Tài liệu Luận án tiến sĩ nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia quá trình

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID Ở TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria Roscoe) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT Mã số: 9420112 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. NGUYỄN HOÀNG LỘC HUẾ - NĂM 2019 LỜI CÁM ƠN Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới cán bộ giảng viên của Bộ môn Sinh học Ứng dụng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế; Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn 2013-2014); Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và hợp tác Quốc tế; Phòng Đào tạo Sau đại học -Trường đại học Khoa học; Ban chủ nhiệm Khoa sinh học-Trường Đại học Khoa học- Đại học Huế ; Ban Giám hiệu, Khoa Dược, Khoa cơ bản, Bộ môn Sinh học-Trường Đại học Y Dược Huế đã có nhiều giúp đỡ quý báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án. Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã luôn giúp đỡ, động viên và khích lệ cả vật chất lẫn tinh thần. Xin trân trọng cảm ơn! Huế, ngày tháng năm 2019 Tác giả Trương Thị Phương Lan i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả luận án Trương Thị Phương Lan ii BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurine CoA coezyme A cs cộng sự CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide CzDCS Curcuma zedoaria DCS CzCURS1 Curcuma zedoaria CURS1 CzCURS2 Curcuma zedoaria CURS2 CzCURS3 Curcuma zedoaria CURS3 ĐC đối chứng DPPH 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl dw dry weight (khối lượng khô) FRAP ferric reducing antioxidant power fw fresh weight (khối lượng tươi) HPLC high-performance liquid chromatography IBA 3-indolebutyric acid KIN kinetin MAPK mitogen-activated protein kinase MeJA methyl jasmonate MS Murashige and Skoog (1962) NAA naphthaleneacetic acid NO nitric oxide PAA phenyl acetic acid ROS reactive oxygen species SA salicylic acid SNP sodium nitroprusside YE yeast extract (dịch chiết nấm men) iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH .................................................................... viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................ 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.......................................................................... 2 3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................................ 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 5 1.1. CÂY NGHỆ ĐEN ...................................................................................... 5 1.1.1. Đặc điểm thực vật học......................................................................... 5 1.1.2. Phân bố ................................................................................................ 5 1.1.3. Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen ....................................... 6 1.1.3.1. Tinh dầu ........................................................................................... 6 1.1.3.2. Curcuminoid..................................................................................... 7 1.1.4. Công dụng của nghệ đen ..................................................................... 8 1.1.4.1. Hoạt tính giảm đau ........................................................................... 8 1.1.4.2. Hoạt tính kháng ung thư................................................................... 9 1.1.4.3. Hoạt tính bảo vệ gan ........................................................................ 9 1.1.4.4. Hoạt tính kháng viêm và chống loét ................................................ 9 1.1.4.5. Hoạt tính chống oxy hóa ................................................................ 10 1.1.4.6. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm............................................ 10 1.1.4.7. Các hoạt tính khác .......................................................................... 11 1.3. ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG ......................................................... 15 iv 1.3.1. Elicitor ............................................................................................... 15 1.3.1.1. Khái niệm ....................................................................................... 15 1.3.1.2. Phân loại ......................................................................................... 15 1.3.1.3. Cơ chế kích kháng .......................................................................... 16 1.3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự kích kháng ...................................... 18 1.3.2. Ứng dụng của elicitor ........................................................................ 20 1.3.2.1. Elicitor sinh học ............................................................................. 20 1.3.2.2. Elicitor phi sinh học ....................................................................... 26 1.4. CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID ........................ 27 1.4.1. Các con đường sinh tổng hợp curcuminoid ...................................... 27 1.4.2. Vai trò của các gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid ......... 31 1.4.2.1. Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS)...................... 31 1.4.2.2. Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS) .......................... 31 1.4.2.3. Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase .................................. 32 1.4.2.4. Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase ........................................ 33 1.4.2.5. Các gen khác .................................................................................. 34 1.4.3. Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp ........................ 35 1.4.4. Cải thiện sự biểu hiện gen bằng xử lý elicitor .................................. 37 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 39 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 39 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 39 2.2.1. Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen ......................................................... 40 2.2.1.1. Khử trùng mẫu vật ......................................................................... 40 2.2.1.2. Tái sinh chồi và tạo rễ in vitro ....................................................... 41 2.2.1.3. Nuôi cấy callus ............................................................................... 41 2.2.1.4. Nuôi cấy tế bào .............................................................................. 41 2.2.2. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid ........................................... 42 2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số................................................................. 42 v 2.2.2.2. Khuếch đại PCR ............................................................................. 43 2.2.2.3. Tạo dòng và chú giải gen ............................................................... 43 2.2.2.4. Xây dựng cây phả hệ ...................................................................... 45 2.2.3. Xác định sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid ............... 46 2.2.3.1. Xử lý elicitor .................................................................................. 46 2.2.3.2. Phân tích RT-PCR .......................................................................... 46 2.2.3.3. Phân tích HPLC ............................................................................. 48 2.2.4. Xử lý thống kê ................................................................................... 49 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 50 3.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO .......................................................... 50 3.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro ..................................................... 50 3.1.1.1. Tái sinh chồi ................................................................................... 50 3.1.1.2. Tạo rễ in vitro ................................................................................. 52 3.1.2. Nuôi cấy callus .................................................................................. 54 3.1.2.1. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN ........................................................ 54 3.1.2.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA ...................................................... 55 3.1.2.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và AgNO3 ................................................... 55 3.1.3. Nuôi cấy tế bào nghệ đen .................................................................. 57 3.2. NHẬN DẠNG CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID .................... 59 3.2.1. Phân lập gen ...................................................................................... 59 3.2.2. Phân tích biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid.................... 68 3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID ............................................................................................ 72 3.3.1. Thăm dò ảnh hưởng của các elicitor lên biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid ......................................................................................... 72 3.3.2. Biểu hiện của gen tổng hợp curcuminoid ......................................... 74 3.3.3. Tích lũy curcumin ............................................................................. 76 Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 79 vi 4.1. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO .......................................................... 79 4.1.1. Nhân giống cây nghệ đen in vitro ..................................................... 79 4.1.2. Nuôi cấy callus và tế bào cây nghệ đen ............................................ 81 4.2. PHÂN LẬP CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID ......................... 83 4.2.1. Phân lập gen tổng hợp curcuminoid ................................................. 83 4.2.2. Sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid .............................. 85 4.3. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID ........................................... 85 4.3.1. Đặc điểm của các elicitor sử dụng trong nghiên cứu ........................ 85 4.3.1.1. Dịch chiết nấm men ....................................................................... 85 4.3.1.2. Salicylic acid .................................................................................. 87 4.3.2. Ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng của tế bào ...................... 89 4.3.3. Ảnh hưởng của elicitor lên mức độ biểu hiện gen ............................ 90 4.3.4. Ảnh hưởng của các elicitor lên khả năng sản xuất curcumin ........... 92 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 95 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 95 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 95 DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................... 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 97 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại các elicitor khác nhau ..................................................... 17 Bảng 1.2. Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro. ....................................................................... 21 Bảng 2.1. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng CDS của các gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen................................................................... 45 Bảng 2.2. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng chỉ thị của các gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen ............................................................ 47 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in vitro nguyên vẹn. ............................................................................................. 51 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in vitro đã được chẻ đôi ....................................................................................... 52 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro ........ 53 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của KIN từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen ......................................................................................... 55 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của NAA từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen ......................................................................................... 56 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D 1 mg/L và AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen.............................................................................. 56 Bảng 3.7. Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen ................................................................................................................... 70 Bảng 3.8. Mật độ các băng DNA của vùng đặc hiệu ở các gen tổng hợp curcuminoid ..................................................................................................... 76 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các elicitor lên sinh trưởng và tích lũy curcumin trong tế bào nghệ đen ................................................................................................ 77 viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các curcumin .................................................. 8 Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp các curcuminoid trong cây nghệ vàng .. 30 Hình 1.3. Vai trò của các gen DCS và CURS trong tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng. ....................................................................................................... 32 Hình 2.1. Cây nghệ đen. .................................................................................. 39 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm. ............................................................................ 40 Hình 2.3. Vector pGEM®-T Easy (Promega, Mỹ). ......................................... 44 Hình 2.4. Vị trí của primer xuôi và ngược trên gen CzCURS1 ...................... 48 Hình 3.1. Cây nghệ đen in vitro 2 tháng tuổi. ................................................. 53 Hình 3.2. Callus nghệ đen 2 tuần tuổi sinh trưởng trên môi trường có 2,4-D 1 mg/L kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) và đối chứng sinh trưởng trên môi trường có 2,4-D 3 mg/L kết hợp với BAP 3 mg/L (B). .............................................. 57 Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen. ............................... 58 Hình 3.4. Tế bào nghệ đen nuôi trong bình tam giác chứa môi trường MS bổ sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L ................................................................ 59 Hình 3.5. Sinh khối tươi (A) và khô (B) của tế bào nghệ đen. ....................... 59 Hình 3.6. Sản phẩm PCR của các gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA tổng số của nghệ đen ....................................................................................... 61 Hình 3.7. Sơ đồ sắp xếp của các intron/exon trên 4 gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen. ................................................................................. 61 Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzDCS (MF663785) ở nghệ đen và DCS ở nghệ vàng (AB495006.1). ...................... 62 Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS1 (MF402846) ở nghệ đen và CURS1 ở nghệ vàng (AB495007.1). ................. 63 Hình 3.10. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS2 (MF402846) ở nghệ đen và CURS2 ở nghệ vàng (AB506762.1). .................. 64 ix Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS3 (NCBI: MF987835) ở nghệ đen và CURS3 ở nghệ vàng (NCBI: AB506763.1). ......................................................................................................................... 65 Hình 3.12. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzDCS và DCS (C0SVZ5.1). .................................................................................................... 66 Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS1 và CURS1 (AJF45913.1)................................................................................................... 66 Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS2 và CURS2 (BAW81545.1). ............................................................................................... 67 Hình 3.15. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS3 và CURS3 (AJF45914.1)................................................................................................... 67 Hình 3.16. Cây phả hệ của các gen sinh tổng hợp curcuminoid..................... 68 Hình 3.17. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen. ................ 70 Hình 3.18. Phổ HPLC của curcumin chuẩn. ................................................... 71 Hình 3.19. Phổ HPLC của dịch chiết củ nghệ đen.......................................... 71 Hình 3.20. Phổ HPLC của dịch chiết callus nghệ đen. ................................... 72 Hình 3.21. RNA tổng số của các mẫu tế bào sau khi được xử lý elicitor ....... 73 Hình 3.22. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzCURS1 (A) và CzCURS3 (B) sau khi được xử lý elicitor. ...................................................... 74 Hình 3.23. Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen. ................................................................................. 75 Hình 3.24. Phổ HPLC của curcumin chuẩn. ................................................... 78 Hình 3.25. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với YE 1 g/L sau 5 ngày nuôi cấy. .......................................................................................................... 78 Hình 3.26. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với SA 100 µM sau 5 ngày nuôi cấy. ................................................................................................. 79 1 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) còn được gọi là nga truật, tam nại hay ngải tím là loài thảo dược bản địa ở Ấn Độ và Indonesia, nhưng cũng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Brazil, Nepal, Thái Lan [78] và Việt Nam [7]. Nghệ đen từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền của nhiều nước để điều trị các chứng viêm, đau nhức, các bệnh về da như các vết thương và các vết lở loét, cũng như sự bất thường của chu kỳ kinh nguyệt [157]. Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin và các dẫn xuất của nó như demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin là nhóm hợp chất chính tạo nên các hoạt tính sinh học quan trọng của củ nghệ [76]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy curcuminoid, đặc biệt là curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý rộng như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống tia tử ngoại, ức chế phát triển khối u và bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid) [14], [58], [116]. Curcuminoid được chiết xuất từ củ (thân rễ) của các loài nghệ khác nhau, chẳng hạn C. caesia [24], C. amada [50], C. longa [67], C. aromatica [74] và C. zedoaria [78]. Curcuminoid hiện đang được sử dụng như dược chất trong nghiên cứu lâm sàng cho các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư trực tràng, viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, bệnh vảy nến… [35]. Nhiều nghiên cứu cũng đã cho thấy curcuminoid có độ an toàn cao, dung nạp tốt với cơ thể, không độc đến liều 8 g/kg thể trọng [46]. Hiện nay, các gen tham gia trong quá trình tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng (C. longa) đã được xác định và phân tích mức độ biểu hiện, bao gồm hai nhóm gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase là diketide-CoA synthase (DCS) và các curcumin synthase (CURS1, CURS2 và CURS3) [66], [67]. Trước đó, Brand và cs. (2006) cũng đã mô tả một gen mã hóa enzyme 2 type III polyketide synthase khác là chalcone synthase (CHS) có ở cây Wachendorfia thyrsiflora, và gen này cũng tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid [28]. Behar và cs. (2016) khi phân tích biểu hiện của các gen tham gia tổng hợp curcuminoid ở C. caesia bao gồm DCS, CURS, CURS2, CURS3 và CHS1 đã nhận thấy mức độ biểu hiện của chúng trong củ cao hơn ở lá [24]. Tuy nhiên, các gen tham gia tổng hợp curcuminoid ở loài nghệ đen đến nay vẫn chưa được công bố. Elicitor là những chất hóa học được dùng để tác động vào con đường chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp các chất có giá trị dược phẩm trong nuôi cấy tế bào thực vật [62], [111]. Theo Abraham và cs (2011), dịch chiết nấm men (YE) đã được ứng dụng trong nuôi cấy in vitro thực vật do khả năng kích thích cơ chế bảo vệ, tăng sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học [9]. Salicilic acid (SA) được xem là một trong những tín hiệu quan trọng trong phản ứng tự vệ của cây và cũng được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các chất chuyển hóa từ nuôi cấy tế bào thực vật [22]. Methyl jasmonate (MeJA) cũng đã được chứng minh là một chất đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu điều chỉnh khả năng phòng vệ của thực vật và có thể kích thích sự sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp trong nuôi cấy tế bào [158], [169]. Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)” nhằm xác định các loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng để điều hòa tăng biểu hiện của các gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase trong con đường phenylpropanoid ở tế bào nghệ đen. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ cung cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò của SA, YE và MeJA như là những chất điều hòa dương tính của biểu hiện gen ở loài dược liệu có giá trị này. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 Mục tiêu lý thuyết Cải thiện mức độ biểu hiện của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 tham gia trong con đường chuyển hóa phenylpropanoid sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro bằng một số elicitor. Mục tiêu thực nghiệm Tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, một thành phần chính của nhóm chất curcuminoid được ứng dụng nhiều trong dược phẩm, ở tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro. 3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu - Nuôi cấy sinh khối tế bào nghệ đen in vitro hiệu suất cao bằng cách bổ sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. - Phân lập các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS tham gia trong quá trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) ở nghệ đen. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor như YE, SA và MeJA lên mức độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid và khả năng tích lũy curcumin trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro. 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án có các đóng góp mới như sau: - Các nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây nghệ đen trước đây đều chưa sử dụng AgNO3 để tăng hiệu quả nuôi cấy, trong nghiên cứu này, bổ sung AgNO3 1,5 mg/L vào môi trường nuôi cấy (bao gồm tạo cây in vitro, nuôi cấy callus) đều làm tăng hiệu quả của quá trình nuôi cấy so với các nghiên cứu trước đây. - Đã phân lập thành công 4 gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid, các gen này tương đồng 99% so với các gen tương ứng ở cây nghệ vàng và đã được đăng ký trên ngân hàng gen với các mã số lần lượt là 4 MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835. Các gen này đều có sự biểu hiện ở trong củ và callus của cây nghệ đen. - Gen DCS có vai trò lớn nhất trong các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp curcumin ở cây nghệ đen, mức độ biểu hiện của gen này quyết định trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu được. - Đã nghiên cứu được ảnh hưởng của một số loại elicitor (dịch chiết nấm men và salicilic acid) lên khả năng tích lũy curcumin và mức độ biểu hiện của các gen liên quan. Giá trị tốt nhất thu được khi xử lý dịch chiết nấm men (1 g/L) sau 5 ngày nuôi cấy, mức độ biểu hiện cao hơn 2,78 lần so với đối chứng. 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY NGHỆ ĐEN 1.1.1. Đặc điểm thực vật học Nghệ đen là cây thân thảo sống nhiều năm hoặc hàng năm, cao khoảng 11,5m; có củ hình trứng, có khía chạy dọc, củ tỏa theo hình chân vịt; cây mẫm và chắc. Cây có nhiều củ, ngoài củ chính ra còn có những củ phụ, vỏ củ có màu xám, bên trong củ có màu vàng lưu huỳnh nhạt hoặc vàng sáng, khi già có nhiều vòng màu xanh tím. Củ nghệ khô có mùi thơm camphor nhẹ và có vị đắng hơi cay. Chồi lá nghệ đen có thể cao tới 1 m với 5 lá. Lá có bẹ ôm vào thân cây phía dưới, dài 30-60 cm, rộng 7-8 cm, dọc theo gân chính giữa có những đốm màu đỏ, cuống lá ngắn hay hầu như không có. Cụm hoa mọc ngang, dài 15-20 cm. Lá bắc phía dưới hình trứng hay hình mác tù, màu xanh lục nhạt, mép đỏ; lá bắc phía trên màu vàng nhạt, đầu lá màu đỏ, không mang hoa. Hoa màu vàng, đài hoa có thùy hình mác tù dài 15 mm, thùy giữa nhọn, cánh môi hẹp ở phía dưới nhưng hơi mở rộng phía trên [59], [105]. Trong hai tháng 3 và 4, các cụm hoa từ chồi nách của thân và chồi đỉnh của củ bắt đầu vươn lên mặt đất. Trên các điểm gần cụm hoa thường phát triển các chồi và từ đó bắt đầu hình thành các nhánh mới. Vào mùa thu, lá trên mặt đất bắt đầu lụi. Từ tháng 11 đến tháng 12, các chất chuyển hóa thứ cấp ở củ bắt đầu được tích lũy [7]. 1.1.2. Phân bố Cây nghệ đen được xem như là cây bản địa của vùng Đông Bắc Ấn Độ nhưng hiện đang được trồng khắp nơi ở Ấn Độ, Malaysia, Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan và Việt Nam. Ở Việt Nam, nghệ đen phân bố ở các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc như Hà Giang, Lào Cai, Yên Bái… và một số tỉnh ở 6 miền Trung. Hiện nay, cây nghệ đen cũng đã được trồng tại một số địa phương khác của miền Bắc và Tây Nguyên [6]. 1.1.3. Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen Nghệ đen là loài thảo dược có củ chứa các nhóm chất chủ yếu như tinh dầu (sesquiterpene và monosesquiterpene) và curcuminoid (curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin). Ngoài ra, cây nghệ còn chứa một số hợp chất khác như tinh bột, chất dẻo và các chất có vị đắng như tannin, flavonoiod [76]. 1.1.3.1. Tinh dầu Từ năm 1928, Rao và cs đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen và tìm thấy các hợp chất như α-pinen, borneol, camphen, camphor và cineol bên cạnh các sesquiterpene, nhưng không phân lập và xác định được loại sesquiterpene nào. Xingyi (1999) khi nghiên cứu tinh dầu nghệ đen ở Trung Quốc nhận thấy chúng chứa 37 thành phần khác nhau, trong đó chủ yếu là curzerenone (45,02%), curcumenol (8,31%), β-elemene (5,79%) và isocurcumenol (4,05%) [164]. Trong tinh dầu nghệ đen sinh trưởng ở vùng Đông Bắc Ấn Độ, Tohda và cs (2006) đã thu được 37 hợp chất, chiếm 87,7% lượng tinh dầu tổng số, chủ yếu là curzerenone (22,3%), tiếp đến là 1,8-cineole (15,9%) và germacrone (9%), β-tumerone (19,88%) và zingiberene (7,84%) [155]. Duke và cs (2003) đã tìm thấy trong củ nghệ đen một số sesquiterpenoid như ar-turmerone zederone, β-turmerone, curcumadiol, curcumenol, curcumol, curcolone, curdione, curzerene, curzerenone, dehydrocurdione, epicurzerenone, furanodiene, isocurcumenol, procurcumenol và zingiberene [41]. Ở Việt Nam, khảo sát thành phần hóa học của nghệ đen cũng đã và đang được quan tâm nghiên cứu. Thành phần chính trong tinh dầu củ nghệ thu được tại Sóc Sơn (Hà Nội) là zurumbon (chiếm 79,08%) [3], trong khi tinh dầu nghệ 7 đen ở Đô Lương (Nghệ An) và Hương Sơn (Hà Tĩnh) đều giàu epicurzerenon và germacrone. Các hợp chất khác trong tinh dầu có hàm lượng thấp hơn đó là α-cadinol, β-elemen, β-pinen, δ-cadinen, 1,8-cineol, 2,4-diisopropenyl-1-vinylcyclohexan, benzofuran-6-ethyxyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5 isopropyl, camphor, germacrene, isoborneol, T-muurolol và zingiberen [1]. Thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen trồng ở Đà Lạt có chứa các hợp chất như γ-elemen (14,18-18,79%), curzeren (14,28-16,67%), và germacrone (22,53-24,28%) [4]. 1.1.3.2. Curcuminoid Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu, các nghiên cứu về thành phần hợp chất màu vàng có trong nghệ đen cũng được quan tâm. Syu và cs (1998) nhận thấy dịch chiết ethanol của củ nghệ đen có chứa các hợp chất nhóm curcuminoid là curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin (Hình 1.1) [149]. Curcumin (C21H20O6) là một hợp chất dạng tinh thể, màu vàng cam, có trong các loài thực vật thuộc chi Curcuma, tan tốt trong các dung môi hữu cơ như acetone, methanol, ethanol và isopropanol nhưng không tan trong nước. Các dung môi hòa tan thích hợp để tách chiết curcumin là acetone, dichloromethan, ethanol ethyl acetate, methanol, n-butanol và hexane. Curcumin có thể được thu hồi bằng cách kết tinh từ dịch chiết [2], [60]. 8 O O H3CO OCH3 HO Curcumin O OH O OCH3 HO Demethoxycurcumin O HO OH O Bisdemethoxycurcumin OH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các curcumin. 1.1.4. Công dụng của nghệ đen Cây nghệ đen được trồng phổ biến dùng làm rau hoặc đồ gia vị ở các nước vùng Đông và Nam Á bao gồm Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam [59], [135]. Từ lâu, nghệ đen đã được sử dụng như một vị thuốc trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nghệ đen cũng được kê trong các đơn thuốc dùng để chữa bệnh dạ dày, điều trị hội chứng “Oketsu” gây ra do tắc nghẽn mạch máu, điều kinh và cải thiện kinh nguyệt với nhiều dạng pha chế khác nhau [96]. Ở Thái Lan, nghệ đen được dùng để làm dịu cơn đau dạ dày, chống tiêu chảy, chống nôn mửa và sốt hoặc làm se các vết thương ở ngoài da [135]. Người Ấn Độ đã dùng củ nghệ đen để trị chứng viêm da, bong gân, ung nhọt và vết thương [41]. Ngoài ra, củ nghệ đen còn được dùng để chữa giun sán ở trẻ em; bột nghệ dùng để chống dị ứng; lá nghệ có tác dụng chữa bệnh phù hay phong hủi [64], [109]. Ngày nay, nhiều hoạt chất sinh học của nghệ đen đã được chứng minh có tác dụng giảm đau, bảo vệ gan, kháng ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống đột biến… 1.1.4.1. Hoạt tính giảm đau 9 Shin và cs (1994) khảo sát hoạt tính dược lý của hai loại sesquiterpene là cuzerenone (I) và curcumenol (II) từ củ nghệ đen trên thỏ và chuột thực nghiệm. Kết quả cho thấy, cả hai chất này đều thể hiện hoạt tính giảm đau tương đối [144]. De Navarro và cs (2002) khi nghiên cứu hoạt tính giảm đau của nghệ đen ở Brazil đã nhận thấy hợp chất curcumenol có tác dụng giảm đau cao hơn nhiều lần so với các loại thuốc giảm đau thông thường như aspirin và dipyrone [38]. 1.1.4.2. Hoạt tính kháng ung thư Nghiên cứu của Hong và cs (2002) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có hoạt tính chống ung thư và kháng viêm. Khả năng ức chế sinh tổng hợp các chất prostalandin và NO của dịch chiết nghệ được cho là có tiềm năng trong việc kháng viêm và trong hóa trị liệu chống ung thư [59]. Seo và cs (2005) nhận thấy dịch chiết nước của củ nghệ có hoạt tính chống di căn phổi của các tế bào khối u ác tính B16 [140]. Syu và cs (1998) đã nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của các curcuminoid thu được từ dịch chiết ethanol của củ nghệ. Kết quả cho thấy, chúng có hoạt tính gây độc đối với các tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-3 ở người [149]. Các nghiên cứu của Jiang và cs (1996), Hanif và cs (1997) cũng cho thấy curcuminoid phân lập từ nghệ đen có khả năng ức chế sinh trưởng khối u và gây độc cho các dòng tế bào ung thư ruột kết và ung thư biểu mô gan ở người [55], [63]. 1.1.4.3. Hoạt tính bảo vệ gan Matsuda và cs (1998) nhận thấy dịch chiết acetone-nước của củ nghệ đen có hoạt tính bảo vệ gan, sesquiterpene và curcumin chống lại sự hình thành Dgalactosamine/lipopolysaccharide làm giảm tổn thương gan ở chuột [95]. Kết quả nghiên cứu của Kim và cs (2005) cho thấy, nghệ đen có thể được sử dụng như một loại thuốc tiềm năng trong điều trị chứng xơ gan mãn tính [70]. 1.1.4.4. Hoạt tính kháng viêm và chống loét