Tài liệu Luận án tiến sĩ nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ XUÂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC, QUY TRÌNH NHÂN GỐNG IN VITRO VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY GỪNG BẢN ĐỊA Ở BẮC KẠN (GỪNG ĐÁ) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ XUÂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC, QUY TRÌNH NHÂN GỐNG IN VITRO VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU CÂY GỪNG BẢN ĐỊA Ở BẮC KẠN (GỪNG ĐÁ) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đặng Trọng Lƣơng 2. TS. Đỗ Tuấn Khiêm HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam Ďoan Ďây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa Ďược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Vũ Xuân Dƣơng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Ďốc Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, các thầy cô giáo và Ban Ďào tạo sau Ďại học Ďã tạo Ďiều kiện giúp Ďỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Phó Giáo sư, Tiến sĩ Đặng Trọng Lương và Tiến sĩ Đỗ Tuấn Khiêm Ďã tận tình hướng dẫn, Ďộng viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao Ďổi và Ďịnh hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, nghiên cứu viên Bộ môn Kĩ thuật di truyền - Viện Di truyền nông nghiệp; Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam; Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên; Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam; Phòng thí nghiệm trọng Ďiểm về bảo tồn và sử dụng tài nguyên thực vật, Phòng thí nghiệm trọng Ďiểm thực vật số tỉnh Quảng Đông, Vườn thực vật Nam Trung Quốc, Viện Hàn lâm khoa học Trung Quốc, Quảng Châu, Trung Quốc; Trung tâm Công nghệ sinh học – Trường Đại học Hùng Vương, Ďã tạo Ďiều kiện và giúp Ďỡ tôi tiến hành nghiên cứu cũng như chia sẻ những kinh nghiệm Ďể hoàn thành bản luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia Ďình, bạn bè, Ďồng nghiệp của tôi Ďã Ďộng viên và truyền nhiệt huyết Ďể tôi hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2019 Nghiên cứu sinh Vũ Xuân Dƣơng ii MỤC LỤC Lời cam Ďoan ................................................................................................................... i Lời cảm ơn ......................................................................................................................ii Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................vi Danh mục bảng........................................................................................................... viii Danh mục hình ............................................................................................................... x MỞ ĐẦU........................................................................................................................ 1 1. Tính cấp thiết của Ďề tài............................................................................................. 1 2. Mục tiêu của luận án .................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của Ďề tài ................................................... 3 4. Những Ďóng góp mới của luận án ............................................................................ 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 4 1.1. Khái quát chung về họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.).................................... 4 1.1.1. Vị trí phân loại .........................................................................................4 1.1.2. Đặc Ďiểm hình thái của cây Họ Gừng ....................................................4 1.2. Giới thiệu về cây gừng Bắc Kạn ......................................................................11 1.3. Tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học và phân loại cây họ Gừng .........13 1.3.1. Trên thế giới ..........................................................................................13 1.3.2. Ở Việt Nam ...........................................................................................15 1.4. Nghiên cứu về phân loại thực vật dựa trên trình tự gen.............................17 1.4.1. Giới thiệu về vùng ITS-rDNA (Internal transcribed spacer) ...............17 1.4.2. Giới thiệu về vùng matK (maturaseK) .................................................18 1.4.3. Một số nghiên cứu phân loại thực vật dựa trên trình tự gen ................18 1.5. Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây họ Gừng.............................25 1.5.1. Trên thế giới ..........................................................................................25 1.5.2. Ở Việt Nam ..........................................................................................29 1.6. Một số nghiên cứu về tinh dầu cây họ Gừng .................................................33 iii 1.6.1. Trên thế giới ..........................................................................................33 1.6.2. Ở Việt Nam ...........................................................................................34 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...36 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................36 2.2. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................36 2.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................37 2.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................38 2.4.1. Phương pháp phân loại dựa vào Ďặc Ďiểm hình thái ............................38 2.4.2. Phương pháp phân loại thực vật dựa trên trình tự gen .........................38 2.4.3. Phương pháp nuôi cấy mô ....................................................................43 2.4.4. Đặc Ďiểm sinh trưởng phát triển cây có nguồn gốc in vitro.................49 2.4.5. Phương pháp phân tích sinh hóa ...........................................................50 2.4.6. Phương pháp phân tích hoạt tính kháng vi sinh vật .............................52 2.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. ...................................................................54 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...........................55 3.1. Vị trí phân loại cây gừng Bắc Kạn ..................................................................55 3.1.1. Đặc Ďiểm sinh học của cây gừng Bắc Kạn ...........................................55 3.1.2. Phân loại dựa vào Ďặc Ďiểm hình thái. ..................................................57 3.1.3. Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự gen ITS và gen matK ........62 3.2. Nhân giống gừng Bắc Kạn bằng công nghệ nuôi cấy lớp mỏng................72 3.2.1. Tạo mẫu sạch in vitro ............................................................................72 3.2.2. Tạo callus từ lát cắt chồi .......................................................................75 3.2.3. Tái sinh chồi từ callus ...........................................................................76 3.2.4. Nhân chồi in vitro..................................................................................78 3.2.5. Tái sinh rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro .................................................83 3.2.6. Giai Ďoạn ra ngôi ...................................................................................86 3.2.7. Quy trình nhân nhanh gừng Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng.....94 iv 3.3. Đặc điểm nông sinh học cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô .........................98 3.3.1. Động thái tăng trưởng chiều cao cây ....................................................98 3.3.2. Động thái ra lá .................................................................................... 100 3.3.3. Động thái Ďẻ nhánh ............................................................................. 101 3.3.4. Một số yếu tố cấu thành năng suất giống gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô ...... 102 3.4. Thành phần hóa học tinh dầu cây gừng Bắc Kạn ......................................106 3.4.1. Kết quả tách chiết tinh dầu................................................................. 106 3.4.2. Thành phần hóa học tinh dầu ............................................................. 107 3.5. Khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu chiết xuất từ cây gừng Bắc Kạn .....................................................................................................................111 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................115 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..117 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................118 PHỤ LỤC..................................................................................................................................133 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid ABI Applied biosystems incorporated AFLP Amplified fragment length polymorphism BAP 6-Benzylaminopurin BLAST Basic local alignment search tool bp Base pair cpDNA Chloroplast DNA CTAB Cetyltrimethyl ammoium bromide CT Công thức DNA Deoxyribonucleic acid DNAse Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribounucleotide triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate ĐHST Điều hòa sinh trưởng EDTA Ethylenediamine tetraacetate GC-MS Gas chromatography mass spectometry (Phương pháp sắc ký ghép khối phổ) GĐ Gừng Ďá IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole butyric acid ITS Internal transcribed spacer Kin Kinetin matK Maturase K ML Maximum Likehood MS Murashige and Skoog (Môi trường MS, 1962) vi µM Micromol (nồng Ďộ phần triệu mol/l) NAA 1-Naphthaleneacetic acid (Axit 1-Naphthaleneaxetic) NCBI National center for biotechnology information Nu Nucleotide ND Nước dừa ORF Open reading frame (khung Ďọc mở) PCR Polymerase chain reaction RAPD Random amplified polymorphic DNA rbcL Ribulose-bisphosphate carboxylase RFLP Restriction fragment length polymorphism RNA Riboucleic acid RNAse Ribonuclease SSR Simple Sequence Repeates Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA TDZ Thidiazuzon vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách mẫu gừng Bắc Kạn sử dụng trong nghiên cứu ......... 36 Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng cho tách DNA tổng số ................................... 39 Bảng 2.3. Trình tự các mồi ITS và matK .................................................... 40 Bảng 2.4. Các thành phần có trong phản ứng khuếch Ďại vùng ITS và matK... 41 Bảng 2.5. Chu kì nhiệt khuếch Ďại vùng ITS và matK ............................... 41 Bảng 3.1. Một số tính trạng Ďặc trưng của gừng Bắc Kạn .......................... 55 Bảng 3.2. So sánh hình thái loài Alpinia coriandriodora và A. bambusifolia................................................................................ 61 Bảng 3.3. Kết quả Ďo quang phổ DNA tổng số bằng máy NanoDrop Lite Spectrophotometer............................................................... 62 Bảng 3.4. Mức Ďộ tương Ďồng giữa trình tự gen ITS của mẫu gừng Bắc Kạn (mẫu GD01LT) và một số loài trong chi Alpinia ................ 65 Bảng 3.5. Hiệu quả khử trùng của các công thức sử dụng NaOCl 2,5% .... 73 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ và 2,4D Ďến khả năng tái sinh tạo callus của lát cắt chồi (sau 8 tuần nuôi cấy). .............................. 75 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tổ hợp chất Ďiều hòa sinh trưởng BAP và Vitamin B1 Ďến khả năng tái sinh chồi từ callus (sau 8 tuần nuôi cấy)...................................................................................... 77 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin Ďến khả năng nhân nhanh chồi gừng Bắc Kạn (sau 4 tuần nuôi cấy) ........................ 79 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa Ďến hiệu quả nhân chồi (sau 4 tuần nuôi cấy) ................................................................... 81 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của môi trường MS và α-NAA Ďến khả năng tái sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh (sau 6 tuần nuôi cấy) ................... 83 Bảng 3.11. Sinh trưởng và phát triển của cây con (sau 30 ngày ra ngôi) trên các công thức giá thể ........................................................... 86 viii Bảng 3.12. Hàm lượng nước và hàm lượng chất khô trong mô thân, lá cây gừng Bắc Kạn thời kì ra ngôi ............................................... 89 Bảng 3.13. Động thái tăng trưởng chiều cao cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô .. 99 Bảng 3.14. Động thái ra lá của cây ............................................................. 100 Bảng 3.15. Động thái Ďẻ nhánh của cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô ......... 102 Bảng 3.16. Một số yếu tố cấu thành năng suất giống gừng Bắc Kạn. ........ 103 Bảng 3.17. Lượng tinh dầu thu Ďược từ cây nuôi cấy mô 01 năm tuổi ...... 106 Bảng 3.18. Thành phần hóa học của tinh dầu các mẫu nghiên cứu ............ 108 Bảng 3.19. Hàm lượng các chất chính có trong tinh dầu các mẫu nghiên cứu.. 110 Bảng 3.20. Khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của tinh dầu gừng Bắc Kạn nguồn gốc nuôi cấy mô ..................................................... 112 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Đặc Ďiểm hình thái cây Riềng (Alpinia officinarum) ................... 7 Hình 1.2. Đặc Ďiểm hình thái cây Gừng (Zingiber officinarum) .................. 9 Hình 1.3. Cây gừng Bắc Kạn trong Ďiều kiện tự nhiên .............................. 11 Hình 1.4. Sơ Ďồ vùng rDNA- ITS ............................................................... 17 Hình 1.5. Cây phát sinh chi Alpinia Ďược dựng bằng phương pháp ML từ khối dữ liệu kết hợp của matK và ITS. .................................. 22 Hình 2.1. Chồi mới tái sinh từ cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh Ďược sử dụng làm vật liệu ban Ďầu ........................................................... 37 Hình 2.2. Sơ Ďồ chưng cất thu tinh dầu ...................................................... 51 Hình 3.1. Đặc Ďiểm hình thái loài gừng Bắc Kạn (Gừng Ďá) ..................... 56 Hình 3.2. Đặc Ďiểm phân loại loài gừng Bắc Kạn Alpinia coriandriodora .. 58 Hình 3.3. Bản Ďồ phân bố loài Alpinia coriandriodora D.Fang................. 59 Hình 3.4. Tiêu bản loài A. bambusifolia và A. coriandriodora .................. 61 Hình 3.5. Sản phẩm PCR với cặp mồi matK-F/R và ITS-F/R ................... 63 Hình 3.6. Kết quả alignment gen ITS ......................................................... 64 Hình 3.7. Sơ Ďồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa loài A. coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ liệu kết hợp của vùng gen ITS. ................................................... 67 Hình 3.8. Kết quả alignment gen matK ...................................................... 68 Hình 3.9. Sơ Ďồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa loài A. coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ liệu kết hợp của vùng gen matK. ................................................ 70 Hình 3.10. Sơ Ďồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa loài A. coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ liệu kết hợp của matK và ITS (A), và vị trí phát sinh loài của Alpinia coriandriodora trong chi Alpinia (B) ............................ 71 x Hình 3.11. Callus hình thành từ lát cắt chồi non trên môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l TDZ và 1mg/l 2,4D (A), 3mg/l 2,4D (B), 4mg/l 2,4D (C), sau 8 tuần nuôi cấy ........................................... 76 Hình 3.12. Chồi tái sinh từ callus của gừng Bắc Kạn sau 8 tuần nuôi cấy .. 77 Hình 3.13. Hình thái chồi trên môi trường khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy .. 82 Hình 3.14. Hình thái rễ trên các môi trường thí nghiệm sau 6 tuần nuôi cấy .. 84 Hình 3.15. Hình thái cây hoàn chỉnh sau 6 tuần nuôi cấy ............................ 85 Hình 3.16. Hình thái chồi gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô giai Ďoạn sau 30 ngày ra ngôi tại Phú Thọ ............................................................. 88 Hình 3.17. Hàm lượng sắc tố quang hợp trong mô lá cây gừng Bắc Kạn thời kì ra ngôi .............................................................................. 91 Hình 3.18. Huỳnh quang diệp lục lá cây gừng Bắc Kạn thời kì ra ngôi ex vitro......92 Hình 3.19. Hoạt Ďộ catalase cây gừng Bắc Kạn thời kì ra ngôi ................... 94 Hình 3.20. Quy trình nhân giống loài gừng Bắc Kạn (A. coriandriodora) bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng................................................ 95 Hình 3.21. Mô hình trồng gừng nuôi cấy mô (01 năm tuổi) tại Tp. Việt Trì, tỉnh Phú Thọ............................................................................... 104 Hình 3.22. Mô hình trồng gừng nuôi cấy mô (02 năm tuổi) tại Tp. Việt Trì, tỉnh Phú Thọ .............................................................................. 105 xi MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Họ Gừng (Zingiberaceae) là một họ thảo mộc sống lâu năm, bao gồm 45 chi và khoảng trên 1300 loài, phân bố ở các vùng nhiệt Ďới. Ở Việt Nam, họ Gừng có khảng 21 chi với trên 100 loài [6]. Trong số các nguồn gen gừng thu thập từ mọi miền trên toàn quốc, một số nguồn gen có giá trị dinh dưỡng cao, thích nghi tốt, có tiềm năng phát triển mở rộng sản xuất. Cây gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn (Gừng Ďá) Ďược xếp vào nhóm cây quý hiếm cần Ďược bảo tồn theo Quyết Ďịnh số 80/2005/QĐ-BNN ngày 05/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Gừng Ďá là loài bản Ďịa mang tính chất Ďặc sản của tỉnh Bắc Kạn, chúng Ďược phân bố nhiều ở các xã Liêm Thủy, Xuân Dương thuộc huyện Na Rì, tỉnh Bắc Kạn. Gừng Ďá Ďược Ďồng bào dân tộc (Tày, Nùng, Dao...) trồng từ lâu Ďời trên các nương rẫy, rừng núi Ďất Ďá xen kẽ v.v. Dưới tác Ďộng của các yếu tố tự nhiên (thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu...) của Ďịa phương nên Gừng Ďá có hương vị Ďặc biệt. Ruột củ màu vàng, có mùi thơm Ďặc trưng, khi giã củ vắt lấy nước làm phụ gia bảo quản thực phẩm Ďược tươi lâu, Ďặc biệt là trong việc chế biến lạp xường, một món ăn truyền thống và là Ďặc sản của vùng Bắc Kạn. Ngoài ra, Gừng Ďá còn Ďược người dân Ďịa phương sử dụng như là một loại dược liệu rất quý. Trong những năm gần Ďây, nhu cầu sử dụng Gừng Ďá của người dân Ďịa phương và du khách khi Ďến Bắc Kạn tăng cao, Ďặc biệt vào các dịp lễ tết, giá thành thường dao Ďộng từ 600 nghìn Ďến một triệu Ďồng/ 1kg tươi. Điều này dẫn Ďến việc khai thác ngày càng cạn kiệt nguồn gen Gừng Ďá mọc tự nhiên. Mặc dù hiệu quả kinh tế cao, nhưng hiện nay Gừng Ďá Ďược trồng chủ yếu theo kinh nghiệm, diện tích manh mún, nhỏ lẻ nên sản phẩm chưa mang tính hàng hóa, chưa có lượng giống Ďủ lớn Ďể phát triển thành vùng trồng tập 1 trung. Việc nhân và giữ giống vẫn theo kinh nghiệm của người dân, do vậy củ giống không Ďảm bảo về chất lượng, nhiễm bệnh nhiều và dần thoái hóa. Hơn nữa, hiện nay tên khoa học của loài này chưa Ďược xác Ďịnh cụ thể. Do Ďặc Ďiểm hình thái của cây có nhiều Ďặc Ďiểm giống với cây gừng thường (Zingiber officinarum Roscoe) nên hiện Ďược xếp vào chi Gừng (Zingiber), tên khoa học trong Quyết Ďịnh số 80/2005/QĐ-BNN là “Zingiber sp.”. Vì vậy, việc Ďịnh danh chính xác tên khoa học, vị trí phân loại của nguồn gen gừng Bắc Kạn là cần thiết nhằm tạo cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen thực vật quý này. Đồng thời, việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây gừng Bắc Kạn có thể tạo ra số lượng cây giống lớn, chất lượng Ďồng Ďều, sạch bệnh, và là tiền Ďề Ďể phát triển cây gừng Bắc Kạn theo hướng hàng hóa Ďặc sản vùng miền, mang lại lợi ích kinh tế thực sự và lâu bền cho người dân nhằm phát triển kinh tế vùng, kinh tế Ďịa phương. Xuất phát từ lý luận và thực tiễn nêu trên, nhằm tạo cơ sở dữ liệu về Ďặc Ďiểm sinh học phục vụ cho công tác Ďịnh danh, bước Ďầu xác Ďịnh thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu Ďược từ cây gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn, Ďồng thời xây dựng quy trình nhân nhanh từ lát cắt chồi, áp dụng vào việc tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho người dân, chúng tôi lựa chọn Ďề tài: “Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây gừng bản địa ở Bắc Kạn (Gừng đá) ”. 2. Mục tiêu của luận án Xác Ďịnh tên khoa học loài gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn, xây dựng quy trình nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô từ lát cắt chồi, bước Ďầu xác Ďịnh thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu Ďược từ cây có nguồn gốc tự nhiên và cây nuôi cấy mô, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen gừng bản Ďịa Bắc Kạn. 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp các dẫn liệu khoa học về Ďặc Ďiểm hình thái, tên khoa học, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu Ďược từ cây gừng Bắc Kạn có nguồn gốc tự nhiên và cây nuôi cấy mô; Cung cấp dẫn liệu khoa học về khả năng nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô từ lát cắt chồi loài gừng Bắc Kạn, là cơ sở Ďể bảo tồn và khai thác nguồn gen có giá trị. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của Ďề tài góp phần làm sáng tỏ vị trí phân loại của cây gừng Bắc Kạn từ Ďó mở ra các hướng cho các nghiên cứu tiếp theo; Quy trình nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào Ďược áp dụng vào thực tiễn tạo ra số lượng lớn cây giống Ďồng Ďều, sạch bệnh, tạo Ďiều kiện thuận lợi cho việc mở rộng quy mô phát triển loài gừng Bắc Kạn. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình Ďầu tiên nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về tên khoa học và vị trí phân loại loài gừng bản Ďịa ở Bắc Kạn dựa vào Ďặc Ďiểm hình thái và trình tự Ďoạn gen Ďặc trưng ITS (Internal Transcribed Spacer) và gen matK (gen mã hóa cho maturaseK). Xây dựng Ďược quy trình nhân giống nguồn gen gừng Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng, góp phần tạo ra số lượng lớn cây giống Ďồng Ďều, sạch bệnh. Kết quả luận án Ďã bước Ďầu xác Ďịnh Ďược thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu thu Ďược từ cây gừng Bắc Kạn có nguồn gốc tự nhiên và cây nuôi cấy mô. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát chung về họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.) 1.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của J. Kress et al, 2002 [78] và Nguyễn Quốc Bình, 2011 [6], vị trí phân loại cây họ Gừng (Zingiberaceae) trong giới thực vật như sau: Giới Thực vật (Plante) Ngọc lan (Magnoliophyta) Ngành Lớp Loa kèn (Liliopsida) Phân lớp Bộ Loa kèn (Liliidae) Gừng (Zingiberales) Họ Gừng (Zingiberaceae) Hiện nay trên thế giới họ Gừng (Zingiberaceae) có 45 chi, 1300 loài, phân bố ở vùng nhiệt Ďới. Tại Việt Nam hiện có 21 chi với trên 100 loài (Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, 2017). 1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây Họ Gừng 1.1.2.1. Đặc điểm chung cây Họ Gừng Theo Nguyễn Quốc Bình (2011), cây Họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.) có một số Ďặc Ďiểm chung như sau: [6]. Dạng sống: Họ Gừng (Zingiberaceae) gồm những cây thân thảo sống nhiều năm. Mọc nơi Ďất ẩm, nơi sáng, dưới tán rừng hay vách Ďá ẩm, hiếm khi phụ sinh (Cautleya gracilis, Hedychium poilanii). Thân cây do các bẹ lá ôm chặt lấy nhau tạo thành thân giả. Thân giả to, cao 1-3-4(-5) m hay mảnh, cao dưới 1m hoặc rất ngắn hay không có do các bẹ lá rời Ďến gốc 4 (Distichochlamys, Kaempferia…), thân giả không phân nhánh. Rễ nhỏ, hình sợi, Ďôi khi Ďầu rễ phình to lên thành dạng củ (Curcuma, Kaempferia, Stahlianthus…). Cây thường có mùi thơm, Ďôi khi có mùi hắc như một số loài trong chi Zingiber, Alpinia, ... Lá: Lá của các loài cây thuộc họ Gừng là lá Ďơn, mọc cách, xếp thành hai hàng, thường hướng lên trên. Kích thước và hình dạng lá biến Ďổi, Ďôi khi phiến lá tiêu giảm thành bẹ lá dạng vảy. Lá gồm các phần: bẹ lá, cuống lá, lưỡi lá, phiến lá: Bẹ lá mở Ďến gốc và ôm chặt lấy nhau thành thân giả (hay còn gọi là thân khí sinh). Cuống lá là phần giữa bẹ lá và phiến lá, có tiết diện ngang hình lòng máng nông hoặc sâu. Lá không cuống hay có cuống ngắn Ďến dài (từ 0,2-0,3 mm Ďến 15-20 cm, Ďôi khi Ďến 25 cm). Lưỡi lá là phần từ bẹ lá kéo dài lên. Lưỡi dày hay mỏng dạng màng, phía Ďầu nguyên, cụt ngang hay xẻ thành 2 thùy; Ďầu lưỡi hay Ďầu các thùy lưỡi nhọn hay tù; lưỡi dài 1-2 mm hay tới vài cm. Phiến lá hình trứng, hình bầu dục, hình bầu dục dài, hình mũi mác, ít khi gần tròn (Kaempferia elegans); gốc nhọn, hình nêm hay gần tròn; Ďầu thường nhọn, Ďôi khi thót nhỏ thành dạng Ďuôi, hiếm khi tròn. Lá bắc, lá bắc con - Lá bắc: Lá bắc hình trứng, hình trứng rộng, hình mũi mác, bao lấy lá bắc con và hoa, Ďôi khi bao lấy truyền thể (bulbil) (Globba). Các lá bắc dính với nhau ở nửa phía dưới làm thành dạng túi (Curcuma), hay dạng chuông (Stahlianthus) hoặc xếp lợp lên nhau (Hedychium, Zingiber,...). Đặc biệt trong chi Curcuma, các lá bắc bất thụ (không chứa hoa) ở phía dưới hay phía trên của cụm hoa, thường có màu sắc khác với lá bắc hữu thụ. Ở một số loài 1-2 lá bắc dưới cùng của cụm hoa phát triển rất to bao lấy cả cụm hoa khi non gọi là lá bắc tổng bao (nhưng sớm rụng) (Alpinia). - Lá bắc con: Đính giữa gốc lá bắc và bầu, bao lấy hoa. Lá bắc con mở Ďến gốc hay dạng ống. Đôi khi lá bắc con không có hoặc sớm rụng. 5 Cụm hoa: Cụm hoa dạng chùy, dạng chùm hay dạng bông, mọc ở các vị trí khác nhau: Cụm hoa mọc trên ngọn thân có lá gặp ở các chi như Alpinia, Hedychium,....Cụm hoa mọc từ thân rễ sát mặt Ďất, riêng với thân có lá gặp ở các chi như Amomum, Hornstedtia, Curcuma, Zingiber,....Cụm hoa mọc giữa các bẹ lá ở các chi Boesenbergia, Curcuma, Distichochlamys,....Đôi khi trong cùng một chi, cụm hoa mọc ở trên ngọn thân có lá và cả từ thân rễ (Zingiber), hay từ giữa các bẹ lá và từ thân rễ (Curcuma). Một số ít loài có cụm hoa xuất hiện trước lá hay xuất hiện Ďồng thời với chồi lá non (Curcuma). Cuống cụm hoa mọc từ thân rễ ở một số chi Ďược bao phủ bởi các bẹ lá dạng vảy lợp lên nhau nhiều hay ít, hay không lợp lên nhau (Amomum, Zingiber,...) Quả: Quả nang chẻ ô; Ďôi khi quả mọng, quả nạc; quả có lông hay không; quả có nhiều dạng khác nhau: + Hình tròn hay bầu dục, Ďường kính từ 0,3-0,4 cm Ďến 2-3 (4) cm, hiếm khi quả hình bầu dục có ngấn giữa (Alpinia galanga); hình thoi (Alpinia oxymitra) hay hình trứng hẹp (Amomum mengtzense). + Có gờ nổi hay có cánh dạng quả khế theo chiều dọc (Alpinia, Elettari, Elettariopsis, Amomum). + Trơn hay có lông, có gai mềm, gai phân nhánh hay không (Alpinia, Amomum) Hạt: Hình bầu dục, gần tròn hay có góc cạnh; màu Ďỏ, màu Ďen, nâu hay màu xám; có áo hạt mềm màu Ďen, trắng, hay Ďôi khi có màu Ďỏ; áo hạt rách không Ďều. 1.1.2.2. Đặc điểm chi Riềng – Alpinia Roxb. Chi Riềng - Alpinia Roxb. là một chi lớn thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), trên thế giới có khoảng 300 loài, phân bố ở vùng nhiệt Ďới và cận nhiệt Ďới châu Á, một số ít ở Ôxtrâylia và quần Ďảo Thái Bình Dương [8]. Ở Việt Nam chi Riềng hiện có 33 loài [8, 18]. 6 Hình 1.1: Đặc Ďiểm hình thái cây Riềng (Alpinia officinarum) (Nguồn ảnh: itmonline.org và http://www.botanyvn.com) Đặc điểm hình thái: Cây thảo cao 1-3 (4) m, thân rễ bò, dày. Lá nhiều, phiến lá hình bầu dục dài hay dạng mác, có cuống hay không. Cụm hoa dạng chùm hay bông, trên ngọn thân có lá, hoa Ďính thưa hay dày, cụm hoa khi non thường Ďược bao bởi 1-3 lá bắc (thường gọi là lá bắc tổng bao - nhưng sớm rụng). Các lá bắc (nếu có) mở Ďến gốc, bao một hoa hay vài hoa trong một cụm nhỏ (cincinnus); các lá bắc con dạng ống hay mở Ďến gốc, Ďôi khi không có. Đài hoa có phần dưới dạng ống, trên xẻ 1 bên hay chia 3 thùy nhỏ dạng răng. Tràng có phần dưới dạng ống, trên xẻ thành 3 thùy, thùy lưng thường to hơn hai thùy bên, Ďầu có dạng mũ nông hay sâu. Cánh môi to, có màu sặc sỡ, thường to rộng hơn các thùy tràng, phía Ďầu xẻ thành 2-3 thùy hay nguyên. Nhị có chỉ nhị dạng bản, ngắn hoặc dài; bao phấn 2 ô, phần phụ trung Ďới kéo dài lên phía trên thành mào hay không. Nhị lép bên 2, tiêu giảm thành dạng dùi, dạng răng hay tiêu giảm hoàn toàn. Bầu hình cầu hay gần hình cầu. Vòi nhụy mảnh, núm nhụy thường loe hình phễu, Ďôi khi có dạng chùy. Vòi nhụy lép ngắn, dạng bản hay dùi. Quả nang, hình cầu hay hình bầu dục, hiếm khi hình thoi (A. oxyphylla), tự mở hoặc mở không Ďều. Hạt nhiều, thường có góc cạnh, có áo hạt [8]. 7