Tài liệu Lên men nước xoài bằng vi khuẩn acid lactic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊN MEN NƯỚC XOÀI BẰNG VI KHUẨN ACID LACTIC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: ThS. HUỲNH XUÂN PHONG NGUYỄN LÊ VÂN MSSV: 3082484 Lớp: Công nghệ Sinh học TT K34 Cần Thơ, Tháng 05/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. HUỲNH XUÂN PHONG NGUYỄN LÊ VÂN DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN .. .................................................................................................................... .. .................................................................................................................... .. .................................................................................................................... .. .................................................................................................................... .. .................................................................................................................... .. .................................................................................................................... Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Ngô Thị Phương Dung và Thầy Huỳnh Xuân Phong đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Anh Nguyễn Ngọc Thạnh và anh Phạm Hồng Quang đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc học tập và nghiên cứu của tôi. Các Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập. Các bạn học đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Và cuối cùng, tôi không thể quên công ơn của gia đình nhất là ba mẹ đã luôn luôn luôn động viên, ủng hộ tôi. Sinh viên Nguyễn Lê Vân Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƯỢC Vi khuẩn acid lactic là nhóm vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm lên men như sữa chua, nem chua, rau cải muối chua,… Nhằm tận dụng nguồn trái cây có sẵn và góp phần làm đa dạng hóa các sản phẩm từ xoài, đề tài được thực hiện nhằm tạo ra sản phẩm lên men từ nước ép xoài bằng vi khuẩn acid lactic, tạo sản phẩm probiotic có giá trị về mặt sinh học. 4 dòng vi khuẩn acid lactic từ nước xoài lên men đã được phân lập. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả 10 dòng vi khuẩn acid lactic đều có khả năng phát triển ở pH từ 1,5-3,5 sau 2 giờ ủ ở 37oC với mật số 6,806,91log CFU/mL. Hàm lượng acid lactic của dịch lên men từ 10 dòng vi khuẩn đạt 0,48-0,96 % w/v, mật số sau 2 giờ ủ ở 37oC trong khoảng 8,85-9,30 log CFU/mL. Trong đó, dòng vi khuẩn Lactobacillus acidophillus được phân lập từ bột men Ybio cho kết quả tốt nhất với hàm lượng acid lactic sau lên men là 0,96 % w/v. Dịch xoài được pha loãng với tỷ lệ 40% và đường phối chế 9% thích hợp để lên men nước xoài. Điều kiện thích hợp để lên men nước xoài là ở 37oC trong 36 giờ và mật số giống chủng là 5 log CFU/mL. Ở điều kiện này sẽ đảm bảo về mùi và vị sản phẩm cũng như yêu cầu về mật số vi khuẩn đối với sản phẩm probiotic (>6 log CFU/mL). Mùi, vị và mật số vi khuẩn vẫn được đảm bảo ở nhiệt độ tồn trữ 4-6 oC trong 2 tuần. Từ khóa: L. acidophillus, lên men, probiotic, vi khuẩn acid lactic, xoài. Chuyên ngành Công nghệ Snh học i Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC................................................................................................................ i MỤC LỤC .................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ iv DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................. v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... vi CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................... 1 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về probiotic ..................................................................................... 3 2.2. Sơ lược về vi khuẩn acid lactic ........................................................................ 4 2.2.1. Vi khuẩn acid lactic ...................................................................................... 4 2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn acid lactic .................. 6 2.3. Lên men acid lactic .......................................................................................... 7 2.3.1. Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid lactic .......................................... 7 2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng của quá trình lên men ................................................ 8 2.3.3. Ứng dụng thực tế của lên men acid lactic ..................................................... 8 2.4. Sơ lược về cây xoài ........................................................................................... 9 2.4.1. Cây xoài ....................................................................................................... 9 2.4.2. Công dụng của xoài .................................................................................... 10 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................ 11 3.1. Phương tiện .................................................................................................... 11 3.1.1. Thời gian và địa điểm ................................................................................. 11 3.1.2. Phương tiện ................................................................................................ 11 3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 12 3.2.1. Phân lập và định danh ở mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic ......... 12 3.2.2. Khảo sát khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic phân lập ............. 13 3.2.3. Khảo sát khả năng lên men nước xoài bằng vi khuẩn acid lactic................. 14 3.2.4. Khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch xoài và tỷ lệ phối chế đường saccharose ....... 14 3.2.5. Khảo sát mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men....................... 16 3.2.6. Khảo sát nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm ......................................... 18 3.2.7. Xử lý thống kê............................................................................................ 18 Chuyên ngành Công nghệ Snh học ii Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN.................................................................. 19 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn acid lactic ............................................................... 19 4.2. Khả năng phát triển trong môi trường có pH thấp của 10 dòng vi khuẩn acid lactic phân lập ................................................................................................. 22 4.3. Khả năng ứng dụng trong lên men nước xoài bằng vi khuẩn acid lactic............ 24 4.4. Tỷ lệ pha loãng dịch xoài và phối chế đường saccharose .................................. 26 4.5. Ảnh hưởng của mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men .................. 31 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm ..................................... 36 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 38 5.1. Kết luận ........................................................................................................... 38 5.2. Đề nghị ............................................................................................................ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 39 PHỤ LỤC Chuyên ngành Công nghệ Snh học iii Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Tỷ lệ thành phần môi trường MRS agar ........................................................ 12 Bảng 2. Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic ................................... 20 Bảng 3. Mật số vi khuẩn trong môi trường MRS lỏng có pH thấp .............................. 23 Bảng 4. Một số chỉ tiêu sau lên men nước xoài .......................................................... 25 Bảng 5. Một số chỉ tiêu sản phẩm dịch xoài lên men .................................................. 27 Bảng 6. Mô tả một số chỉ tiêu sản phẩm ..................................................................... 29 Bảng 7. Kết quả đánh giá cảm quan về nồng độ đường phối chế và tỷ lệ pha loãng ... 30 Bảng 8. Kết quả khảo sát mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men ............. 31 Bảng 9. Kết quả đánh giá cảm quan về mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men ........................................................................................................ 35 Bảng 10. Kết quả khảo sát nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm.............................. 36 Chuyên ngành Công nghệ Snh học iv Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Quả xoài.......................................................................................................... 9 Hình 2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch xoài và tỷ lệ phối chế đường saccharose ......................................................................................... 15 Hình 3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men ........................................................................................................ 17 Hình 4. Hình vi khuẩn T223 phân lập từ nước ép xoài thanh ca dưới KHV (X100) ... 19 Hình 5. Hình vi khuẩn C213 phân lập từ nước ép xoài cát chu dưới KHV (X100) ..... 19 Hình 6. Hình thử nghiệm oxydase .............................................................................. 21 Hình 7. Hình thử nghiệm CaCO3 ............................................................................... 22 Hình 8. Sự thay đổi hàm lượng acid lactic theo nồng độ đường và độ pha loãng dịch xoài .............................................................................................................. 28 Hình 9. Sự thay đổi mật số vi khuẩn acid lactic theo nồng độ đường và tỷ lệ pha loãng dịch xoài....................................................................................................... 29 Hình 10. Hàm lượng acid thay đổi theo nhiệt độ, mật số giống chủng và thời gian lên men .............................................................................................................. 33 Hình 11. Mật số vi khuẩn thay đổi theo nhiệt độ, mật số giống chủng và thời gian lên men .............................................................................................................. 34 Chuyên ngành Công nghệ Snh học v Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nation WHO : World Health Organization MRS : De Man, Rogosa and Sharpe CFU : Cell forming unit KHV : Kính hiển vi L. acidophillus: Lactobacillus acidophilus Chuyên ngành Công nghệ Snh học vi Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Thực phẩm là một nhu cầu thiết yếu không thể thiếu đối với con người. Xã hội ngày càng phát triển, đời sống của con người ngày càng được nâng cao. Vì vậy, nên việc ăn no không còn là nhu cầu chính mà nhu cầu thưởng thức và tìm hiểu tác dụng của thực phẩm đối với sức khỏe được đặt lên hàng đầu. Từ đó, mối quan hệ giữa các sản phẩm thực phẩm và chế độ dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe cũng như giúp cơ thể chống lại được bệnh tật đã trở thành khuynh hướng nghiên cứu của các chuyên gia dinh dưỡng và các nhà khoa học nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị cao về mặt sinh học, được gọi là sản phẩm “probiotic” (chế phẩm sinh học). Sản phẩm probiotic được định nghĩa là “những vi sinh vật không gây bệnh có khả năng tồn tại sau quá trình tiêu hóa có tác động tích cực đến sức khỏe và sinh lý của vật chủ”. Hiện nay có nhiều sản phẩm probiotic sử dụng cho người, vật nuôi, cây trồng được sản xuất và sử dụng dưới dạng lỏng hoặc dạng bột. Vi khuẩn acid lactic là nhóm vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm probiotic như sữa chua, nem chua, rau cải muối chua,… Những sản phẩm này không chỉ dùng để ăn uống mà còn dùng để chữa bệnh đường ruột, dạ dày, do vi khuẩn acid lactic có khả năng tạo ra kháng sinh ngăn chặn, tiêu diệt các vi khuẩn và vi trùng gây bệnh. Nước trái cây là môi trường tốt cho sự phát triển các vi khuẩn và các sản phẩm probiotic. Trái cây và rau cải là những thực phẩm có lợi cho sức khỏe bởi chúng chứa nhiều chất chống oxy hóa, vitamin, chất xơ và khoáng. Hơn nữa, chúng không chứa bất kỳ chất gây dị ứng cho người tiêu dùng. Trong các loại trái cây thì xoài là một loại trái cây phổ biến và có giá trị dinh dưỡng cao. Quả xoài chín có màu vàng hấp dẫn, vị chua ngọt, mùi thơm ngon được nhiều người ưa thích. Xoài chứa nhiều vitamin A, C, đường, các acid hữu cơ nên xoài được sử dụng rộng rãi cả trái già còn xanh và trái chín. Xoài được dùng để ăn tươi, làm nước trái cây, mứt, kẹo. Nhằm để tận dụng nguồn nguyên liệu phổ biến và có giá trị dinh dưỡng cao cũng như làm đa dạng hóa các sản phẩm chế biến từ xoài. Đề tài này thực hiện nhằm lên men nước xoài bằng vi khuẩn acid lactic tạo sản phẩm có giá trị về mặt sinh học. Chuyên ngành Công nghệ Snh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ Mục tiêu đề tài Khảo sát các điều kiện lên men nước xoài bằng vi khuẩn acid lactic. Nội dung thực hiện - Phân lập và định danh ở mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic. - Khảo sát khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic được phân lập. - Khảo sát khả năng ứng dụng trong sản xuất nước xoài lên men bằng vi khuẩn acid lactic. - Khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch xoài và tỷ lệ phối chế đường saccharose . - Khảo sát mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men. - Khảo sát nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm. Chuyên ngành Công nghệ Snh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về probiotic Từ probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”. Theo Tổ chức lương nông thế giới (FAO) hay Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thì probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của ký chủ. Có rất nhiều định nghĩa về probiotic, “những vi sinh vật sống với số lượng đủ sau quá trình tiêu hóa có tác dụng tốt cho sức khỏe ngoài những giá trị dinh dưỡng căn bản” (Guarner và Schaafsma, 1998). Ngoài ra, theo Schrezenmier và De Vrese (2001) thì probiotic được định nghĩa là “những vi sinh vật không gây bệnh có khả năng tồn tại sau quá trình tiêu hóa có tác động tích cực đến sức khỏe và sinh lý của vật chủ”. Theo Guarner và Schaafsma (1998), Schrezenmier và de Vrese (2001), một trong những tiêu chuẩn của sản phẩm probiotic là khả năng sống sót của vi sinh vật sau quá trình tiêu hoá. Trong hệ thống tiêu hoá, pH của dịch dạ dày rất thấp, khoảng 12 cho nên đa số vi sinh vật đều khó tồn tại ở khoảng pH này. Tuy nhiên, các vi sinh vật cũng chỉ chịu đựng ở mức pH thấp này trong dạ dày khoảng 1-2 giờ và sau đó sẽ di chuyển xuống ruột già, có giá trị pH gần trung tính hơn. Theo Gregor (1999) thì các vi sinh vật dùng trong các sản phẩm probiotic thường có các đặc điểm sau: có khả năng bám vào tế bào; loại trừ hoặc làm giảm sự bám của mầm bệnh; bảo tồn và nhân nhanh số lượng; sản sinh acid, H2O2, chất kháng sinh từ vi khuẩn có khả năng ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh; chịu được chất khử trùng âm đạo, bao gồm cả chất diệt trùng; an toàn và không viêm nhiễm, không sinh chất gây ung thư và không là mầm bệnh. Ngoài ra, các vi sinh vật này còn phải chịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non. Nhưng đặc điểm quan trọng nhất là các vi khuẩn phải sống và mật số tế bào tối thiểu 6 log CFU/g (Ravula và Shah, 1998; Roy, 2001; Shah, 2000; Vinderola và Reinheimer, 2000; Talwalkar và Kailasapathy, 2004). Các vi sinh vật sử dụng trong các sản phẩm probiotic phổ biến hiện nay là nhóm vi khuẩn acid lactic, trong đó chủ yếu là nhóm Lactobacilli (L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. rhamnosus) và nhóm Bifidobacteria (B. longum, B. bifidum, B. breve, B. infantis). Các sản phẩm probiotic có tác động tích cực về mặt sức khỏe như: điều tiết hệ miễn dịch, tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B, tăng hấp thụ chất Chuyên ngành Công nghệ Snh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ khoáng, giảm cholesterol trong máu, tăng cường sức khỏe âm đạo đối với phụ nữ, điều trị chứng viêm khớp, ngăn ngừa bệnh ung thư, cải thiện sự không dung nạp lactose, ngăn ngừa hoặc làm giảm tác động của bệnh viêm da dị ứng, táo bón cũng như sự viêm nhiễm của hệ thống bài tiết. Hơn nữa, Patterson (2003) cũng đã chỉ ra các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với nhiều khía cạnh trong đời sống dựa trên các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả: probiotic giúp thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ, tăng cường khả năng miễn dịch, giảm phản ứng viêm, tăng sản xuất các acid béo bay hơi, tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B, tăng hấp thu chất khoáng, giảm cholesterol huyết thanh, giảm hàm lượng ammoniac và urea trong chất thải, ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Hiện nay, các sản phẩm probiotic thường được sử dụng là dạng sữa lên men. Tuy nhiên, tính không dung nạp lactose và hàm lượng cholesterol là hai trở ngại liên quan đến người tiêu dùng. Từ đó, nước trái cây được đề nghị là một môi trường tốt cho sự lên men tạo các sản phẩm probiotic (Mattila - Sandholm et al., 2002). 2.2. Sơ lược về vi khuẩn acid lactic 2.2.1. Vi khuẩn acid lactic Vi khuẩn acid lactic (LAB) là những vi khuẩn lên men acid lactic, là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hầu hết không di động, oxydase và catalase âm tính. Chúng không có khả năng tổng hợp nhân hem của porphyrin và không chứa cytochrom. Khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần thiết cho sự sống của những vi khuẩn này là rất yếu, cho nên đa số vi khuẩn acid lactic rất kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môi trường có đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin, peptide, protein, vitamin,… vì vậy môi trường nuôi vi khuẩn có thành phần khá phức tạp. Vi khuẩn acid lactic có thể lên men được các đường monosaccharide và disaccharide nhưng không có khả năng lên men tinh bột (chỉ có loài L. delbrueckii là đồng hóa tinh bột). Chúng là những vi sinh vật sống kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí, có khả năng lên men ở những điều kiện hiếu khí cũng như kỵ khí. Vi khuẩn acid lactic thường có dạng hình cầu hoặc hình que, đường kính của dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5-1,5 µm, các tế bào hình cầu xếp thành từng cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào vi khuẩn acid lactic từ 1-8 µm, vi khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi (Lương Đức Phẩm, 2001). Chuyên ngành Công nghệ Snh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ Theo Rachel và Adebayo-Tayo (2012) trích dẫn từ Oliveira (2008) thì vi khuẩn acid lactic có khả năng sản sinh ra các hợp chất kháng vi sinh như ethanol, acid formic, hydrogen perocide, diacetyl và bacteriocins. Vi khuẩn acid lactic có khả năng sản sinh ra probiotic (Temmerman et al., 2002). Hơn nữa, vi khuẩn acid lactic cũng tạo ra những hợp chất hữu cơ giúp tạo mùi và hương vị cho sản phẩm lên men (Caplice và Fitzgerald, 1999). Vi khuẩn acid lactic có đặc điểm là sinh acid lactic trong sự biến dưỡng chất bột đường. Dựa vào sự biến dưỡng glucose vi khuẩn acid lactic được chia làm 2 loại: vi khuẩn acid lactic đồng hình và vi khuẩn acid lactic dị hình. - Vi khuẩn acid lactic đồng hình: sản phẩm chủ yếu là acid lactic. Một số vi khuẩn acid lactic lên men đồng hình (Lê Mỹ Hồng, 2000): Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus , Lactobacillus acidophilus, Pediococcus cereviceae,… - Vi khuẩn acid lactic dị hình: ngoài acid lactic còn có thêm các sản phẩm khác như acid acetic, acid formic, acid succinic, ethanol và CO2. Một số vi khuẩn acid lactic lên men dị hình: Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus pentoaceticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lycopersici, Betabacterium brevis,... Hai giống vi khuẩn acid lactic Lacbobacillus và Streptococcus cũng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong lên men với một số loài điển hình như: Lactobacillus brevis, Lactobacillus pasteurianus, Streptococcus falcalis, Streptococcus cumoris (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các vi khuẩn ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 35ºC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ thích hợp ở 40-45ºC, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (5ºC hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60-80ºC hầu hết chúng bị chết sau 10-30 phút. Vi khuẩn acid lactic có mặt ở rất nhiều nơi trong tự nhiên như trong đất, trong nước, không khí nhưng chủ yếu ở thực vật và một số thực phẩm (rau, quả, thịt, sữa,…) (Lương Đức Phẩm, 2001). Vi khuẩn acid lactic đóng vai trò quan trọng trong tiến trình lên men thực phẩm như sữa chua, nem chua, cơm mẻ, rau quả muối chua,… Ngoài ra, chúng được tìm thấy trong bột nhào chua, thức ăn gia súc ủ chua, nước thải nhà máy sản xuất tinh bột, nhà máy sữa, kẻ răng, đường hô hấp, đường tiêu hoá, đường sinh dục ở người và động vật (Phan Thanh Phong, 2006). Theo Mattila-Sandholm (2002) thì nước trái cây là môi trường tốt cho sự phát triển của các vi khuẩn và tạo sản phẩm probiotic. Chuyên ngành Công nghệ Snh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn acid lactic a. Dinh dưỡng carbon Vi khuẩn acid lactic có thể sử dụng được nhiều carbohydrate như glucose, lactose, saccharose, maltose,…để cung cấp năng lượng và tham gia vào cấu trúc của tế bào. Khi không có mặt cơ chất nguồn carbon, vi khuẩn sẽ sử dụng nguồn năng lượng và vật liệu tế bào là các acid amin (acid glutamic, arginine, tyrosine,…). b. Dinh dưỡng nitơ Đa số vi khuẩn acid lactic không có khả năng sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Do đó, vi khuẩn acid lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường để đảm bảo cho sự phát triển của chúng. c. Nguồn vitamin Vitamin rất cần cho sự phát triển của vi khuẩn acid lactic, các vitamin này đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của chúng. Vi khuẩn acid lactic nói chung, đặc biệt là trực khuẩn rất cần vitamin làm nguồn chất sinh trưởng. Rất ít vi khuẩn acid lactic có khả năng tổng hợp vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin như: riboflavin, thiamin, biotin. d. Các chất vô cơ Các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, phospho, natri, iot, mangan, lưu huỳnh cần cho sự phát triển và hoạt động sống của vi khuẩn acid lactic. Đặc biệt là mangan có tác dụng trong việc phòng ngừa sự tự phân của tế bào. Vi khuẩn làm giảm độ acid có trong môi trường cần có phức hợp các chất khoáng. Cầu khuẩn lên men acid lactic dị hình không phát triển được trên môi trường đã làm sạch các chất khoáng nhờ trao đổi ion. Ở các môi trường có bổ sung ion K+, Mg2+, Mn2+ sẽ giúp hoạt hóa các vi khuẩn đã kém hoạt lực. e. Oxy Quan hệ giữa các loài vi khuẩn với oxy ở mức độ hiếu khí của môi trường khác nhau là rất khác nhau. Trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt sẽ làm cho trực khuẩn lên men dị hình chậm phát triển ở giai đoạn đầu, sự sinh trưởng của trực khuẩn lên men đồng hình giảm 10%, lên men giảm 23%. Chuyên ngành Công nghệ Snh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ f. Nhiệt độ Nhiệt độ phát triển của các vi khuẩn acid lactic khác nhau thì khác nhau, tuy nhiên đại bộ phận vi khuẩn acid lactic bị ức chế hoạt động ở nhiệt độ 45ºC trở lên. Riêng loài Lactobacillus delbrueckii là loài phát triển và hoạt động mạnh ở nhiệt độ 50ºC. Khi gia nhiệt đến 60-80ºC hầu hết vi khuẩn acid lactic bị chết sau 10-30 phút. g. pH môi trường Các chủng vi khuẩn acid lactic chịu được pH thấp khác nhau, đối với vi khuẩn tách từ rượu vang có thể chịu được pH 3-3,5 hoặc thấp hơn. 2.3. Lên men acid lactic 2.3.1. Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid lactic Lên men acid lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn acid lactic. Lên men acid lactic là một trong những loại hình lên men điển hình nhất trong tự nhiên. Trong quá trình lên men xảy ra hàng loạt các quá trình: quá trình ly trích hay thẩm thấu của các chất từ mô bào thực vật, quá trình tăng sinh khối của vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn acid lactic), quá trình tạo acid lactic, quá trình ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối bởi acid lactic, quá trình tạo hương của sản phẩm. Dựa vào sản phẩm tạo thành sau lên men mà người ta chia chúng ra thành hai nhóm vi khuẩn: lên men đồng hình và lên men dị hình. - Lên men đồng hình: quá trình lên men tạo acid lactic theo chu trình EmbdenMeyerhorf. Trong tế bào vi khuẩn lên men acid lactic đồng hình có đầy đủ enzyme carboxylase, do vậy pyruvate không bị phân giải sâu hơn, thay vào đó nó nhận hydrogen được tách ra và chuyển tới pyruvate để tạo thành acid lactic. Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90% sản phẩm, chỉ một phần nhỏ pyruvate còn lại bị khử carbon chuyển thành các sản phẩm phụ khác. Phương trình tổng quát của quá trình lên men acid lactic đồng hình : C6H12O6 → 2CH3-CHOH-COOH + năng lượng - Lên men dị hình: xảy ra khi vi khuẩn acid lactic không có đủ các enzyme cơ bản của chu trình Embden-Meyerhorf là aldolase và trizaphosphattizomerase, vì vậy chúng đi theo con đường pentose phosphate. Sản phẩm của quá trình ngoài acid lactic còn có các sản phẩm phụ như acid acetic, acid formic, acid succinic, ethanol, CO2. Chuyên ngành Công nghệ Snh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng của quá trình lên men a. Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn acid lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài. Để điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào và duy trì sự sống, vi khuẩn acid lactic cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon, nguồn nitơ (peptone, acid amin), vitamin (B1, B2, B6, PP và Biotin), muối khoáng và các nguyên tố vi lượng (Mn, Mo, Zn, Cu,…). b. Các yếu tố môi trường - Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, tốc độ hình thành và giải phóng sản phẩm cuối cùng. - pH: mỗi loài vi sinh vật sẽ phát triển tối ưu trong một giới hạn pH nhất định. Đối với cùng một tác nhân vi sinh vật nhưng nuôi ở những môi trường pH khác nhau sẽ tạo ra các sản phẩm lên men khác nhau. - Nồng độ dịch lên men: nồng độ chất tan quá cao dẫn đến làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng sinh lý của vi sinh vật, kết quả làm ức chế hoạt động của vi sinh vật. - Hàm lượng giống: Hàm lượng giống sử dụng nhiều sẽ làm tăng tốc độ lên men và rút ngắn thời gian sản xuất. Tuy nhiên nếu sử dụng quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. 2.3.3. Ứng dụng thực tế của lên men acid lactic - Trong công nghiệp thực phẩm: acid lactic được sử dụng như là một chất gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, dịch quả, mứt, sirô. Thay thế acid citric trong sản xuất kẹo, đồ hộp,... Ngoài ra, acid lactic còn dùng để acid hóa rượu vang hoa quả nghèo acid, acid hóa dịch đường hóa trong công nghiệp sản xuất rượu mạnh và sản xuất bột chua trong ngành bánh mì. - Trong công nghiệp thực nhẹ: là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, nhuộm, thuộc da. - Vi khuẩn acid lactic có vai trò quan trọng trong sản xuất sữa chua, phomat, muối chua rau quả, sản xuất tương, ủ chua thức ăn gia súc. Chuyên ngành Công nghệ Snh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ - Trong y học: chữa bệnh đường ruột, acid lactic được ứng dụng trong phẫu thuật chỉnh hình. Trong phẫu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng một loại vật liệu có tên là purasorb đây là một hợp chất cao phân tử được sản xuất từ acid lactic. 2.4. Sơ lược về cây xoài 2.4.1 Cây xoài Xoài có tên khoa học là Mangifera indica L., thuộc họ Đào lộn hột (Anacadiaceae). Hình 1. Quả xoài (http://hieugiangbetter.com/?page=agridetail&id=46&cmid=3 , 22/01/2013) Xoài là cây ăn quả nhiệt đới, phần lớn các tác giả đều cho rằng nguồn gốc cây xoài ở miền Đông Ấn Độ và các vùng giáp ranh như Miến Điện, Việt Nam, Malaysia. Trên thế giới có khoảng 87 nước trồng xoài. Vùng Châu Á chiếm 2/3 diện tích trồng xoài trên thế giới. Ở Việt Nam xoài được trồng từ Nam chí Bắc, vùng trồng xoài tập trung từ Bình Định trở vào, nhiều nhất là các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long (Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ,…). Xoài là cây thân gỗ lớn, cao 10-20 m, tán rậm. Lá đơn, nguyên, mọc so le, phiến lá hình thuôn mũi mác, nhẵn, thơm. Hoa hợp thành chùm kép ở ngọn cành. Hoa nhỏ, màu vàng, có 5 lá đài nhỏ, có lông ở mặt ngoài, 5 cánh hoa có tuyến mật, 5 nhị nhưng chỉ có 1-2 nhị sinh sản. Quả chín màu vàng, thịt vàng, ngọt, thơm, nhân có xơ. Hạt rất to. Chuyên ngành Công nghệ Snh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ Xoài được chế biến thành những món tráng miệng với thực đơn đa dạng như: sinh tố, xoài dầm, kem xoài,…Xoài xanh còn là nguyên liệu để làm món gỏi xoài. Thành phần dinh dưỡng của xoài Trong quả xoài chín chứa nhiều sắc tố carotenoid, acid amin, sắt, magie, kali, vitamin C, E, flavonoid,…Ngoài ra trong xoài còn chứa các alkaloids và glycosides là những chất quan trọng trong dược phẩm (Madunagu et al., 1990; Ross and Brain, 1977). Thành phần dinh dưỡng của trái xoài có trọng lượng 250 g gồm có: 1,5 g protein; 1 g chất béo; 30 g chất bột đường; 3 g chất carotene, 110 g vitamin B1; 125 g vitamin B2; 2 mg vitamin B3; 90 g folic acid; 90 mg vitamin C; 30 mg calcium; 45 mg magnesium; 1 mg sắt; 295g kẽm; 0,5 g potassium. 2.4.2. Công dụng của xoài Theo Đông y, quả xoài chín có vị ngọt, chua, tính mát, tác dụng ích dạ dày, làm hết nôn mửa, thanh nhiệt, giải khát, nhuận phế, tiêu đàm. Thường dùng trong các trường hợp ho do nhiệt, tiêu hóa kém, suy nhược thần kinh, táo bón,…Thịt quả xoài chín thái lát mỏng hoặc giã nhuyễn, đắp chống bỏng, bảo vệ da chống lại sự tấn công của ánh nắng. Nwinuka et al., (2008) đã dựa vào các nghiên cứu của Angoha (1981), Madunagu et al., (1990) cho thấy xoài được dùng để trị một số bệnh như hen, ho, tiêu chảy, bệnh lỵ, khí hư, bệnh vàng da, đau nhứt và bệnh sốt rét. Xoài rất giàu chất chống oxy hóa có tác dụng trung hòa các phân tử gốc tự do thường gây tổn hại cho các tế bào và dẫn đến một số vấn đề về sức khỏe như bệnh ung thư, bệnh tim, lão hóa sớm,… Ngoài ra xoài còn có công dụng: giảm huyết áp, hạ cholesterol, chống ung thư đường ruột, cải thiện chứng thiếu máu, giúp tăng cân, chống lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể, tăng cường thị lực. Chất mangiferin trong lá xoài là chất chống viêm, lợi tiểu và trợ tim. Nó còn có tác dụng diệt vi khuẩn gram dương rất mạnh. Nó được điều chế thuốc sát trùng răng miệng. Chuyên ngành Công nghệ Snh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Snh học Luận văn Tốt nghiệp Đại hoc khoá 34TT-2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Phương tiện 3.1.1. Thời gian và địa điểm - Thời gian thực hiện: từ 01/2013 đến 05/2013. - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.2. Phương tiện a. Vật liệu - 6 dòng vi khuẩn được phân lập từ Lương Phước Trường (2012). - Xoài: Thanh ca, Cát chu mua tại chợ An Bình, Q.Ninh Kiều, TP. Cần Thơ. b. Thiết bị - dụng cụ - pH kế (Sartorius, PB - 20, Đức). - Brix kế (Refractometer, FG 103/113, Euromex - Hà Lan). - Máy chuẩn độ điện thế (SCHOTT, Đức). - Máy ép trái cây (PANASONIC, Nhật Bản). - Lò vi sóng (SANYO, Nhật Bản). - Nồi hấp khử trùng nhiệt ướt (Breukelen, Hà Lan). - Water bath & Shaker (GESELLSCHAFT, Đức) - Kính hiển vi (Olympus U - CMAD3, Nhật Bản). - Tủ cấy (Telstar Bio-II-A, Tây Ban Nha). - Tủ ủ (Herich, Đức). - Các dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, pipet, cốc thuỷ tinh,... c. Hoá chất - môi trường - Môi trường MRS agar (De Man, Rogosa and Sharpe - Merck, Đức). Chuyên ngành Công nghệ Snh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Snh học