phương pháp lấy mẫu............................................................................30 3.3.1.2 Phương pháp xử lý mẫu..................................................................................31 3.3.1.3 Phương pháp phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi trứng vịt................................................................................................31 3.3.1.4 Phương pháp cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp..................................................................................31 3.3.1.5 Định danh virus viêm gan vịt bằng sinh học phân tử............................32 3.3.2 Nghiên cứu di truyền virus viêm gan vịt type I genotype 3.................33 3.3.2.1 Giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR...........................................33 3.3.2.2 Nghiên cứu di truyền của các chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 phân lập được…...…………………………………. 34 3.3.3 Khảo sát độc lực của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt và trên vịt con….………………………………………..34 3.3.3.1 Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 …………………………………34 3.3.3.2 Xác định liều gây chết 50% phôi vịt và khảo sát bệnh tích biểu hiện trên phôi của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 ………..35 3.3.3.3 Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm và khảo sát đặc điểm bệnh lý của 01 chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 …..…………….36 3.3.3.4 Khảo sát bệnh tích vi thể từ mẫu bệnh phẩm của vịt khảo sát LD50 .....38 v 3.3.4 Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái và ứng dụng trong phòng, trị bệnh....................................................................................................38 3.3.4.1 Tạo miễn dịch cho gà mái …………….................................................38 3.3.4.2 Tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà.......................................40 3.3.4.3 Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái và lòng đỏ trứng gà....................................................................................40 3.3.4.4 Xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối với tế bào xơ phôi vịt.............................................................................41 3.3.4.5 Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ trước khi gây nhiễm……………………………………………………43 3.3.4.6 Khảo sát hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ sau khi gây nhiễm……………………………………………………...44 3.3.4.7 Xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà bằng phản ứng trung hòa virus............................44 3.3.4.8 Thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh do virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con…….46 3.3.4.9 Thử nghiệm hiệu quả trị bệnh do virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà trên vịt con……..47 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu.....................................................................50 Chương 4. Kết quả và thảo luận....................................................................51 4.1 Kết quả phân lập và định danh virus gây bệnh viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long.................................................51 4.1.1 Kết quả phân lập virus viêm gan vịt trên môi trường phôi vịt.................51 4.1.2 Kết quả cấy truyền virus viêm gan vịt trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp....................................................................................................53 4.1.3 Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật sinh học phân tử.....55 4.2 Kết quả khảo sát đặc điểm di truyền phân tử của các chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3 đã phân lập............................................57 4.2.1 Kết quả giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR.................................57 vi 4.2.2 Tìm kiếm sự tương đồng với virus viêm gan vịt type I genotype 3 khác đã đăng ký trong Ngân hàng gen Thế giới........................................60 4.2.3 So sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide và axít amin giữa các chủng phân lập với các chủng khác trong Ngân hàng gen Thế giới...………………..60 4.3 Kết quả khảo sát độc lực của virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt và trên vịt con……………………………………………..65 4.3.1 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên phôi vịt…………………………………………65 4.3.1.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% phôi vịt thí nghiệm…………….65 4.3.1.2 Kết quả khảo sát thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ……….66 4.3.1.3 Biểu hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm………………………….69 4.3.2 Kết quả khảo sát độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên vịt con…………………………………………...71 4.3.2.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% trên vịt con……………………...71 4.3.2.2 Khảo sát thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ virus khác nhau…………………………………………………………………..72 4.3.2.3 Khảo sát triệu chứng lâm sang ở vịt thí nghiệm ……………………...74 4.3.2.4 Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thí nghiệm qua mổ khám ………...76 4.3.2.5 Khảo sát bệnh tích vi thể trên vịt thí nghiệm …………………………79 4.4 Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng công nghệ tạo kháng thể IgY ở gà mái…………………………...83 4.4.1 Kết quả phân tích hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái………............................................................................................83 4.4.2 Mối tương quan giữa hàm lượng kháng thể IgY trong máu gà và trong trứng gà sau khi gây miễn dịch…………………………………………90 4.4.3 Trích ly kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp tủa phân đoạn muối Amonium sulphat 40%................................................91 4.4.4 Khảo sát độc tính của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà đối với tế bào xơ phôi vịt và tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 trên tế bào xơ phôi vịt………………………………………93 4.4.4.1 Kết quả xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của virus viêm gan vịt type I genotype 3……………………………….....93 vii 4.4.4.2 Kết quả xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ đối với tế bào xơ phôi vịt……………………………………………………94 4.4.4.3 Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ trước khi gây nhiễm………......................................................................................96 4.4.4.4 Hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ờ 24 giờ sau khi gây nhiễm……………………………………………………………..97 4.4.5 Ứng dụng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3………………………………..99 4.4.5.1 Kết quả xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của dịch kháng thể IgY lòng đỏ………………………………………………99 4.4.5.2 Kết quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên vịt con 3 ngày tuổi…………………………………………………………………...101 4.4.5.3 Kết quả trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY long đỏ trên vịt con 3 ngày tuổi………………...102 Chương 5. Kết luận và đề nghị…………………………………………….106 5.1 Kết luận………………………………………………………………….106 5.2 Đề nghị…………………………………………………………………..106 Tài liệu tham khảo………………………………………………………….108 Phụ lục……………………………………………………………………… viii DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Số lượng mẫu thu thập ở 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long…………………………………………………...... 30 Bảng 3.2 Các trình tự mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR…...... 33 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm vịt…………......... phôi 36 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm trên vịt con……………….. 37 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch gà mái………………... 39 Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt của kháng thể IgY…………………………………............... 45 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 4.1 gây nhiễm trên Bố trí thí nghiệm phòng bệnh do virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng kháng thể IgY lòng đỏ và kháng thể K.T.V…………………………………………………… Bố trí thí nghiệm trị bệnh do virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng kháng thể IgY lòng đỏ và kháng thể K.T.V…………………………........................................ Kết quả phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt trên phôi vịt ............................................................................................ 47 49 52 Bảng 4.2 Tỷ lệ dương tính của các type virus viêm gan vịt…......... Bảng 4.3 So sánh tỷ lệ % tương đồng về nucleotide và axít amin của 10 chủng DHAV-3 phân lập được với các chủng khác trong Ngân hàng gen Thế giới …………………… 62 Bảng 4.4 Tỷ lệ phôi vịt chết ở các nồng độ virus khác nhau……... 66 Bảng 4.5 Thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ của huyễn dịch virus ………………………………………………. 68 Bảng 4.6 Tần suất xuất hiện bệnh tích trên phôi vịt thí nghiệm….. 69 Bảng 4.7 Tỷ lệ vịt con chết ở các nồng độ virus khác nhau…........ 71 Bảng 4.8 Thời gian vịt chết trung bình theo nồng độ huyễn dịch virus ……………………………………………………. 73 Tần suất xuất hiện triệu chứng ở vịt thí nghiệm ……….. 75 Bảng 4.9 ix 56 Bảng 4.10 Tần suất xuất hiện bệnh tích ở vịt trong thí nghiệm……. 78 Bảng 4.11 Hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo tuần liều kháng nguyên 104ELD50 /ml………………….. 83 Hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo tuần liều kháng nguyên 106ELD50/ml…………………... 85 Hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo tuần liều kháng nguyên 108ELD50 /ml…………………. 86 So sánh hiệu giá kháng thể IgY trung bình trong huyết thanh gà mái qua các thí nghiệm ………………………. 99 Bảng 4.12 Bảng 4.13 Bảng 4.14 Bảng 4.15 Bảng 4.16 Bảng 4.17 Bảng 4.18 Bảng 4.19 Bảng 4.20 Bảng 4.21 Bảng 4.22 Hiệu giá kháng thể IgY trong máu và trong trứng gà sau khi gây miễn dịch……………………………………….. 90 Tỷ lệ xuất hiện CPE do DHAV-3 gây ra theo nồng độ virus trên tế bào xơ phôi vịt…………………………….. 93 Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng độ pha loãng của dịch kháng thể IgY lòng đỏ……………... 95 Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng độ pha loãng của dịch kháng thể IgY lòng đỏ khi cấp 24 giờ trước khi gây nhiễm DHAV-3……………………… 96 Giá trị OD và tỷ lệ tế bào sống trung bình ở các nồng độ pha loãng của dịch kháng thể IgY lòng đỏ khi cấp 24 giờ sau khi gây nhiễm DHAV-3……………………….. 98 Tỷ lệ phôi vịt chết qua các nồng độ pha loãng dịch kháng thể IgY ………..………………………………… 100 Hiệu quả phòng bệnh DHAV-3 bằng dịch kháng thể IgY ……………………………....................................... 101 Hiệu quả trị bệnh virus viêm gan vịt type I genotype 3 bằng kháng thể IgY ………………………………….. 103 x DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Vịt bị co giật do nhiễm virus viêm gan vịt type I………. 6 Hình 2.2 Bệnh tích gan vịt xuất huyết do nhiễm virus viêm gan vịt type I…………............................................................ 7 Hình 2.3 Hình ảnh vi thể gan vịt nhiễm virus viêm gan vịt type I. 8 Hình 2.4 Mô hình cấu trúc không gian của Picornavirus 10 Hinh2.5 Trật tự sắp xếp các gen trong hệ gen virus viêm gan vịt nhóm A ………………………………………………… 11 Hình 2.6 So sánh cấu trúc phân tử IgG của thỏ và IgY của gà…… 19 Hình 3.1 Sơ đồ phân lập và định danh virus 30 Hình 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định liều TCID50/0,1ml………...... 35 Hình 3.3 Bố trí thí nghiệm xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY lòng đỏ đối với tế bào xơ phôi vịt……………… 42 Bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 của dịch kháng thể IgY lòng đỏ trên tế bào xơ phôi vịt ở 24 giờ trước khi gây nhiễm ……………………………………. 43 Lớp tế bào xơ phôi vịt sơ cấp bình thường, quan sát dưới kính hiển vi soi ngược ở độ phóng đại 100X…………………………………………………..... 55 Tế bào co tròn, quan sát dưới kính hiển vi soi ngược ở độ phóng đại 100X sau 24 giờ nuôi cấy virus………………………………………………… 55 Hình 4.3 Phổ điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1,5%..... 56 Hình 4.4 Một đoạn giản đồ giải trình tự thành phần nucleotide chuỗi gen của một chủng virus viêm gan vịt type I genotype 3………………………………………………. 59 Hình 4.5 Mối liên hệ phả hệ giữa các chủng DHAV-3 phân lập với các chủng DHAV-3 khác trong Ngân hàng gen Thế giới……………………………………………………… 63 Hình 4.6 Gan phôi vịt 15 ngày tuổi có màu vàng cam ………….. 70 Hình 4.7 Da phôi vịt 15 ngày tuổi xuất huyết, phôi tích nước ….. 70 Hình 3.4 Hình 4.1 Hình 4.2 xi Hình 4.8 Phôi vịt 16 ngày tuổi có cơ tim nhạt màu……………… 70 Hình 4.9 Vịt 1 ngày sau khi gây nhiễm có triệu chứng khô chân, ít đi lại……………………………………………...... 76 Hình 4.10 Gan vịt 5 ngày tuổi sưng, xuất huyết................................ 79 Hình 4.11 Túi mật vịt 5 ngày tuổi căng phồng.................................. 79 Hình 4.12 Tế bào gan vịt bình thường …………................................ 80 Hình 4.13 Tế bào gan vịt sau khi nhiễm virus ………….................. 80 Hình 4.14 Mạch máu, tế bào gan vịt sau khi nhiễm virus ................ 81 Hình 4.15 Ống dẫn mật vịt nhiễm virus viêm gan ………………… 81 Hình 4.16 Thận vịt nhiễm virus viêm gan …………........................ 82 Hình 4.17 Tiều cầu thận: ống lượn bị thoái hóa ............................... 82 Hình 4.18 Tế bào chất của ống lượn gần bị thoái hóa, tế bào bị hoại tử ………………………………………………….. 83 Biểu đồ mô tả hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo tuần với liều 104ELD50 /ml............................ 84 Biểu đồ mô tả hiêu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo tuần với liều 106ELD50 /ml............................ 85 Biểu đồ mô tả hiệu giá kháng thể IgY trong huyết thanh gà mái theo tuần với liều 108ELD50 /ml............................ 87 Các lớp tế bào xơ phôi vịt dưới tác dụng bảo vệ của dịch kháng thể IgY lòng đỏ với các độ pha loãng khác nhau trong thí nghiệm trị bệnh và mật độ quang trên đĩa nuôi cấy sau khi nhuộm MTT................................................... 99 Hình 4.19 Hình 4.20 Hình 4.21 Hình 4.22 xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt ANOVA AS BLAST CC50 cDNA CFU CO2 CPE DAstV DEF ddNTP DHAV DHV DMEM DMSO DPBS DPV EDTA ELD50 ELISA Fab FBS Fc FCS ĐBSCL ĐC HGKT G IRES IgA IgG IgM IgY KT LD50 MEGA Nguyên chữ Analysis of variance Ammonium sulfate Basic local alignment search tool Cytotoxic Concentration 50% Complementary deoxyribonucleic acid Colony-Forming Unit Carbon dioxit Cytopathic effect Duck Astrovirus Duck Embryo Fibroblast Dideoxynucleotide triphosphates Duck hepatitis A virus Duck hepatitis virus Dulbecco’s Modified Eagle’s medium Dimethy Sulfoxide Dulbecco’s phosphate buffered saline Duck Picornavirus Ethylene diamine tetra acetic acid Embryo lethal dose 50% Enzyme Linked-immunosorbent assay Antigen binding fragment Foetal bovine serum Crystalized fragment Fetal calf serum Đồng bằng sông Cửu Long Đối chứng Hiệu giá kháng thể Guanine Internal Ribosome Entry Site Immunoglobulin A Immunoglobulin G Immunoglobulin M Yolk Immunoglobulin Kháng thể Lethal dose 50% Molecular evolutionary geneties analysis xiii MEM MTDT MTPL MTTT NaCl NCBI ORF OIE OD PAGE PBS PCR PD50 Protein L RNA RT SDS SFV SN TAE TCID50 Tm YDS IU UTR UV VPg Minimum essential medium Môi trường duy trì Môi trường pha loãng Môi trường tăng trưởng Natri clorua National Center Biotechnology Information Open Reading Frame Office international des epizootics Optical density Polyacrylamide gel electrophoresis Phosphate buffered saline Polymerase chain reaction Protection dose 50% Leader protein Ribonucleic acid Reverse transcriptase Sodium dodecyl sulphate Semliki Forest virus Serum Neutralization Tris-acetate-EDTA Tissue culture infectious dose 50% Melting temperature Sialyloligosaccharides International Unit Untranslated Region Ultraviolet Viral Protein genome linked xiv TÓM TẮT Đề tài: “Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long và sản xuất kháng thể phòng bệnh” được thực hiện bằng cách phân lập virus viêm gan vịt từ các ổ dịch ngoài tự nhiên ở 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Kiên Giang, Hậu Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long và Trà Vinh). Virus được nuôi cấy trên môi trường phôi vịt và cấy truyền trên môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp, ứng dụng kỹ thuật PCR với 4 cặp mồi để phát hiện được virus viêm gan vịt type I genotype 1, type I genotype 2, type I genotpye 3 và type II. Độc lực và tính gây bệnh của virus viêm gan vịt type I genotype 3 chủng DHAV-3-HG2 được khảo sát trên phôi vịt và vịt con 3 ngày tuổi. Chủng virus này được sử dụng để sản xuất kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà và thử nghiệm phòng, trị bệnh cho vịt con 3 ngày tuổi. Kết quả cho thấy: Phân lập 92 mẫu huyễn dịch bệnh phẩm qua môi trường phôi vịt, có 78 mẫu gây chết phôi, chiếm tỷ lệ 84,8%. Bệnh phẩm thu từ 78 trứng chết phôi tiếp tục nuôi cấy trên môi trường tế bào cho thấy, tất cả các mẫu đều gây bệnh tích tế bào. Kết quả định danh virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật RT-PCR cho thấy có 56/78 (71,79%) chủng virus phát hiện là virus viêm gan vịt type I genotype 3 (DHAV-3). Tỷ lệ dương tính DHAV-3 ở các tỉnh Kiên Giang, Hậu Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh lần lượt là 84,2% (16/19), 81,8% (18/22), 57,1% (8/14), 60% (6/10), 61,5% (8/14). Không phát hiện được virus viêm gan vịt type I genotype 1, genotype 2 và virus viêm gan vịt type II từ các mẫu nghiên cứu. Mười chủng virus viêm gan vịt đại diện (DHAV-3-CT2, DHAV-3CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8) được giải trình tự nucleotide và phân tích di truyền, dựa vào đoạn gen khuếch đại từ nucleotide 2.841 đến 3.081. Kết quả cho thấy 10 chủng này có độ tương đồng cao về trình tự nucleotide (98-100%) và axít amin (97-100%) và có quan hệ rất gần gũi với các chủng DHAV-NT phân lập từ Miền Trung Việt Nam và DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905 phân lập từ Trung Quốc. Kết quả xác định độc lực và tính gây bệnh của chủng DHAV-3-HG2 trên phôi vịt và vịt con cho thấy, chủng virus này có độc lực cao, 108,17 ELD50/0,2ml và 103,3LD50/0,5ml. Thời gian gây chết phôi từ 18 - 78 giờ, trung bình là 24,8 ± 3,3 giờ. Phôi chết có bệnh tích đặc trưng như da phôi xuất huyết (100%), phôi còi cọc chậm phát triển (87%), gan sưng xuất huyết (78,3%), gan có màu vàng nhạt (21,8%), phôi phù tích nước (43,5%). Vịt con nhiễm bệnh biểu hiện triệu chứng điển hình như vịt ít hoặc không đi lại (77,3%); vịt bỏ ăn, ủ rũ (50,7%); trước khi chết vịt nằm nghiêng sườn hoặc co xv giật với tư thế đầu ngửa lên lưng (48%), thần kinh co giật (18,7%). Bệnh tích tập trung chủ yếu ở gan như gan sưng xuất huyết (100%); túi mật căng phồng (73,3%), lách sưng (63,3%). Kết quả quan sát bệnh tích vi thể cho thấy, xuất huyết bề mặt mô gan, tế bào gan bị hư hại, tế bào bạch cầu nhiều trong mô gan. Các mẫu thận: tiểu thể Malpighi bị teo nhỏ, tế bào ống lượn gần bị hoại tử. Kết quả gây tối miễn dịch cho gà mái đẻ bằng chủng DHAV-3-HG2 với 3 lần tiêm liều 108ELD50/ml, khoảng cách thời gian giữa các lần tiêm kháng nguyên là 14 ngày, gà cho đáp ứng miễn dịch tốt và ổn định với hiệu giá kháng thể IgY trong lòng đỏ đạt trung bình cao nhất đến 8,1log2. Hàm lượng IgY trong lòng đỏ trứng được xác định là 27 mg/ml và trung bình trong một trứng gà cho 63,9mg. Dịch kháng thể IgY được xác định có thể bảo vệ tế bào xơ phôi vịt khi gây nhiễm bằng virus viêm gan vịt type I genotype 3. Kết quả thử nghiệm phòng và trị bệnh cho thấy, kháng thể IgY lòng đỏ tiêm cơ ức hiệu quả hơn đường uống và liều 50PD50 có hiệu quả cao nhất trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus type I genotype 3 với tỷ lệ sống trong phòng và trị bệnh đạt trên 80% sau khi công cường độc. Kết quả nghiên cứu cho thấy virus viêm gan vịt type I genotype 3 lưu hành phổ biến nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long. Sản xuất thành công kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà kháng virus viêm gan vịt type I genotype 3 và bước đầu cho thấy hiệu quả cao trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus trong in vivo. Từ khóa: virus gây bệnh viêm gan vịt, genotype 3, đặc tính di truyền phân tử, đặc tính gây bệnh, kháng thể lòng đỏ, phòng và trị bệnh. xvi ABSTRACT A study on isolation and identification in duck hepatitis virus of some provinces in Mekong Delta and production of antibody for disease prevention was carried by isolation of duck hepatitis virus from field outbreaks in five provinces in Mekong Delta (Kien Giang, Hau Giang, Can Tho, Vinh Long, Tra Vinh). Viruses were cultured in duck embryo and duck embryo fibroblast, multiplex PCR with 4 primers to detect special genes of duck hepatitis viruses comprising type I genotype 1, type I genotype 2, type I genotype 3 and type II. Virulence and pathogenicity of duck hepatitis virus strain DHAV-3-HG2 ware examined in duck embryos and 3 day old ducklings. This strain was also used to produce egg yolk antibody and trials on disease prevention and treatment in 3 day old duckling by that antibody were carried out. The results showed that: Seventy eight out of 92 (84.8%) sample suspensions from internal organs of suspicious hepatitis ducklings which were cultured in duck embryo caused embryo dead. Seventy eight fluid of these death embryos were continuously inoculated in duck embryo fibroblast. All of cultured from78 embryo fluids showed CPE lesions. The results of identification duck hepatitis virus by RT-PCR showed that 56/78 (71.79%) virus strains identified were of type 1 genotype 3 duck hepatitis virus (DHAV-3). The DHAV-3 positive rates in Kien Giang, Hau Giang, Can Tho, Vinh Long and Tra Vinh provinces were 84.2% (16/19), 81.8% (18/22), 57.1%(8/14), 60%(6/10 ), 61.5%(8/14). Duck hepatitis viruses of type 1 genotype 1, genotype 2 and type 2 were not detected from these testing samples. Ten representative strains (DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8) were sequenced and genetically analysed, which based on gene from 2.841 nucleotide to 3.081 nucleotide. The results showed that they were highly homologous on nucleotide (98-100%) and amino acid (97-100%) sequences, and had close relationships with strains DHAV-NT which were isolated in Viet Nam and DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905 which were isolated in China. The results of virulence and pathogenicity examination from strain (HG2) in duck embryo and duckling showed this strain had high virulence, 108.17 ELD50/0.2ml and 103.3LD50/0.5ml. Embryo death time was 18-78h, average embryo death time was 24.8 ± 3.3h. Death fetuses showed typical lesions such as hemorrhagic skin (100%), stunted embryos (87%), vinflamed and hemorrhagic liver (78.3%), pale yellow liver (21.8%), edema fetus (43.5%) and pale heart muscle (21.8%). Ill ducklings showed typical symptoms such as reluctant to move (77.3%), anorexa and suppression (50.7%). Before death, ducks convulsed with head on the back position (48%), convulsion (18.7%). The gross lesions were mainly concentrated in the liver such as hemorrhagic liver (100%), swollen gall bladder (73.3%), swollen spleen (63.3%). Microscopic examination showed hemorrhage in hepatic tissue surface hemorrhage, damage in hepatic tissues, lot of white blood cells in liver tissues, atrophy Malpighi tube, necrotic proximal tubules. xvii Hyper-immune to laying hens by strain DHAV-3-HG2 with three inoculation of 108ELD50/ml for each triggered maximum immune response and stable antibody level with antibody titers 8.1log2. Each ml of egg yolk contained 27 mg IgY, each egg contained average 63.9mg IgY antibodies. IgY antibody fluid was determined to be able to protect DEFs from DHAV-3HG2 challenging. The results of prevention and treatment trials showed that produced IgY antibodies were effective with percentage of protection of 93.3% by chest intramuscular inoculation and 86.7% by oral route, and the dose of 50 PD50 showed highest effectiveness in both duck hepatitis prevention and treatment caused by DHAV-3 with 80% challenging ducks protected. The study results showed that duck hepatitis virus type 1 genotype 3 was the most common type circulating in Mekong delta. IgY antibodies against DHV virus type 1 genotype 3 were successfully produced from chicken yolk sacs and initially showed efficiency in prevention and treatment of duck virus hepatitis in vivo. Key words: duck hepatitis virus, genotype 3, molecular characterization, pathogenic property, egg yolk antibody, prevention and treatanenh xviii