Tài liệu Luận án tiến sĩ nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá nhân tố phiên mã zmdreb2a nhằm tăng cường tính chịu hạn ở một số

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ZmDREB2A NHẰM TĂNG CƯỜNG TÍNH CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM ́ ́ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2020 ̀ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ZmDREB2A NHẰM TĂNG CƯỜNG TÍNH CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Nông Văn Hải 2. TS. Bùi Mạnh Cường HÀ NỘI – 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của các Thầy và sự giúp đỡ tận tình của các đồng nghiệp Viện Nghiên cứu Ngô. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 07 năm 2020 TÁC GIẢ ĐOÀN THỊ BÍCH THẢO ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được cuốn luận án này, trong quá trình nghiên cứu và thực hiện, tôi luôn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các cơ quan, thầy cô, bạn bè đồng nghiệp và gia đình. Trước tiên, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Nông Văn Hải, TS. Bùi Mạnh Cường đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Giám đốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Lãnh đạo và tập thể cán bộ Ban Đào tạo sau đại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ngô đã tạo điều kiện thuận lợi, về vật chất, tinh thần trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ sinh học, Bộ môn Công nghệ gen, Phòng Khoa học HTQT đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng tri ân đối với những đồng nghiệp, gia đình và bạn bè là những điểm tựa tinh thần vững chắc, đã giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn và luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập của mình. Hà Nội, tháng 07 năm 2020 Đoàn Thị Bích Thảo iii MỤC LỤC MỤC LỤC ....................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... xii MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ......................................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu..............................................................................................................3 3. Đóng góp mới của luận án ........................................................................................................ 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án.............................................................. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................5 1.1. Tác động của hạn đến sinh trưởng và phát triển cây ngô .................................................5 1.1.1. Khái niệm hạn ........................................................................................................5 1.1.1.1. Hạn không khí .....................................................................................................5 1.1.1.2. Hạn đất ...............................................................................................................6 1.1.1.3. Hạn toàn diện .....................................................................................................6 1.1.2. Tác động của hạn đến sinh trưởng và phát triển cây ngô .....................................7 1.2. Ảnh hưởng của hạn đối với sản xuất ngô .........................................................................7 1.2.1. Ảnh hưởng của hạn đối với sản xuất ngô trên thế giới .........................................7 1.2.2. Ảnh hưởng của hạn đến sản xuất ngô ở Việt Nam ..............................................11 1.3. Tình hình nghiên cứu giống ngô chịu hạn ......................................................................... 14 1.3.1. Tình hình nghiên cứu, sử dụng giống ngô chịu hạn trên thế giới .......................14 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngô chịu hạn ở Việt Nam ..................................................16 1.4. Cơ chế sinh lý, sinh hóa liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật....................................17 1.4.1. Cơ chế phân tử trong phản ứng với hạn ở thực vật.............................................17 1.4.2. Vai trò của một số phân tử trong truyền tín hiệu điều hòa biểu hiện gen chịu hạn ở thực vật .......................................................................................................................19 1.5. Một số nhóm nhân tố phiên mã được quan tâm trong nghiên cứu chịu hạn.................21 1.5.1. Nhân tố phiên mã AREB/ABF .............................................................................22 1.5.2. Nhân tố phiên mã NAC ........................................................................................23 1.5.3. Nhóm nhân tố phiên mã bZIP ..............................................................................24 1.5.4. Nhân tố phiên mã AP2/ERF ................................................................................25 iv 1.5.5. Một số nghiên cứu về nhân tố phiên mã trong phản ứng hạn trên thực vật ở nước ta .26 1.6. Một số nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã Dreb2A trong phản ứng chịu hạn ở cây trồng .......................................................................27 1.7. Ứng dụng ngô biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam................................................ 33 1.7.1. Tiềm năng ứng dụng ngô biến đổi gen ................................................................33 1.7.2. Sử dụng ngô biến đổi gen trên thế giới ................................................................34 1.7.3. Nghiên cứu và sản xuất ngô biến đổi gen ở Việt Nam .........................................38 1.8. Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong phân tích cây chuyển gen............................................. 42 1.8.1. Chọn lọc thể chuyển gen bằng gen chỉ thị ............................................................42 1.8.2. Phân tích cây chuyển gen bằng các kỹ thuật sinh học phân tử ...........................43 1.8.2.1. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR ...................................................43 1.8.2.2. Phương pháp xác định số bản sao (copy) trong cây chuyển gen .....................44 1.8.2.3. Phân tích biểu hiện gen ....................................................................................45 1.8.3. Phương pháp phân tích sử dụng trong nhà lưới và đồng ruộng .........................45 1.8.3.1. Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển .................................................46 1.8.3.2. Phân tích đặc điểm di truyền và nhận biết thể đồng hợp tử của thế hệ sau .....46 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........48 2.1. Vật liệu..............................................................................................................................48 48 2.1.1. Vật liệu thực vật ................................................................................................... 2.1.2. Chủng vi sinh vật .................................................................................................48 2.1.3. Vector và oligonucleotide ....................................................................................48 2.1.4. Môi trường nuôi cấy ............................................................................................48 2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu ......................................................................49 2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu ..............................................................................49 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................50 2.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................50 2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................................50 2.4.1. Phương pháp xác định dòng ngô có khả năng tái sinh cao.................................51 2.4.2. Phương pháp theo dõi đặc điểm nông sinh học, chọn tạo dòng làm vật liệu chuyển gen .51 2.4.3. Phương pháp thiết kế vector biểu hiện gen ZmDREB2A.....................................52 2.4.3.1. Thiết kế vector biểu hiện trong tế bào thực ......................................................52 2.4.3.2. Tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen ............................53 v 2.4.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens ................53 2.4.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp .........................................................................53 2.4.4.2. Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm ............................................................................53 2.4.4.3. Quy trình biến nạp gen .....................................................................................54 2.4.5. Phân tích và đánh giá sự ổn định các dòng ngô mang gen ZmDREB2A ............56 2.4.5.1. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR ..................................56 2.4.5.2. Đánh giá sự phân ly của gen ZmDREAB2A qua các thế hệ .............................57 2.4.4.3. Phân tích cây chuyển gen bằng southerm blot .................................................57 2.4.6. Đánh giá sự biểu hiện của gen thông qua RT-PCR.............................................59 2.4.7. Tạo kháng thể đa dòng kháng protein ZmDREB2A tái tổ hợp ............................60 2.4.7.1. Biểu hiện protein ZmDREB2A trong tế bào vi khuẩn E. coli ...........................60 2.4.7.2. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột ...................................................................62 2.4.8. Xác định hàm lượng Chlorophyll, proline, cacbonhydrate trong cây chuyển gen ......63 2.4.8.1. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll tổng số ...................................63 2.4.8.2. Phương pháp xác định hàm lượng proline .......................................................63 2.4.8.3. Phương pháp xác định hàm lượng cacbohydrate không cấu trúc (NSC) .........64 2.4.9. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen ...............................................64 2.4.9.1. Đánh giá khả năng chịu hạn bằng thí nghiệm gây hạn nhân tạo ở giai đoạn cây con theo phương pháp của Camacho ............................................................................64 2.4.9.2. Đánh giá khả năng chịu hạn bằng thí nghiệm gây hạn nhân tạo ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau theo phương pháp của Zaidi.....................................................65 2.4.10. Các kỹ thuật được dùng đánh giá cây chuyển gen ............................................65 2.4.10.1. Tách chiết, định lượng DNA ...........................................................................65 a, Tách chiết DNA plasmid ............................................................................................65 b, Tách chiết DNA tổng số từ lá ngô .............................................................................66 2.4.10.2. Tách chiết, định lượng RNA từ mô thực vật ...................................................67 2.4.10.3. Điện di DNA/RNA trên gel agarose ...............................................................67 2.4.10.4. Tổng hợp cDNA ..............................................................................................68 2.4.10.5. Kỹ thuật PCR khuếch đại gen ZmDREB2A ....................................................68 2.4.10.6. Phương pháp giải trình tự và so sánh ............................................................68 2.4.10.7. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen ..........................69 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................70 vi 3.1. Đánh giá khả năng tái sinh và đặc điểm nông học của một số vật liệu ........................70 3.1.1. Đánh giá khả năng tái sinh của một số vật liệu nghiên cứu............................... 70 3.1.2. Đặc điểm nông, sinh học của các dòng có tỷ lệ tái sinh cao ...............................73 3.1.2.1. Thời gian sinh trưởng .......................................................................................73 3.1.2.2. Đặc điểm hình thái ...........................................................................................74 3.1.2.3. Khả năng chống chịu ........................................................................................75 3.1.2.4. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất ..................................................76 3.2. Thiết kế và biến nạp vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDreb2A vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ....................................................................................................79 3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2A ..................................79 3.2.1.1. Phân tích và tổng hợp gen ZmDreb2A .............................................................79 3.2.1.2. Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2A ...............................82 3.2.2. Biến nạp cấu trúc vector chứa gen ZmDREB2A-S vào một số dòng ngô Việt Nam thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ................................................................................84 3.2.2.1. Chuyển gen ZmDREB2A-S vào các dòng ngô K1, K3, K7 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ...........................................................................................85 3.2.2.2. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR đối với các cây chuyển gen ở thế hệ T0...............................................................................................................90 3.2.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A .....................................................91 3.2.2.4. Đánh giá khả năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0 .......................93 3.3. Phân tích và đánh giá sự ổn định các dòng ngô mang gen ZmDREB2A ở các thế hệ T1, T2, T3 ................................................................................................................................. 96 3.3.1. Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T1 bằng phương pháp PCR ...........................................................................................96 3.3.2. Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T2 bằng phương pháp PCR ...........................................................................................99 3.3.3. Phân tích sự có mặt của gen ZmDREB2A trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T3 bằng phương pháp PCR .........................................................................................101 3.3.4. Kết quả giải trình tự cấu trúc biểu hiện Ubi::ZmDREB2A:: 35S trên cây ngô chuyển gen ...................................................................................................................104 3.3.4.1. Kết quả PCR, giải trình tự promoter Ubiquitin và so sánh với trình tự gốc ..........104 3.3.4.2. Kết quả PCR, giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A và so sánh với trình tự gốc......107 3.3.4.3. Kết quả PCR, giải trình tự terminator 35S và so sánh với trình tự gốc ................109 vii 3.3.5. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDREB2A bằng kỹ thuật lai Southern ....... 112 3.3.5.1. Kết quả DNA tổng số được cắt bằng enzyme giới hạn ............................................112 3.3.5.2. Kết quả xác định tín hiệu lai Southern blot..............................................................113 3.3.6. Xác định sự có mặt sản phẩm phiên mã của gen chuyển ZmDREB2A trên cây ngô chuyển gen bằng kỹ thuật RT-PCR ..............................................................................115 3.3.6.1 Kết quả PCR khi sử dụng cặp mồi Actin .................................................................... 115 3.3.6.2. Kết quả PCR khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmDREB2A ........................................ 117 sản phẩm PCR từ cDNA dòng K7-4.12.25 ............................................................ 118 3.3.7. Kiểm tra protein ZmDREB2A bằng thẩm tách miễn dịch (Western Blot) .........118 3.4. Xác định hàm lượng Chlorophyll, Proline, Cacbonhydrate trong cây chuyển gen và đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen ..................................................120 3.4.1. Xác định hàm lượng chlorophyll ở cây chuyển gen ZmDREB2A ......................120 3.4.2. Xác định hàm lượng proline ở cây chuyển gen ZmDREB2A ............................123 3.4.3. Xác định hàm lượng carbohydrate không cấu trúc ở cây chuyển gen ZmDREB2A ...125 3.4.4. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô chuyển gen thế hệ T3 bằng gây hạn nhân tạo .......................................................................................................................127 3.4.4.1. Đánh giá một số chỉ tiêu liên quan đến khả năng chịu hạn nhân tạo của các dòng đã được chuyển gen ZmDREB2A thời kỳ cây con .....................................................................127 3.4.4.2. Đánh giá các dòng chuyển gen và dòng nền tương ứng ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau về khả năng chịu hạn nhân tạo ............................................................................134 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................146 4.1 Kết luận .................................................................................................................................146 4.2. Đề nghị............................................................................................................................147 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................148 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................149 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 165 1. Một số hình ảnh thực hiện thí nghiệm tái sinh và chuyển gen .......................................165 2. Một số hình ảnh gây hạn nhân tạo .......................................................................................169 3. Một số hình ảnh về đặc điểm hình thái các dòng K1, K3, K7 ...................................... 171 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Khả năng gặp hạn ở 8 vùng ngô tại Việt Nam ................................................... 12 Bảng 1.2. Phản ứng của gen DREB với stress khác nhau của môi trường trong cây chuyển gen ..................................................................................................................... 28 Bảng 1.3. Diện tích trồng cây chuyển gen trên thế giới, từ 1996 đến 2017 .........................34 Bảng 1.4. Các nước trồng cây biến đổi gen vào năm 2016 và 2017 (Triệu ha) ................. 35 Bảng 2.1. Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu..................................... 49 Bảng 2.2. Hệ thống môi trường dùng trong thí nghiệm chuyển gen ngô.............................55 Bảng 2.3. Thành phần gel polyacrylamide chứa SDS...........................................................61 Bảng 3.1. Tỷ lệ tạo cây tái sinh từ phôi non của một số dòng ngô Việt Nam ................. 71 Bảng 3.2. Thời gian sinh trưởng và đặc điểm của các dòng năm 2014 ...............................73 Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh trưởng phát triển của các dòng ngô năm 2014 ............. 74 Bảng 3.4. Khả năng chống chịu của các dòng ngô năm 2014 ........................................ 75 Bảng 3.5. Các yếu tố cấu thành năng suất của các giống ngô ..............................................76 Bảng 3.6. Hình thái bắp, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng thí nghiệm năm 2014 ...............................................................................................................78 Bảng 3.7. Sự hình thành mô sẹo của các dòng ngô thí nghiệm ..........................................86 Bảng 3.8. Sự hình thành chồi tái sinh của các dòng ngô thí nghiệm....................................87 Bảng 3.9. Sự hình thành cây hoàn chỉnh của các dòng ngô thí nghiệm ...............................89 Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra sự có mặt của các gen chuyển và khả năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0 .......................................................................................................... 90 Bảng 3.11. Kết quả đánh giá khả năng hữu thụ của các cây chuyển gen thế hệ T0 ........ 94 Bảng 3.12. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô ở thế hệ T1 ........................................... 96 Bảng 3.13. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô ở thế hệ T2 ......................................... 100 Bảng 3.14. Nguồn gốc cây T2 được chọn đánh giá thế hệ T3 ......................................... 102 Bảng 3.15. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô ở thế hệ T3 ......................................... 102 Bảng 3.16. Kết quả so sánh đoạn trình tự Promoter Ubiquitin và trình tự gốc ................ 106 Bảng 3.17. Kết quả so sánh đoạn trình tự gen ZmDREB2A và trình tự gốc ..................... 108 Bảng 3.18. Kết quả so sánh đoạn trình tự 35S terminater của dòng ngô ...........................111 Bảng 3.19. Tỷ lệ cây sống sau phục hồi (%) .......................................................................129 Bảng 3.20. Các chỉ tiêu thân, lá, rễ tươi của các dòng ngô thí nghiệm trong chậu ...........131 Bảng 3.21. Các chỉ tiêu thân, rễ khô của các dòng ngô thí nghiệm trong chậu .................133 Bảng 3.22. Thời gian sinh trưởng của các dòng ngô trong thí nghiệm ..............................135 Bảng 3.23. So sánh chiều dài bắp và đường kính bắp của các vật liệu ngô ở các thời kỳ hạn khác nhau trong nhà lưới.......................................................................................................138 Bảng 3.24. So sánh số hàng hạt và số hạt/hàng của các dòng ngô mang ...........................139 Bảng 3.25. So sánh tỷ lệ hạt/bắp và khối lượng nghìn hạt của các dòng ngô....................140 Bảng 3.26. So sánh năng suất cá thể của các dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A ở các thời kỳ hạn khác nhau trong nhà lưới ..........................................................................................141 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Các vùng trồng ngô của Mỹ bị ảnh hưởng của hạn hán........................................... 9 Hình 1.2. Năng suất ngô ở cận Sahara Châu Phi, Châu Mĩ Latinh và Nam Phi ................ 10 Hình 1.3. Bản đồ chỉ số rủi ro toàn cầu thế giới 1992 – 2011 ..............................................11 Hình 1.4. Hệ thống điều khiển phiên mã phụ thuộc và không phụ thuộc của ABA trong điều kiện hạn hán, độ mặn và chống chịu lạnh ..............................................................................18 Hình 1.5. Biểu hiện của gen DREB2A ở Arabidopsis trong điều kiện bình thường và bất thuận... 31 Hình 1.6. Cảm ứng lạnh và sự biểu hiện gen DREB1 ...........................................................31 Hình 1.7. (A và B). Diện tích toàn cầu (Triệu ha) trồng cây biến đổi gen, 1996 đến 2017, theo quốc gia, các quốc gia lớn và cho mười quốc gia hàng đầu........................................... 36 Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào phôi non ngô thông qua vi khuẩn A.tumefaciens ............................................................................................................................................... 56 Hình 3.1. Một số hình ảnh các nguồn vật liệu có khả năng tái sinh tốt .............................. 72 Hình 3.2. Sự khác biệt giữa ZmDREB2A-L và ZmDREB2A-S .............................................80 Hình 3.3. Trình tự nucleotide và amino axit của gen ZmDREB2A ......................................81 Hình 3.4. So sánh trình tự amino axit của gen ZmDREB2A tổng hợp .................................81 Hình 3.5. Kiểm tra đoạn gen ZmDREB2A-S trong vector pRTRA7/3 ...............................82 Hình 3.6. Kiểm tra cấu trúc ubi:: ZmDREB2A-S ::35S trong vector pCAMBIA1300 ......83 Hình 3.7. PCR kiểm tra sự có mặt của gen ZmDREB2A-S trong vi khuẩn A. tumefaciens.........83 Hình 3.8. Sơ đồ, cấu trúc vector pCAMBIA1300 mang gen ZmDREB2A-S ......................84 Hình 3.9. Phôi non nguồn K1 trên môi trường nuôi ủ CCM ................................................85 Hình 3.10. Mô sẹo nguồn K1 trên môi trường phục hồi ReM ............................................... 85 Hình 3.11. Mô sẹo nguồn K7 trên.............................................................................................. 86 Hình 3.12. Mô sẹo nguồn K7 trên môi trường chọn lọc 2 (SeM2) ......................................86 Hình 3.13. Mô sẹo nguồn K7 phôi hoá trên môi trường tái sinh 1 (TS1) ............................. 87 Hình 3.14. Mô sẹo phôi hoá nguồn K1 trên môi trường tái sinh 2 (TS2) ............................. 87 Hình 3.15. Cây ngô chuyển gen nguồn K3 trên môi trường ra rễ .....................................88 Hình 3.16. Cây chuyển gen T0 được ra ngôi trên giá thể dinh dưỡng .................................88 Hình 3.17. Cây chuyển gen T0 được trồng ra đất .................................................................89 Hình 3.18. Kết quả phân tích PCR sử dụng cặp mồi mồi vắt đặc hiệu cấu trúc chuyển gen Ubi-ZmDReb2A (350bp) của dòng K3 thế hệ T0 trên gel agarose 1% .............................. 90 Hình 3.19. Kết quả phân tích PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu ZmDreb2A (948bp) của dòng K3 thế hệ T0 trên gel agarose 1%....................................................................................... 90 x Hình 3.20. Kết quả so sánh trình tự gen ZmDREB2A từ cây chuyển gen dòng K7 với trình tự gốc ................................................................................................................................................92 Hình 3.21. Một phần kết quả giải trình tự gen chuyển ZmDREB2A ....................................93 Hình 3.22. Một số dạng cây đột biến .....................................................................................94 Hình 3.23. Một số kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen ZmDReb2A (948 bp) của dòng K3 thế hệ T1 trên gel agarose 1%....................................................................................... 98 Hình 3 24. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen ZmDREB2A (948bp) của dòng K7-3.3 thế hệ T2 trên gel agarose 1%........................................................................................... 100 Hình 3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen ZmDREB2A(948 bp) ..................... 103 thế hệ T3 cây K3-3.1.96(A) và K7-4.12.25(B) trên gel agarose 1% ................................ 103 Hình 3.26. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn promoter Ubi (1,4kb) trên gel agarose 1%........................................................................................................................ 105 Hình 3 27. Một phần kết quả giải trình tự đoạn promoter Ubi thuộc nguồn K7-4-12.25 106 Hình 3.28. Kết quả giải trình tự đoạn Promoter Ubiquitin thuộc nguồn K7-4.12.25 ........106 Hình 3.29. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen đích ZmDREB2A (948bp) trên gel agarose 1% ........................................................................................................................ 107 Hình 3.30. Một phần kết quả giải trình tự đoạn gen ZmDREB2A của cây ngô chuyển gen nguồn K7-4.12.25 ..................................................................................................................108 Hình 3.31. Kết quả so sánh trình tự gen ZmDREB2A từ nguồn K7-4.12.25 và trình tự gốc.109 Hình 3.32. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn terminator 35S (256bp) trên gel agarose 1% ........................................................................................................................ 110 Hình 3.33. Một phần kết quả giải trình tự đoạn 35S terminator bằng mồi 35S-F cây ngô chuyển gen nguồn K7-4.12.25 ..............................................................................................110 Hình 3.34. Kết quả so sánh đoạn 35 S terminator nguồn K7-4.12.25 và trình tự gốc .......111 Hình 3.35a. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR gen đích ZmDREB2A.....................113 Hình 3.35b. Điện di DNA tổng số sau khi xử lý với enzyme giới hạn................................113 Hình 3.35c. Kết quả Lai Southern với các nguồn dòng chuyển gen ZmDREB2A sử dụng mồi probe đặc hiệu PCR đoạn gen đích ZmDREB2A ........................................................113 Hình 3.36A. Ảnh điện di RT-PCR mồi Actin dòng K3-4.18.32 ........................................116 Hình 3.36B. Ảnh điện di RT-PCR mồi Actin dòng K7-4.12.25 ....................................... 116 Hình 3.37A. Ảnh điện di RT-PCR mồi ZmDREB2A nguồn K3-4.18.32 ......................... 118 Hình 3.37B. Ảnh điện di RT-PCR mồi ZmDREB2A nguồn K7-4.12.25 .......................... 118 Hình 3.38. Kết quả lai Western blot các cây ngô chuyển gen ZmDREB2A thế hệ T3 ... 119 Hình 3.39. Hàm lượng chlorophyll a ở các cây thí nghiệm ................................................121 xi Hình 3.40. Hàm lượng chlorophyll b ở các cây thí nghiệm ................................................122 Hình 3.41. Tỉ lệ chlorophyll a/chlorophyll b ở các cây thí nghiệm ....................................122 Hình 3.42. Hàm lượng proline của các cây chuyển gen ZmDREB2A và ......................... 124 Hình 3.43. Hàm lượng carbohydrate không cấu trúc của các nhóm cây thí nghiệm.........126 Hình 3.44. Cây con trước khi xử lý hạn ...............................................................................128 Hình 3.45. Giai đoạn trước phục hồi ................................................................................ 128 Hình 3.46. Giai đoạn sau phục hồi.................................................................................... 130 Hình 3.47. Rễ của các dòng ngô sau khi xử lý phục hồi 7 ngày...........................................131 Hình 3.48. Cây ngô K7 và K7-ZmDREB2A trong quá trình gây hạn ...............................137 Hình 3.49. Các thời kỳ gây hạn ................................................................................................137 Hình 3.50. Các bắp ngô K7-ZmDrb2A và K7 ở 4 thời điểm gây hạn................................143 Hình 3.51. Các bắp ngô K3-ZmDrb2A và K3 ở 4 thời điểm gây hạn................................144 xii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Từ viết tắt Giải thích tiếng Anh 1. 2. 3. 4. 2,4-D A. thaliana A. tumefaciens ABA 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid Arabidopsis thaliana Agrobacterium tumefaciens Abscisic Acid 5. 6. ABRE -ACGT ACGT-containing abscisic acid responseelement AS Acetylseringone 7. 8. 9. BAP BĐKH bp base pairs Bovine serum albumin Coomassie Brilliant Blue Cocultivation medium 13. CIMMYT International Maize and Wheat Improvement Center CT CV (%) ĐC dNTP 18. DRE 19. DREB 20. DTMA 21. 22. 23. 24. E.coli EDTA et al, cs EtBr Phản ứng axit abscisic chứa ACGT 6-Benzylaminopurine 10. BSA 11. CBB 12. CCM 14. 15. 16. 17. Giải thích tiếng Việt Coefficient of Variation Biến đổi khí hậu Cặp bazơ nitơ Albumin huyết thanh bò Môi trường đồng nuôi cấy Trung tâm Nghiên cứu Ngô và Lúa mì Quốc tế Công thức Hệ số biến động Đối chứng Deoxyribonucleoside Triphosphate Dehydration responsive element Yếu tố điều hoà phản ứng với sự mất nước Dehydration responsive element- Protein liên kết với yếu binding protein tố đáp ứng hạn DRE Drought Tolerant Maize for Ngô chịu hạn cho Châu Africa Phi Escherichia coli Ethylene diamine tetra acetic acid Cộng sự Ethidium bromide xiii 25. FAOSTAT, FAO 26. GSO 27. HSP 28. IPTG 29. ISAAA 30. 31. 32. 33. Kb Kda KNKH LB 34. LEA 35. MAS 36. MASBC 37. MASR Food and Agriculture Organization of the United Nation General Statistics Office of Vietnam Heat shock protein Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside The International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications Tổ chức Nông Lương Liên hợp quốc Tổng cục thống kê Việt Nam Protein sốc nhiệt Dịch vụ Quốc tế Ứng dụng Công nghệ Sinh học Nông nghiệp Quốc tế Kilobases Kilodaltons Luria-Bertani Khả năng kết hợp Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn Late embryogenesisabundant Protein hình thành trong giai đoạn phát triển muộn của phôi Chọn lọc nhờ chỉ thị Molecular markers Selective phân tử Molecular markers Selective in Chọn lọc nhờ chỉ thị backcross phân tử sử dụng quần thể lai trở lại Molecular markers selective Chọn lọc hồi quy nhờ chỉ indicator regression thị phân tử 38. mRNA 39. MS Messenger ribonucleic acid Murashige và Skoog 40. N6 Chu and et al 41. NAA 42. NAC 43. NACRS 1-naphthaleneacetic acid NAM/ATAF1/2/CUC2 NAC recognition sequence 44. NS 45. OD Optical density ARN thông tin Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô Môi trường nuôi cấy mô thực vật Trình tự nhận protein NAC Năng suất Mật độ quang học biết xiv 46. PCR Polymerase Chain Reaction 47. 48. 49. 50. Polyethylene glycol Quantitative trait locus Re - elongation Medium Rooting Medium PEG QTL ReM RoE 51. RT-PCR 52. SDS 53. SDS-PAGE 54. 55. 56. 57. SEM TAE TBE T-DNA 58. 59. 60. 61. TE TF Ti-plasmid WEMA 62. WT 63. X-Gal 64. YEM Phản ứng chuỗi trùng hợp Tính trạng số lượng Môi trường phục hồi Môi trường tạo cây hoàn chỉnh Reverse transcription polymerase Phản ứng nhân bản ADN chain reaction sao chép ngược Sodium dodecyl sulfate SDS - Polyacrylamide gel Điện di gel electrophoresis polyacrylamide có chứa SDS Shoot Elongation Medium Môi trường chọn lọc Tris-acetate-EDTA Đệm chạy điện di Tris-borate-EDTA Đệm chạy điện di Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển vào thực vật Tris-EDTA Đệm Tris-EDTA Transcription factor Nhân tố phiên mã tumor inducing plasmid Plasmid gây khối u Water Efficient Maize for Africa Ngô chịu úng cho Châu Phi Wild Type Kiểu dại 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galactopyranoside yeast extract –manitol Môi trường nuôi cấy chứa cao nấm men và manitol 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngô (Zea mays L.) là một trong ba loài lương thực quan trọng trên thế giới bên cạnh lúa mì và lúa nước. Mặc dù diện tích gieo trồng ngô chỉ đứng thứ ba trong số các cây ngũ cốc nhưng lại cho sản lượng thu hoạch cao nhất. Ngô đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu, đồng thời là nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp như dược phẩm, thực phẩm và sản xuất nhiên liệu sinh học. Theo thống kê sản xuất ngũ cốc năm 2018/2019 cho thấy sản lượng ngô đạt 1099.61 triệu tấn, đứng thứ 2 là sản lượng lúa mỳ đạt 734.74 triệu tấn, đứng thứ 3 là sản lượng lúa đạt 495.87 triệu tấn, tiếp sau lần lượt là lúa mạch, cao lương. Hoa Kỳ là nước sản xuất gần một nửa lượng ngô của thế giới với sản lượng sản xuất năm 2018/2019 đạt 366.287 triệu tấn, tiếp theo sau là Trung Quốc với sản lượng 257.33 triệu tấn, Brazil 94.5 triệu tấn. Sản xuất ngô ở nước ta hiện vẫn chưa tương xứng với tiềm năng, chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước. Theo số liệu thống kê, năm 2018 nước ta vẫn phải nhập khẩu 8,436 triệu tấn ngô. Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán kéo dài, lượng mưa không đều ở các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ. Ngoài những tác động trực tiếp lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu còn làm thu hẹp diện tích sản xuất nông nghiệp. Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên thường xuyên khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với nhiều loại cây trồng, trong đó có ngô. Hạn là một trong những nhân tố có ảnh hưởng lớn nhất tới năng suất trên phạm vi rộng lớn, có tính chất toàn cầu, cây ngô cũng không nằm ngoài tác động của hạn, nhất là những vùng trồng ngô nhờ nước trời. Có nhiều biện pháp tác động đến sự phát triển ngô trong điều kiện hạn như kỹ thuật canh tác, chọn tạo giống. Để giải quyết vấn đề trên thì chọn tạo giống ngô chịu hạn là một trong những giải pháp được các nhà khoa học đặt lên hàng đầu và có tính khả thi cao. Cho đến nay chọn giống cây trồng chịu hạn nói chung và cây ngô nói riêng được thực hiện theo 3 hướng chủ yếu: 1) Chọc lọc trực tiếp trên đồng ruộng; 2) Chọn lọc truyền thống phối hợp chỉ thị phân tử; 3) Chuyển gen chịu hạn. 2 Các giống cây trồng chịu hạn được sử dụng trong sản xuất trước đây hầu hết được lai tạo bằng các phương pháp chọn giống truyền thống, nhược điểm của phương pháp này là rất tốn kém về thời gian và kinh phí, rất ít giống cây trồng chịu hạn được tạo ra bằng phương pháp Công nghệ Sinh học. Hiện nay, các phương pháp chọn giống chịu hạn đang được các nhà khoa học quan tâm sử dụng là chọn giống dựa vào chỉ thị phân tử (MAS), lập bản đồ QTLs và chọn giống chuyển gen. Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen (do rất nhiều gen quy định), vì vậy định hướng chọn giống phân tử đang gặp khó khăn lớn trong việc quy tụ các tính trạng, gen quan trọng liên quan đến chịu hạn. Gần đây, dựa trên những thành tựu của chương trình nghiên cứu chức năng hệ gen thực vật các nhà khoa học đã phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã (Transcription factor) trong việc tăng cường tính chịu hạn ở thực vật. Nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào phản ứng đáp ứng với điều kiện hạn ở thực vật nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò kích hoạt sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn ở thực vật. Phát hiện này đã mở ra một hướng nghiên cứu rất mới cho lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở thực vật, đó là chỉ cần chuyển 1 hay 1 vài gen mã hóa yếu tố phiên mã thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cường tính chống chịu bất lợi môi trường của cây trồng. DREB (Dehydration Responsive Binding protein) là gen tăng cường khả năng chịu hạn được biết đến trong nhóm các nhân tố khởi đầu phiên mã tham gia điều khiển tính chịu hạn: DREB, AREB, NAC, MYB, MYC, bZIP, WRKY. Ngày nay, đã có một số nhà nghiên cứu phân tích đánh giá gen tăng cường khả năng chịu hạn (DREB) trên một số đối tượng thực vật Arabidopsis, ngô, lúa, đậu tương, bông. Gen ZmDREB2A cũng đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính chi tiết ở ngô. Không giống như gen DREB2A của Arabidopsis, gen ZmDREB2A tạo ra hai dạng phiên mã và qua phân tích RT- PCR thì chỉ có dạng phiên mã có hoạt tính được sinh ra trong điều kiện hạn. Ngoài ra, thí nghiệm phân tích hoạt hoá phiên mã (transactivation assay) ở tế bào trần Arabidopsis đã chứng tỏ ZmDREB2A có hoạt tính hoạt hoá quá trình phiên mã mạnh hơn nhiều DREB2A. Điều này chứng tỏ quá trình sửa đổi sau dịch mã là không 3 cần thiết trong việc tạo ra protein hoạt tính trong trường hợp gen ZmDREB2A. Sự biểu hiện liên tục của ZmDREB2A làm tăng đáng kể khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen. Kết quả này cho thấy có sự khác nhau về cơ chế điều khiển tính chịu hạn trong cùng nhóm gen giữa cây mô hình hai lá mầm (Arabidopsis) và cây một lá mầm. Ở Việt Nam, chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào cây ngô đã được tập trung nghiên cứu trong những năm gần đây. Tuy nhiên, những nghiên cứu về biểu hiện gen trong các cây chuyển gen chịu hạn còn ít được đề cập đến. Xuất phát từ những lý do trên đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá nhân tố phiên mã ZmDREB2A nhằm tăng cường tính chịu hạn ở một số dòng ngô Việt Nam” được thực hiện. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Tạo được dòng ngô chuyển gen mang cấu trúc gen ZmDREB2A; - Xác định sự có mặt, sự ổn định qua các thế hệ và biểu hiện của gen ZmDREB2A trên các vật liệu được chuyển gen ở mức phân tử; - Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng cây ngô chuyển gen mang cấu trúc gen ZmDREB2A ở điều kiện hạn nhân tạo. 3. Đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống từ biến nạp cấu trúc vector chứa gen ZmDREB2A vào ba dòng ngô K1, K3, K7 đến đánh giá biểu hiện gen ZmDREB2A liên quan đến tính chịu hạn cây ngô Việt Nam; Ứng dụng kỹ thuật PCR, RT-PCR, southern blot, đánh giá hạn nhân tạo, phân tích sinh lý, sinh hoá…đã đánh giá được sự có mặt, tính ổn định và biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng ngô chuyển gen mang gen ZmDREB2A; Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận nghiên cứu tạo dòng ngô chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Về mặt khoa học: Những cơ sở khoa học của việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc tăng cường protein tái 4 tổ hợp ZmDREB2A và biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển ZmDREB2A trên cây ngô. Kết quả tạo cây ngô chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây ngô ở Việt Nam. Về mặt thực tiễn: Việc tạo ra các dòng ngô chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn so với dòng đối chứng đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen đối với các loại cây trồng khác nhau nhằm nâng cao tính chịu hạn. Các dòng ngô chuyển gen có khả năng chịu hạn là nguồn vật liệu khởi đầu cho việc tạo các giống ngô chuyển gen chịu hạn trong nước.