Tài liệu Lựa chọn quy trình tách chiết dna tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k.koch) ở việt nam dựa trên chỉ thị gbssi

VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC an dP ha rm NGUYỄN THỊ THU THẢO ac y, -------- ho ol of M ed ic ine LỰA CHỌN QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ GBSSI Co py rig ht @ Sc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VN U KHOA Y DƯỢC dP ha rm NGUYỄN THỊ THU THẢO ac y, -------- an LỰA CHỌN QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA of M ed ic ine TỔNG SỐ VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ GBSSI ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC @ Sc NGÀNH DƯỢC HỌC : QH2014.Y Người hướng dẫn : PGS.TS. Đinh Đoàn Long rig ht Khóa Lời cảm ơn ThS. Phạm Thị Hồng Nhung Co py Để hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả về vật chất lẫn tinh thần, về những kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn của các thầy cô, bạn Hà Nội - 2019 VN U LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả về vật chất lẫn tinh thần, về những kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn của các thầy cô, bạn bè và gia đình. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn ac y, sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Đoàn Long và ThS. Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người tận tình chỉ bảo giúp tôi dP ha rm thực hiện đề tài khóa luận, tôi xin cảm ơn ThS. Đỗ Thị Lệ Hằng đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi về kỹ năng thực hành thí nghiệm. Các thầy, cô không chỉ trang bị cho tôi kiến thức, mà còn truyền cho tôi niềm đam mê, lòng nhiệt huyết với nghề và luôn sẵn sàng giúp đỡ mỗi khi tôi gặp khó khăn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y dược học cơ sở đã hết ine an lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin cảm ơn những cán bộ tại Viện dược liệu (Bộ Y Tế) đã không ed ic quản ngại khó khăn thu thập và cung cấp mẫu vật giúp đỡ tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất. of M Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại nhà trường. ho ol Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 do PGS.TS Đinh Đoàn Long chủ trì để thực hiện nghiên cứu này. Sc Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ, động viên và tạo mọi điều Co py rig ht @ kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này. Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Thu Thảo GBSSI VN U DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-Bound Starch Synthase) Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) H.helix Hedera helix L. CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide Mini CTAB Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984 CTAB cải tiến Elias và cộng sự, 2004 Kit Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) DNA Axit deoxyribo Nucleic (Deoxyribonucleic acid) dNTP Deoxyribonucleotit 5’ triphosphate ITS Vùng sao chép nội bộ (Internal transcribed spacer) Genbank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế bp Cặp bazơ (base pair) dP ha rm an ine ed ic M of ho ol Mật độ quang học (Optical Density) OD Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information) py rig ht @ Sc NCBI Co ac y, H.nepalensis DANH MỤC CÁC BẢNG VN U Trang Bảng 2.1. Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu ..................................... 18 Bảng 3.1. Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu ...................................... 26 ac y, Bảng 3.2. Chỉ số OD260/280 của các mẫu nghiên cứu ................................................. 27 dP ha rm Bảng 3.3. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR ................................................. 29 Bảng 3.4. Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu ........................ 31 Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự GBSSI Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an của 9 mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis và H.helix ............ 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VN U Trang Hình 1.1. Cấu trúc một phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae .............................. 8 ac y, Hình 1.2. Hình ảnh cho mẫu lá Dây Thường Xuân..................................................... 9 Hình 1.3. Phân bố địa lý của Dây Thường Xuân tại phía Bắc Việt Nam. .................. 9 dP ha rm Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A ................................................................................... 10 Hình 1.7. Giải trình tự theo phương pháp Sanger ...................................................... 15 Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ........................................................................... 20 Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA theo bộ kit ........................................................ 22 an Hình 2.3. Nguyên lí hoạt động màng silica ............................................................... 22 ine Hình 2.4. Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit ....................... 24 ed ic Hình 3.1. Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2% ..................................... 25 Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI. ......................................................... 28 M Hình 3.3. Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI. ............................................................. 28 of Hình 3.4. Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI ................................................................. 28 Hình 3.5. Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% .................... 30 ho ol Hình 3.6. So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera........................................................................... 32 Sc Hình 3.7. Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Likelihood ............. 35 Co py rig ht @ Hình 3.8. Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Parsimony .............. 35 MỤC LỤC VN U Trang ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 ac y, 1.1. Đa dạng di truyền .............................................................................................. 3 1.1.1. Khái niệm ................................................................................................... 3 dP ha rm 1.1.2. Phân loại học sinh vật ................................................................................. 3 1.1.3. Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam................................................. 4 1.1.4. Mã vạch DNA ............................................................................................ 5 1.1.5. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt ............................................................ 7 1.2. Tổng quan về loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ............... 8 an 1.2.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây Thường Xuân ............................... 8 ine 1.2.2. Đặc điểm phân bố địa lý ............................................................................. 9 1.2.3. Thành phần hóa học ................................................................................. 10 1.3. ed ic 1.2.4. Tác dụng dược lý ...................................................................................... 10 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu ...................................................... 13 M 1.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ...................................................... 13 1.3.2. Phương pháp khuếch đại đoạn gen đích bằng PCR ................................. 14 of 1.3.3. Giải trình tự gen ....................................................................................... 15 ho ol 1.3.4. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại ..................................... 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 18 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 18 Sc 2.1.1. Đối tượng .................................................................................................. 18 @ 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu ......................................................................... 18 2.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 18 ht 2.3. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu .............................................. 19 rig 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 19 2.4.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................... 19 Co py 2.4.2. Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR ......................................... 23 2.4.3. Tinh sạch và giải trình tự .......................................................................... 24 VN U 2.4.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của nguồn gen ........................................................................................................... 24 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 25 3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 25 ac y, 3.2. Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen GBSSI bằng kỹ thuật PCR27 3.2.1. Tối ưu quy trình PCR ............................................................................... 27 3.2.2. So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình................ 29 dP ha rm 3.3. Độ tương đồng của trình tự gen GBSSI được khuếch đại............................... 31 3.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI............................ 34 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 42 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ dP ha rm ac y, VN U Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, địa hình núi chiếm phần lớn giúp hình thành thảm thực vật đa dạng và phong phú. Từ xa xưa, y học cổ truyền Việt Nam đã biết sử dụng các nguồn dược liệu như là một công cụ để chữa bệnh, chăm sóc sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống. Do vậy, nguồn cây dược liệu quý là tài sản vô giá dùng để sản xuất thành các sản phẩm thuốc, dược liệu có giá trị kinh tế cao [7]. Chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), được ghi nhận tổng cộng có 16 loài với đặc điểm hình thái chung dạng dây leo. Loài Dây Thường Xuân có tên khoa học là Hedera nepalensis K.Koch được báo cáo xuất hiện tại một số vùng núi cao Việt Nam, chứa hai hợp chất chính ine an có tác dụng chống ung thư là hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A [36]. Ngoài ra, H.nepalensis đã được nghiên cứu về tác dụng dược lý, cụ thể có khả năng chống lại một số bệnh như: đái tháo đường, oxy hóa, nhiễm khuẩn, ed ic ung thư,..[27, 50]. Với tiềm năng như vậy, song đến nay các nghiên cứu về H.nepalensis tương đối ít. Chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân ở Việt Nam nào được tiến hành, trong khi nhu cầu phát triển Sc ho ol of M thuốc có nguồn gốc dược liệu trên thế giới và ở Việt Nam nói chung đang ngày một tăng cao. Công tác thu thập, bảo tồn, đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen cây trồng là bước nghiên cứu quan trọng quyết định tới thành công trong chọn tạo giống. Những hiểu biết đầy đủ về sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của nguồn gen Dây Thường Xuân thực sự cần thiết trong công tác bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý. Sự nghèo nàn trong mô tả đánh giá nguồn gen là cản trở chính trong công tác chọn tạo giống. Hiện nay, những tiến bộ di truyền phân tử hỗ trợ đắc lực cho công tác đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn gen dược liệu, nhiều phương Co py rig ht @ pháp phân tích đã được sử dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền như: giải trình tự, RFLP, RAPD để phân tích minisatellites và phân tích đa hình hệ gen ty thể, hệ gen nhân,…[12]. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-bound starch synthase, GBSSI) là chỉ thị DNA đã được sử dụng thành công để xây dựng cây phát sinh chủng loại của họ Araliaceae ở châu Á [39]. Nhưng chỉ thị GBSSI có phải là chỉ thị tốt để đánh giá đa dạng di truyền loài Dây Thường Xuân Việt Nam là một câu hỏi chưa có lời giải. Để có thêm thông tin di truyền của loài này, bước đầu tiên và cũng rất quan 1 trọng là tách chiết được DNA tổng số từ tế bào một cách hiệu quả. Có nhiều phương VN U pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu thực vật được công bố nhưng chưa có nghiên cứu nào đánh giá được phương pháp nào là hiệu quả nhất đối với mẫu lá khô Dây Thường Xuân. Vì vậy, vấn đề đặt ra hiện nay là cần nghiên cứu được quy trình tách chiết DNA tổng số cho sản phẩm có chất lượng tốt làm nguyên liệu cho phản ứng dP ha rm ac y, PCR, cung cấp những thông tin và hiện trạng di truyền của loài này góp phần vào chiến lược bảo tồn, khai thác bền vững nguồn dược liệu. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI” với 2 mục tiêu như sau: 1. Xác định được quy trình tách chiết DNA tổng số có hiệu quả từ mẫu lá khô của loài Dây Thường Xuân. ine an 2. Dựa vào giải trình tự gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI để bước đầu xác định được tính đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân thu nhập tại các tỉnh vùng núi phía Bắc Việt Nam nhằm phục vụ Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic cho việc khai thác, quản lý bền vững nguồn cây dược liệu. 2 VN U CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đa dạng di truyền 1.1.1. Khái niệm dP ha rm ac y, Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là sự giàu có về nguyên liệu di truyền trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường. Do vậy, đa dạng sinh học bao gồm 3 cấp độ: đa dạng gen, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái. Đa dạng di truyền là đa dạng ở cấp độ phân tử, đề cập đến sự biến đổi các đặc điểm di truyền giữa các cá thể trong loài và cả trong quần thể. Mỗi loài có chứa an những gen riêng biệt thể hiện đặc tính riêng của nó như một cách để các quần thể có thể thích nghi được với môi trường sống thay đổi. Với các áp lực như: chọn lọc nhân tạo, môi trường sống khắc nhiệt,… một số cá thể trong một quần thể sẽ có cơ ed ic ine hội cao hơn trong việc sở hữu những biến dị alen phù hợp với môi trường giúp duy trì nòi giống có alen đó trong cơ thể. Quần thể đó sẽ tiếp tục có thêm nhiều thế hệ nhờ sự thành công của những cá thể này. Sc ho ol of M Vì vậy, đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể. Đa dạng sinh học dù trong phạm vi một loài hay giữa các loài và các hệ sinh thái với nhau thì cũng đều xuất phát từ đa dạng di truyền. Và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất về sự khác biệt giữa các loài. Tuy nhiên, đa dạng di truyền vẫn chưa được quan tâm đúng mức mặc dù các loại đa dạng này chính là nền tảng cho sự đa dạng của sinh giới [4]. 1.1.2. Phân loại học sinh vật rig ht @ Phân loại học sinh vật là sự sắp xếp các sinh vật theo các đơn vị phân loại (taxon) phù hợp dựa trên những đặc điểm giống nhau của chúng. Đồng thời, hệ thống phân loại có thể giúp dự đoán được vị trí của sinh vật trong hệ thống phân loại, giúp ta hiểu rõ được quá trình tiến hóa của sinh vật. Một ý nghĩa thực tiễn quan Co py trọng khác là nhờ có hệ thống phân loại với hệ thống danh pháp khoa học đặt cho sinh vật đã giúp tránh được nhầm lẫn vì nhiều sinh vật mang tên dân gian, được gọi tên khác nhau ở các vùng đất khác nhau [11]. 3 Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định VN U loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của dP ha rm ac y, các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan, nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích một hoặc nhiều tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. ed ic ine an Việc ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại học là một phương pháp mới: giúp xác định các loài dựa trên trình tự DNA nucleotit của một đoạn gen đặc trưng được coi như dấu hiệu đặc trưng cho loài. Phương pháp này đặc biệt có ích trong trường hợp giải quyết các vấn đề về loài đồng hình hay nghiên cứu các biến dị. Các dữ liệu về trình tự DNA nucleotit của các loài được tạo thành hệ thống dữ liệu mã vạch DNA. M Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen nhân, hệ gen của các bào quan như ty thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như of protein, enzym. Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và Sc ho ol mục đích nghiên cứu khác nhau. Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzym), giải trình tự DNA, đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism), đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn DNA được nhân bản (Amplified Fragment Length Polymorphism),…[12] đã giúp py rig ht @ giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật. Thêm vào đó các kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm loài. Co 1.1.3. Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam Việt Nam xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học, được biết đến như một trung tâm đa dạng sinh học của thế giới với các hệ sinh thái tự nhiên phong phú và 4 đa dạng. Trong đó, đã xác định được khoảng 49.200 loài sinh vật bao gồm: khoảng VN U 7.500 chủng vi sinh vật; 20.000 loài thực vật trên cạn và dưới nước; 10.500 loài động vật trên cạn; 2.000 loài động vật không xương sống và cá sống ở nước ngọt; khoảng trên 11.000 loài sinh vật biển. Đặc biệt, một bộ phận lớn của các giống thực vật, động vật này có các đặc tính quý chỉ có ở nước ta, nên tiềm năng phát triển và ac y, đem lại giá trị kinh tế rất cao [6]. dP ha rm Với số lượng 500 loài nguồn gen dược liệu, sở hữu nhiều loài dược liệu quý, hiếm và là nơi có nguồn đa dạng sinh học phong phú, nhưng những sản phẩm từ dược liệu quý của nước ta chưa trở thành hàng hóa có giá trị cao và chưa được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng. Điển hình trong số đó là chi Hedera, phân bố trên thế giới trên 16 loài nhưng chỉ có 2 loài H.nepalensis (Dây Thường Xuân, xuất hiện tại một số tỉnh miền núi phía Bắc) và H.helix (Thường Xuân) được chứng minh là ine an có tác dụng dược lý trong phòng và điều trị bệnh. Mặc dù có những tiềm năng dược lý song hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về H.nepalensis, đặc biệt là các nghiên cứu đánh giá tiềm năng đa dạng sinh học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và ed ic phát triển nguồn gen ở Việt Nam. Chưa kể đến, việc phân loại và định danh Dây Thường Xuân dựa vào đặc điểm hình thái có thể dễ gây nhầm lẫn do đặc điểm xẻ thùy của lá cây (phần hay được thu hái làm thuốc) có mức độ phân hóa lớn. Vậy ho ol 1.1.4. Mã vạch DNA of M nên, phân tích đa dạng di truyền và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng về nguồn gen góp phần giải quyết nhu cầu khai thác hiệu quả và quản lý bền vững nguồn tài nguyên dược liệu. Sc Mã vạch DNA là một khái niệm tương đối mới nhằm cung cấp nhận dạng loài nhanh chóng, chính xác và tự động hóa, bằng cách sử dụng đoạn DNA ngắn của hệ gen như một mã vạch đặc trưng để nhận diện. Mã vạch DNA có tiềm năng trong phân loại học và trong các ngành khoa học khác như là khoa học pháp y, công rig ht @ nghệ sinh học, công nghiệp thực phẩm,…giúp cung cấp cái nhìn sâu hơn để nhận diện, phân định ranh giới giữa các loài và góp phần nhận diện các mẫu vật chưa xác định được thuộc loài nào [28]. Co py Ước tính có khoảng 300.000 loài thực vật trên thế giới, việc phân loại và xác định chính xác một số lượng lớn các loài như vậy vẫn đang còn là một thách thức ngay cả với các chuyên gia phân loại. Hơn nữa, phân loại từng loài dựa trên chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái, giải phẫu) mất rất nhiều thời gian và công sức, lại chỉ phù hợp ở từng giai đoạn sống, giới tính cụ thể của loài, nhiều cá thể sẽ không 5 nhận định được. Sự xuất hiện của mã vạch DNA đã có tác động tích cực đến phân ngày càng trở nên phổ biến, có ý nghĩa trên quy mô toàn cầu [28]. VN U loại học giúp đáp ứng tốt những hạn chế của phương pháp truyền thống trước kia và Đặc điểm quan trọng nhất của mã vạch DNA là tính đặc hiệu cao dễ sử dụng. Một mã vạch DNA lý tưởng cần đáp ứng các tiêu chí sau: Một là, nó phải đủ độ đột dP ha rm ac y, biến phân biệt giữa các loài khác nhau và phải có vùng bảo tồn để nhận diện được giữa những cá thể thuộc cùng một loài [34,15]. Hai là, phổ biến trong các loài để có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau. Ba là, đoạn DNA đủ ngắn (khoảng 700 bp hoặc nhỏ hơn [19]) chứa đủ thông tin phát sinh gen để dễ dàng định danh các loài cho nhóm phân loại của nó một cách nhanh chóng. Cuối cùng, các vị trí mồi được bảo tồn cao, khuếch đại và giải trình tự DNA có độ tin cậy cao. Năm 2004, hiệp hội mã vạch cho cuộc sống (barcode of life) được thành lập ine an nhằm mục đích xác định một công cụ mã vạch chính xác, đáng tin cậy cho nghiên cứu về phân loại thực vật và động vật. Năm 2006, Hebert và các cộng sự của ông đã đề xuất sử dụng gen ti thể cytochrom oxyase tiểu đơn vị 1 (CO1) như là một trình tự ed ic mã vạch chung cho động vật. Và kể từ đó, đã có hàng loạt ấn phẩm minh chứng sự hữu ích của nó trong phân loại các loài động vật [32]. CO1 không chỉ chứa vùng of M trình tự được bảo tồn cao trong một loài mà còn chứa đủ biến dị phục vụ nghiên cứu phân biệt giữa các nhóm riêng biệt trong một loài. Ghi nhận về CO1 còn cho biết khả năng phân biệt nhiều mẫu động vật cùng tổ tiên và thậm chí có hiệu suất cao ngay cả với những mẫu đã lưu trữ qua thời gian dài. Sc ho ol Đối với mã vạch DNA ở thực vật, gen lục lạp được xem là mã vạch có độ tin cậy cao trong xác định các loài thực vật do sự biến đổi rất chậm của hệ gen ty thể. Có một số mã vạch thường được sử dụng cho thực vật như: matK, RbcL, TrnHpsbA. Gen matK có tốc độ tiến hóa cao, chiều dài phù hợp và sự khác biệt rõ ràng giữa các vùng cũng như tỷ lệ chuyển đổi thấp [31]. Tuy nhiên, để thực hiện phản Co py rig ht @ ứng PCR khuếch đại gen matK thì sử dụng một cặp mồi đơn thường không đem lại hiệu quả cao. Các loài khác nhau yêu cầu cặp mồi khác nhau, hiệu suất nhân dòng các loài cũng khác nhau. Gen matK có thể phân biệt được >90% trong các loài phong lan, tuy nhiên lại chưa đến 49% trong họ hạt nhục đậu khấu [47]. Gen rbcL được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phát sinh gen với hơn 50.000 trình tự có sẵn trong Genbank. Những lợi thế của gen này là dễ dàng khuếch đại trình tự và là một mã vạch DNA tốt trong phân loại thực vật ở cấp độ gia đình và chi, nhưng lại không hiệu quả ở cấp độ loài [19]. trnH-psbA hiện đang là mã vạch được sử dụng 6 phổ biến, với những ưu điểm như thiết kề mồi đơn giản, chỉ sử dụng một cặp mồi VN U đơn để khuếch đại gen, nằm giữa 2 vùng trình tự bảo tồn cao là đoạn trình tự không mã hóa có tỷ lệ biến đổi cao [33]. Tuy nhiên độ dài chuỗi trình tự TrnH-psbA ngắn trong chi Solidago có thể là nhược điểm của mã vạch này khi không cung cấp đủ biến dị cho phân tích phân loại. Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị dP ha rm ac y, DNA chung cho các loài gặp nhiều khó khăn. Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật. Ở hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi vùng sao chép nội bộ (Internal Transcribed Spacer, ITS) và vùng gen nhân có số lượng bản sao thấp như gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI cũng được sử dụng trong việc phân loại thực vật và cho hiệu quả cao. Hiện nay hệ thống mã vạch DNA cho thực vật vẫn ine an chưa hoàn chỉnh. Tuy nhiên, với các trình tự mã vạch DNA này, các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ra một triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinh học [5]. ed ic 1.1.5. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt of M Quan tâm đến việc sử dụng các gen nhân có số lượng bản sao thấp để phân tích phát sinh thực vật đã phát triển nhanh chóng, đặc biệt khi mà các chỉ thị phổ biến như DNA lục lạp và DNA ribosom không thể tạo ra các giả thuyết phát sinh gen mạnh. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule Bound Starch Synthase I, Sc ho ol GBSSI), hay gen waxy chỉ có một bản sao duy nhất trong tế bào. Những đoạn exon của GBSSI có tốc độ thay thế nucleotit tương đối chậm nên có vai trò là vùng bảo tồn, trong khi đó những đoạn không được mã hóa inton lại có tỷ lệ thay thế nucleotit khá cao cung cấp các dấu hiệu phát sinh gen ở các bậc phân loại [45]. Hiện tại, dữ liệu về gen GBSSI vẫn chưa được hiểu đầy đủ, và còn cần Co py rig ht @ nghiên cứu thêm. GBSSI là một chỉ thị còn mới trong nghiên cứu phân tử để nghiên cứu phát sinh loài với kích thước gen khoảng 4 kb, bao gồm 13 intron trong Solanum tuberosum và có khả năng là một nguồn thông tin hữu ích về thực vật học [39, 21]. 7 VN U trí cặp mồi nhân dòng [39] ac y, Hình 1.1. Cấu trúc một phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae. Mũi tên chỉ vị dP ha rm 1.2. Tổng quan về loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) 1.2.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây Thường Xuân * Đặc điểm hình thái chung của chi Hedera Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật như sau: ine Lớp Ngọc lan Magnoliopsida an Ngành Ngọc lan Magnoliophyta ed ic Phân lớp Hoa hồng Rosidae Bộ Hoa tán Apiales M Họ Nhân sâm Araliaceae Chi Hedera Sc ho ol of Cho đến ngày nay, chi Hedera đã ghi nhận tổng cộng 16 loài với đặc điểm hình thái chung dây leo, mọc thành một lớp bao phủ mặt đất với chiều cao từ 6-10 cm, có thể leo cao tới 30 m [20]. Hedera có thể leo được là nhờ hệ thống rễ mọc ký sinh có thể tạo ra chất bám dính. Lá cây thuộc loại lá đơn, không có lá kèm, phiến lá phân thùy, dài 5-10 cm, rộng 3-8 cm, gân chân vịt. Cụm hoa chùy, gồm nhiều tán, có lông sao. Hoa nhỏ, màu vàng trắng và lục trắng, lá bắc rất nhỏ, dài có ht @ 5 răng nhỏ, tràng 5, gốc rộng, có một mào cuốn ở giữa, nhị 5, bầu 5. Quả hạch tròn, mọng dài từ 5-9 mm, đường kính 6-9 mm, trọng lượng trung bình khoảng 281,5 mg, trái của nó chứa từ 2-5 hạt, quả khi chín có màu đen [1, 17]. rig * Đặc điểm hình thái loài Hedera nepalensis Co py H.nepalnensis K.Koch là loài có dây leo có thể dài tới 20 m, có nhiều rễ mọc ký sinh ở các mắt, lá đơn, cụm hoa mọc dấu ở cành thành tán tròn hoặc tán ngù, mọc rải rác trong rừng thưa; phổ biến ở độ cao 1000-3000 m [3]. 8 VN U ac y, dP ha rm Hình 1.2. Cây Dây Thường Xuân [53] an 1.2.2. Đặc điểm phân bố địa lý rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine Hedera nepalensis K. Koch thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), có nguồn gốc từ Nepal, Bhutan cũng như ở Trung Quốc, Afganistan, Ấn Độ, Lào, Thái Lan, Myanmar và Việt Nam ở độ cao khoảng 1000-3000 m [51]. Tại Việt Nam Dây Thường Xuân được tìm thấy ở một số vùng núi cao phía Bắc như Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn Hình 1.3 [2]. Co py Hình 1.3. Phân bố địa lý của Dây Thường Xuân tại phía Bắc Việt Nam [2] 9 1.2.3. Thành phần hóa học VN U Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, thành phần hóa học chủ yếu trong lá và thân của H.nepalensis K. Koch là saponin. Trong đó, hai hợp chất chính có tác dụng chống ung thư hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A đã được T. Li và cộng sự phân lập bằng phương pháp sắc ký hóa học và phương pháp dP ha rm ac y, quang phổ vào năm 2015 [36]. Ngoài ra, các hợp chất phenolic và phenolic có khả năng chống oxy hóa cũng được phát hiện trong H.nepalensis khi định tính bằng phương pháp so màu với quercetin và axit gallic. Để định lượng các hợp chất trên phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được sử dụng. Hai hợp chất catechin và caffeic cũng được tìm thấy trong phân đoạn etyl acetate của H.nepalensis. Các phân tích hóa sinh đã chứng minh trong Dây Thường Xuân còn có chứa các nhóm chất khác như: carbohydrate, protein, alkaloid, tanin, terpenoid và các hợp chất ho ol of M ed ic ine an phytosterol [22, 41, 30, 42]. Sc Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A [26] 1.2.4. Tác dụng dược lý @ 1.2.4.1. Theo y học cổ truyền ht Bộ phận dùng: rễ, thân, lá và quả tươi hoặc phơi khô. py rig Về tính vị quy kinh: Dây Thường Xuân có vị đắng, tính mát thường có tác dụng trong khu phong, giải độc, hoạt huyết, tiêu sưng; quả vị ngọt, tính ấm được dùng để trừ phong huyết. Co Công dụng: Chữa đơn sưng: chế rượu với lá thường xuân giã nhỏ, gạn lấy dịch uống, phần bã còn lại được đắp vào chỗ sưng đau. Khi gặp vấn đề về mụn lở 10 thì lấy thân hoặc rễ cây sắc thuốc hoặc ngâm với rượu uống. Sắc hoặc ngâm rượu VN U với quả Dây Thường Xuân có công dụng chữa huyết bế trong bụng, giúp giảm các triệu chứng đau lưng, mỏi gối ở người già [2]. Ở Ấn Độ, lá cây còn có thể dùng làm thuốc chườm nóng trị sưng hạch, quả dùng hãm uống tác dụng trị thấp khớp [3]. ac y, 1.2.4.2. Theo y học hiện đại Tác dụng chống đái tháo đường: dP ha rm Một nghiên cứu đã được thực hiện trên chuột mắc bệnh tiểu đường nhằm đánh giá hiệu quả của dịch chiết thô H.nepalensis. Hiệu quả được đánh giá dựa trên nồng độ glucose đo bằng máy đo đường huyết, sau đó so sánh các thông số giữa chuột được điều trị và không được điều trị. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra ine an H.nepalensis làm giảm đáng kể mức đường huyết theo thời gian và làm phục hồi chức năng gan [26]. Nghiên cứu khác cũng chỉ ra H.nepalensis chứa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính ức chế dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4). Một trong số cơ chế của thuốc chống đái tháo đường hiện nay dựa trên nguyên lý ức chế DPP-4, đây là một enzym phá hủy incretins. Incretins là hóc-môn tự nhiên do cơ thể tiết ra lượng lớn ed ic sau bữa ăn, với vai trò điều chỉnh lượng đường huyết thông qua kích thích tuyến tụy tiết insulin. Khi ức chế enzym DPP-4 sẽ làm tăng nồng độ và kéo dài thời gian tác of M dụng của incretins, làm tăng tiết insulin và giảm tiết glucagon trong tuần hoàn, dẫn đến giảm glucose máu. Do đó, H.nepalensis được đánh giá có tiềm năng trong điều trị đái tháo đường [44]. ho ol Tác dụng chống oxy hóa: Co py rig ht @ Sc Nghiên cứu của Samia Inayatullah và cộng sự về tiềm năng chống oxy hóa của dịch chiết methanol H.nepalensis thử nghiệm trong môi trường nước và lipid. Khả năng chống oxy hóa đã được nghiên cứu trong nước bằng cách sử dụng xét nghiệm quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và gốc ABTS (2,2’azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate). Trong khi hoạt tính chống oxy hóa trong lipid được xác định bằng đánh giá chỉ số ôi hóa (TBARS - Thiobarbituric Acid Reactive Substances). Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế diệt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch có chứa nồng độ chất tự do xác định. Sau đó, khả năng chống oxy hóa xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ở bước sóng thích hợp. Nghiên cứu đưa ra kết quả hàm lượng gốc DPPH là 26,7 ± 0,2 (mM TE/g); ABTS là 54,7 ± 1,6 (mmol TE/g); TBARS là 393 ± 3,4 (mmol TE/g). Trong đó, mM TE/g là µmol đương lượng chất chuẩn Trolox (Trolox Equivalent - 11 TE) trên 1 g chất khô. Hai hợp chất chính trong dịch chiết thô của H.nepalensis có VN U chất có khả năng chống oxy hóa là axit chlorogen và rutin [36]. Nghiên cứu khám phá các chất chống oxy hóa tự nhiên bao gồm nghiên cứu các hợp chất polyphenolic và khả năng chống oxy hóa của H.nepalensis cũng đã được thực hiện. Nguyên liệu sử dụng là dịch chiết thô và các dịch chiết phân đoạn dP ha rm ac y, của nó thu trong dung môi: n-hexan, ethyl acetate và nước. Tổng hàm lượng flavonoid và phenolic được định tính bằng phương pháp so màu sử dụng quercetin và axit gallic. Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) để phát hiện các hợp chất flavonoid. Theo đó, hàm lượng flavonoid là 2,4 ± 0,164 QE /100 mg (đương lượng quercetintrên mỗi gram dịch chiết) và hàm lượng phenolic là 12,90 ± 0,15 mg GAE/100 mg (GAE/g - đương lượng acid galic trên mỗi gram dịch chiết). Tác dụng chống oxy hóa được đánh giá bằng khả năng dọn sạch nhóm hydro ine an peroxide (H2O2). Các chiết suất thô cũng như phân đoạn của H.nepalensis cho thấy khả năng chống oxy hóa cao với chỉ số IC50 từ 31,19 đến 200 µg/mL. Trong đó, dịch chiết ethyl acetate được cho là có khả năng chống oxy hóa cao nhất, dịch chiết ed ic n-hexan thấp hơn và sau cùng là dịch chiết với nước [35]. Tác dụng chống ung thư: Sc ho ol of M Laila Jafri và cộng sự đã thực hiện phân tích các đặc tính hóa học và gây độc tế bào ung thư trong ống nghiệm của cây. Xét nghiệm hóa trị ung thư trong ống nghiệm được thực hiện bằng xét nghiệm nitrite, xét nghiệm NFB, xét nghiệm aromatase và xét nghiệm quinone reductase 1 (QR1). Tiềm năng gây độc tế bào được đánh giá trên ba dòng tế bào ung thư: MCF-7, MDA-MB-231 và xét nghiệm sulforhodamine B (SRB). Kết quả xét nghiệm hóa trị ung thư cho thấy các dịch chiết phân đoạn n-hexan và ethyl acetate của cây được thử nghiệm có tiềm năng ngăn ngừa ung thư. Dịch chiết thô và các phần dịch chiết phân đoạn của nó đã ức chế sự tăng trưởng của ba dòng tế bào ung thư hơn 60%, giá trị IC50 của lupeol thay rig ht @ đổi từ 2,32 đến 10,2 μM. Định lượng lupeol dựa trên HPLC-DAD trong các mô thực vật khác nhau đã được chứng minh rằng lá của H.nepalensis là một nguồn lupeol phong phú (0,196 mg/100 mg trọng lượng khô) [29]. Co py Hai hợp chất chống ung thư chính là hederagenin 3-O-α-Larabinopyranoside (IC50 = 13,69 ± 1,29 g/mL) và pulsatilla saponin A (IC50 = 2,80 ± 0,94 g/mL) có vai trò chính cho các hoạt động chống ung thư của H.nepalensis K. Koch, được nghiên cứu bởi T.Li và cộng sự. Các hợp chất được phát hiện thông qua các phương pháp sắc ký hóa học và phương pháp quang phổ. Thực hiện phân lập 12