Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp phân lập và tuyển chọn các chủng bacillus spp có khả năng đối kháng sinh học với nấm colletotrichum spp gây bệnh thán thưtrên cây ớt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP. CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÚY HỒNG Niên khóa: 2011 - 2015 Tháng 7 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP. CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện ThS. NGUYỄN TẤN ĐỨC NGUYỄN THỊ THÚY HỒNG KS. TRẦN THÙY TRANG Tháng 07 năm 2015 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên con xin cảm ơn ba mẹ đã sinh thành và dạy dỗ con nên người, cảm ơn gia đình vẫn luôn bên con và ủng hộ con trong suốt những năm qua. Cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và truyền thụ cho em những tri thức quý báu trong thời gian em học tại trường. Cảm ơn ban Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, phòng Công nghệ Vi sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này. En xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Tấn Đức và chị Trần Thùy Trang đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt cho em trong suốt thời gian qua. Cảm ơn tất cả các anh, chị và các bạn phòng Công nghệ vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo cho em môi trường làm việc tốt nhất trong thời gian thực hiện đề tài. TÓM TẮT Bệnh thán thư trên ớt gây ra bởi nấm Colletotrichum spp. là một trong những nguyên nhân làm giảm nghiêm trọng cả về chất lượng và sản lượng ớt. Một số biện 4 pháp hóa học kết hợp với phương pháp canh tác đã được đưa ra nhưng chúng lại có ảnh hưởng tiêu cực với môi trường cũng như làm giảm chất lượng nông sản do có dư lượng thuốc BVTV. Các phương pháp sinh học, đặc biệt là sử dụng cơ chế đối kháng sinh học được xem là phương pháp có nhiều tiềm năng to lớn và thân thiện với môi trường. Chúng tôi tiến hành phân lập phân lập các mẫu nấm Colletotrichum spp. từ trái ớt bệnh tại các vườn ớt ở xã An Nhơn Tây, huyện Củ Chi và phân lập các mẫu vi khuẩn Bacillus spp. từ mẫu đất tại các vườn ớt ở huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang. Sau phân lập đề tài thu được 28 chủng nấm và 19 chủng vi khuẩn, kết quả định danh bằng sinh học phân tử xác định được có 28 chủng nấm thuộc loài C. acutatum và 17 chủng vi khuẩn thuộc loài B. subtilis hoặc B. amyloliquefaciens, 2 chủng vi khuẩn thuộc loài B. licheniformis. Kết quả đối kháng in vitro theo phương pháp đồng nuôi cấy trên đĩa petri cho thấy các chủng vi khuẩn CG9, CG8, CG10, CG5 và CG6 thuộc vào nhóm đối kháng mạnh nhất với hiệu quả đối kháng đạt trên 60%, kế đó là các chủng CG1, CG7, D3, D1, CG4, CG11, D4 và BA98 có hiệu quả đối kháng trên 50% và các chủng còn lại thuộc vào nhóm thứ ba có hiệu quả đối kháng yếu dưới 50%. MỤC LỤC Trang 5 6 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT FAO: Food and Agriculture Organization BVTV: Bảo vệ thực vật TT CNSH TPHCM : Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh NCBI: National Center for Biotechnology Information 7 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các chất kháng sinh ở một số loài vi khuẩn Bacillus spp............................11 Bảng 3.1. Trình tự mồi ITS5 và ITS4...........................................................................26 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR...........................................................................26 Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR...............................................................26 Bảng 3.4. Trình tự mồi 20F và 1500R..........................................................................27 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR...........................................................................27 Bảng 3.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR...............................................................28 Bảng 4.1 Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm Colletotrichum spp.............30 Bảng 12 Đặc điểm đại thể và vi thể các chủng vi khuẩn Bacillus spp.........................37 Bảng 4.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo các chủng nấm đã phân lập sau 7 ngày...............41 Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Bacillus spp.........................................46 Bảng 4.4 Kết quả định danh nấm Colletotrichum phân lập từ Củ Chi.........................49 Bảng 4.5 Kết quả định danh sinh học phân tử Bacillus spp.........................................50 8 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Capsicum annuum ..........................................................................................3 Hình 2.2. Triệu chứng bệnh thán thư trên quả ớt...........................................................5 Hình 2.3. Triệu chứng bệnh thán thư trên lá ớt..............................................................5 Hình 2.4. Chu kỳ gây bệnh của nấm Colletotrichum spp...............................................8 Hình 2.5. Phát sinh loài và phân bố của các chi Bacillus.............................................12 Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát phương háp nghiên cứu.......................................................20 Hình 3.2 Sơ đồ định danh vi khuẩn B. subtilis và B. licheniformis.............................23 Hình 3.3. Quy trình định danh nấm Colletotrichum spp. bằng sinh học phân tử........25 Hình 3.4. Quy trình định danh vi khuẩn Bacillus spp. bằng sinh học phân tử............27 Hình 1.5 Phương pháp đồng nuôi cấy kiểm tra hiệu quả đối kháng............................29 Hình 4.1 Triệu chứng bệnh thán thư trên quả ớt..........................................................30 Hình 4.2 Kết quả một số phản ứng sinh hóa đã thực hiện............................................47 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số dòng nấm..................................48 Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số dòng vi khuẩn Bacillus spp......48 Hình 4.5 Biểu đồ hiệu quả đối kháng của vi khuẩn với nấm......................................52 Hình 4.6 Đối kháng của các chủng Bacillus spp. với nấm C. acutatum.....................53 9 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ớt (Capsicum annuum) là một loại cây gia vị có nguồn gốc từ rất lâu đời khoảng 7500 năm trước Công nguyên hoặc sớm hơn. Có những bằng chứng khảo cổ ở các khu vực ở tây nam Ecuador cho thấy ớt đã được thuần hóa hơn 6000 năm về trước. Cho đến ngày nay thì ớt đã được trồng ở rất nhiều nơi trên thế giới và xuất hiện thường trực trên bàn cơm của mọi người. Theo báo cáo của FAO năm 2003 cây ớt được xem là một trong những cây trồng quan trọng ở vùng nhiệt đới. Diện tích đất trồng ớt trên thế giới vào khoảng 1.700.000 ha cho mục đích lấy quả tươi và khoảng 1.800.000 ha để làm ớt bột. Tổng diện tích 3.729.900 ha cho tổng sản lượng 20 triệu tấn. Tuy nhiên ngoài vấn đề giá cả và thời tiết không ổn định thì vấn đề bệnh hại cây trồng cũng là một nguyên nhân quan trọng gây nên nhiều khó khăn cho người trồng ớt. Theo Po Po Than, 2008 bệnh thán thư gây ra bởi loài nấm Colletotrichum spp., bệnh héo xanh gây ra bởi vi khuẩn Pseudomonas solanacearum, và bệnh khảm gây ra bởi virus chilli veinal mottle (CVMV) hoặc virus khảm dưa chuột (CMV) là những loại bệnh phá hoại nghiêm trọng nhất ở ớt. Bệnh thán thư có mức gây hại nghiêm trọng nhất có thể làm giảm từ 10 – 80 % sản lượng ớt thu hoạch ở các quốc gia đang phát triển (Poonpolgul và Kumphai, 2007). Ở Việt Nam diện tích trồng ớt ở các vùng chuyên canh ớt vào khoảng 3000 ha, năm cao nhất (1998) lên tới 5700 ha. Theo báo cáo của chi cục BVTV TP.HCM trong năm 2013 thì diện tích canh tác rau bị bệnh thán thư là 178,76 ha, chiếm 15% trên tổng diện tích ở thành phố Hồ Chí Minh. Do đó vấn đề đối phó với bệnh thán thư là vô cùng quan trọng. Hiện nay tại các vùng trồng ớt phương pháp đối phó chủ yếu là phương pháp canh tác như luân canh với cây không thuộc họ cà, tiêu hủy phế phẩm, lên luống, tưới rửa cây sau mưa, bón vôi vào đất diệ mầm bệnh, xử lí hạt giống trước gieo trồng. Tuy có giảm được một phần nào dịch bệnh những chủ yếu là để phòng bệnh còn lúc ruộng ớt đã bị bệnh thì phải sử dụng phương pháp hóa học bằng cách phun một số thuốc trừ nấm như Amista, Loverice, Melody duo 66, Ringo-L 20SC, Amistar 250SC, Plant 50WP, Antracol 70WP, Polyram 80DF, Daconil 500SC,Score 250EC, 10 Ridomil 68 WP, Bavistin 68 FL, Carbenzim 50 WP,…có khả năng kiểm soát bệnh hại nhanh. Nhưng việc sử dụng thuốc không phù hợp có thể để có thể để lại dư lượng thuốc bảo vệ thực vật quá giới hạn trên nông sản gây độc cho sản phẩm, làm giảm uy tín và giá trị sản phẩm cũng như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự ổn định và bền vững của hệ sinh thái. Trong những năm gần đây xu thế tất yếu trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung là hướng tới sử dụng các phương pháp sinh học thân thiện với môi trường đưa nền nông nghiệp tiến tới nền nông nghiệp hữu cơ. Đặc biệt là việc ứng dụng các vi sinh vật thiên địch trong việc sản xuất các chế phẩm phòng trừ dịch bệnh cây trồng. Một trong những vi sinh vật tiêu biểu được nghiên cứu trong sản xuất chế phẩm sinh học là Bacillus subtilis và một số chủng khác như B.amyloliquefaciens và B.licheniformis an toàn với người và động vật và có khả năng tổng hợp được nhiều loại kháng sinh đối kháng được với nấm bệnh và một số vi khuẩn khác đã được nghiên cứu thành công ở nhiều nước trên nhiều đối tượng khác nhau. Trên xu thế chung đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp.có khả năng đối kháng sinh học với nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt” nhằm mục đích phát triển loại chế phẩm sinh học phòng bệnh thán thư. Đồng thời đề tài cũng thuộc nhóm các đề tài nghiên cứu ứng dụng Công nghệ sinh học vào nông nghiệp, nằm trong chương trình Công nghệ sinh học của thành phố Hồ Chí Minh giai đoạn 2011 – 2015. 1.2. Mục tiêu của đề tài Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng mạnh với nấm Colletotrichum spp. nhằm phục vụ cho nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng bệnh thán thư trên ớt. 1.3. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng Bacillus spp. Nội dung 2: Phân lập và định danh các chủng nấm Colletotrichum spp. Nội dung 3: Thử nghiệm khả năng đối kháng trong điều kiện in vitro. 11 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây ớt (Capsicum annuum) 2.1.1. Giới thiệu chung Cây ớt thuộc họ Cà (Solanaceae) chi ớt (Capsicum ) là cây gia vị quan trọng có xuất xứ từ Mehico, Goatemala và từ trung tâm khởi nguyên Đông Nam Á. Cho đến nay ớt đã được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới bao gồm vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và các vùng có khí hậu ôn hòa (Ken Pernezny và Tim Momol ,2006). Cây ớt (Capsicum annuum) có tên khoa học do chữ Capsa là túi, ý nói quả ớt giống cái túi, annuum có nghĩa là hàng năm. (Đỗ Tất Lợi, 2004). Chi Capsicum bao gồm khỏang 20 - 27 loài, 5 loài được thuần hóa và trồng ở nhiều nơi trên thế giới là C. annuum, C. baccatum, C. chinense, C. frutescens, và C. pubescens. Trong đó C. annuum là phổ biến hơn cả (Tong N và Bosland PW, 1999). Phân loại Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Equisetopsida Phân lớp Magnoliidae Bộ Solanales Họ Solanaceae Chi Capsicum Loài Capsicum annuum 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây ớt Ớt thuộc loài thân thảo mọc tại những nước ôn đới, sống lâu năm và thân Hình 2.1 Capsicum annuum (http://www.kew.org) phía dưới hóa gỗ ở những nước nhiệt đới. Cây có nhiều cành. Lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn, phía cuống cũng thuôn hẹp, có cuống, phiến lá dài 2 - 4 cm, rộng 1,5 – 2 cm. Quả mọc rũ xuống hay quay lên trời, hình dáng thay đổi, khi thì tròn, khi thì dài, đầu nhọn. Quả chưa chín có màu xanh hoặc tim, quả chín màu vàng hay đỏ. Có loại rất cay, có loại ít cay tùy theo giống và điều kiện canh tác (Đỗ Tất Lợi, 2004). Theo Khóa phân loại chi Ớt (Capsicum L.) của Paul G. Smith, Capsicum annuum có cánh hoa đồng màu, từ trắng đến xanh vàng sáp (không có đốm hay màu tương phản khác). Bao phấn xanh tái đến tím. Hoa đơn độc (đôi khi 2 hoa trên mắt đầu tiên), tràng hoa trắng hoặc trắng lẫn tím, đài hoa tách biệt ở cuối, có răng nhỏ ở mép. 12 Hạt ớt nhỏ dẹp, dạng thận, màu vàng rơm, chiều dài khoảng 3 – 5 mm. Cây thường cao khoảng 0,5 – 1,5 m. Ớt có rễ cọc với nhiều rễ phụ nhưng trong gieo trồng việc cấy chuyển cây làm rễ bị đứt và phát triển thành một hệ rễ chùm. 2.1.3. Giá trị của cây ớt Giá trị dinh dưỡng: Ớt chứa một loại alkaloid là Capsicain (0,05 – 2%) tập trung ở biểu bì của giá noãn, là chất gây nên vị cay của ớt và có hàm lượng vitamin C khoảng 0,8 – 1% (Đỗ Tất Lợi, 2004). Ngoài ra trong ớt còn có các chất carotenoid, capsorubin, kryptoxanthin, zeaxanthin, lutein, α và β caroten, Capsicosid là một saponin steroid có tác dụng kháng khuẩn, Flavonoid (apiin và luteolin - 7- glucosid), chất đường tới 7% và một số acid hữu cơ như acid citric, acid malic. Giá trị dược liệu: Chất có tác dụng trong ớt là capsaixin, nó có tác dụng gây tại chỗ trên niêm mạc và trên da cảm giác nóng mạnh, có thể tăng đến cảm giác cháy rát, nó gây đỏ mà không gây phồng da, là vị thuốc giúp sự tiêu hóa, làm ăn ngon, chóng tiêu. Ớt hoặc capsaixin thường dùng ngoài để làm giảm đau các bệnh đau khớp, đau dây thần kinh, dùng dưới dạng cồn, băng dán hoặc thuốc mỡ, dùng riêng hoặc phối hợp với một số vị khác. Ngoài ra, người ta còn dùng lá ớt tươi chữa mụn nhọn, rắn, rết cắn. 2.1.4. Phân bố Trên thế giới Có nhiều nước trồng ớt như Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Nam Phi, Tây Ban Nha, Italia, Pháp đặc biệt ở Hungary người ta trồng hàng nghìn hecta, mỗi năm xuất cảng từ 2500 đến 3000 tấn ớt khô. Ở Việt Nam Quỳnh Phụ (Thái Bình) với diện tích 1200 ha, Đại Lộc (Quảng Nam), Phù Mỹ (Bình Định), Phù Cát (Bình Định), Bố Trạch (Quảng Bình), Châu Đốc (An Giang), Thanh Bình (Đồng Tháp), Củ Chi (TP.HCM) và một số tỉnh thành khác... 2.2. Bệnh thán thư trên cây ớt 2.2.1. Giới thiệu chung Vào năm 1992 Isaac cho rằng tên bệnh thán thư (anthracnose) có nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa ‘coal’, dựa vào việc mô tả đặc điểm vết bệnh có màu tối như than, vết bệnh lõm xuống, chứa các khối bào tử. Nhìn chung bệnh thán thư do các loài Colletotrichum spp. gây nên. Bệnh thán thư được Halsted (1890) báo cáo lần đầu tại New Jersey, USA vào năm 1980, Halsted đã mô tả các tác nhân gây ra là Gloeopsorium piperatum và Colletotrichum nigrum. Arx (1957) xem sự phân loại học 13 đó là tương đương với Colletotrichum gloeosporioides. Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra là một trong số những bệnh gây hại nghiêm trọng làm giảm năng suất từ 10 - 80%. Bệnh không chỉ gây hại trên cây ở giai đoạn đang thu hoạch quả mà còn gây hại ở giai đoạn cây non và bảo quả quả sau thu hoạch. Bệnh thán thư trên ớt đã được nghiên cứu là do nấm Colletotrichum spp. gây ra bao gồm nấm C. acutatum (Simmonds), C. capsici (Syd.) Butler và Bisby, C. gloeosporioides (Penz.) (Ken Pernezny and Tim Momol ,2006). Nói chung trong điều kiện thời tiết ấm áp và ẩm ướt, nhiều mưa. Nhiệt độ khoảng 27 °C và độ ẩm cao (trung bình 80%) là tối ưu cho sự phát triển bệnh thán thư (Roberts và cộng sự, 2001). 2.2.2. Triệu chứng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra trên ớt Hình 2.2 Triệu chứng bệnh thán thư trên quả ớt Hình 2.3 Triệu chứng bệnh thán thư trên lá ớt Bệnh thán thư gây hại trên thân, lá, quả và hạt nhưng hại chủ yếu trên quả vào giai đoạn quả chín. Trên lá ban đầu là các đốm tròn màu xám, sau đó vết bệnh lớn dần tạo thành các đốm màu nâu, khô, hình tròn hoặc bầu dục, vết bệnh phát triển lớn lên và liên kết nhau làm khô cháy một mảng lá, lá vàng úa và rụng lá hàng loạt (QCVN 01 - 138 : 2013/BNNPTNT). Trên quả chủ yếu xuất hiện ở giai đoạn quả chín. Ban đầu là những vết bệnh dạng ngậm nước và sau đó trở nền mềm nhũn đồng thời xuất hiện những vết lõm, sạm lại (có màu nâu vàng hay màu rám nắng). Sau 2 - 3 ngày kích thước vết bệnh có thể lên tới 1 cm đường kính. Vết bệnh có thể bao trùm hầu hết bề mặt quả và xuất hiện những tổn thương phức tạp. Vết bệnh thường có hình thoi, vòng tròn đồng tâm, lõm, phân ranh giới giữa mô bệnh là một đường màu đen chạy dọc theo vết bệnh. Bề mặt của vết bệnh trở nên ẩm ướt, khi nhìn dưới kính lúp soi nổi có thể thấy đĩa cành với 14 những lông gai màu đen. Trong một số trường hợp xuất hiện vết bệnh màu nâu mà không phải là màu da cam và sau đó cũng hình thành những lông cứng khi nhìn dưới kính lúp soi nổi. Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màu trắng vàng bẩn (QCVN 01 - 138 : 2013/BNNPTNT, 2013, Vũ Triệu Mân, 2007). Nấm có thể gây hại trên một số chồi non, gây hiện tượng thối ngọn ớt. Chồi bệnh có màu nâu đen, bệnh có thể phát triển nặng làm cây chết dần hoặc cây bệnh nhẹ cho quả ít và chất lượng kém (Vũ Triệu Mân, 2007). 2.2.3. Cơ chế gây nhiễm của nấm bệnh thán thư Mầm bệnh thán thư thường tồn tại trên phế phẩm cây trồng họ cà hoặc trên vỏ hạt và lưu qua nhiều năm. Khi gặp điều kiện thuận lợi các mầm bệnh sẽ lây nhiễm vào các kí chủ thuộc họ cà, gây nên các vết bệnh trên thân, lá, quả. Những bào tử mới sinh ra trong mô bệnh sẽ nảy mầm, hình thành giác bám, rồi hình thành vòi hút xâm nhiễm vào các mô lá quả. Sự lây nhiễm thường xảy ra trong suốt mùa mưa ẩm. Mưa nhiều và tưới nước thường xuyên sẽ làm bệnh lây lan nhanh do bào tử được phát tán rộng. (Melanie và Sally, 2004) 2.2.4. Một số biện pháp phòng bệnh thán thư Chuẩn bị đất trước khi gieo trồng: dọn sạch tàn dư, tiêu hủy cây trồng vụ trước và cỏ dại, bón vôi bổ sung để nâng pH lên 5,5 – 6,5 để tiêu diệt mầm bệnh trong đất, bón lót, lên luống. Xử lý hạt giống: ngâm hạt giống trong nước nóng (khoảng 500C) trong 30 phút hoặc sử dụng một số thuốc trừ nấm như KMnO4 (1%) ngâm trong 1 – 2 giờ hoặc Kasuran hoà tan 5-7g/1 lít nước, ngâm hạt trong 1 giờ. Phòng trừ bệnh trong quá trình trồng cây: bón phân đầy đủ, cắt bỏ, tiêu hủy các cành, lá bị bệnh. Điều tra định kỳ, khi phát hiện có bệnh cần kịp thời xử lí. Phòng trừ bệnh sau khi thu hoạch: thu gom và tiêu hủy triệt để toàn bộ các bộ phận của cây, tiến hành luân canh với cây trồng khác không thuộc họ cà. 2.3. Nấm Colletotrichum spp. 2.3.1. Giới thiệu chung Nấm Colletotrichum spp. được xác định là tác nhân chính gây bệnh thán thư trên ớt và một số loại cây trồng khác như ngũ cốc, các cây họ đậu, rau cải, cây lâu năm và cây ăn quả. Theo Pring và các cộng sự, 1995 nhận định nấm Colletotrichum có thể ngủ đông trên các cây kí chủ khác nhau thuộc họ cà hoặc họ đậu, chúng tồn tại trên các tàn 15 dư thực vật và các quả bị bỏ lại trên cánh đồng. Các loài nấm Colletotrichum sản sinh ra các hạch nấm nhỏ để tồn tại ở rạng thái ngủ trong đất giữa mùa đông hoặc khi gặp các điều kiện bất lợi và có thể sống sót qua nhiều năm. Nấm Colletotrichum được xếp vào giới Fungi, thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Phyllachorales, họ Phyllachoraceae, giống Colletotrichum. 2.3.2. Đặc điểm hình thái nấm Nấm Colletotrichum spp. có đặc điểm là sống nội sinh hay kí sinh bắt buộc, sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào. Nhiều hạt dầu được sản xuất trong tế bào của hệ sợi nấm, khi trưởng thành sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng. Colletotrichum spp. sinh sản bằng bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong dạng quả thể là cụm cuống bào tử. Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt. Cuống bào tử không có vách ngăn, kéo dài, đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử trong suốt Trên mỗi cụm cuống bào tử là các lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh. Đa bào và có cấu trúc như tơ cứng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Sự hình thành số lượng lớn bào tử có thể gây đứt gãy trên biểu bì vật chủ, gặp điều kiện thuận lợi mỗi bào tử sẽ mọc một hoặc nhiều ống mầm để hình thành sợi nấm. Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử. Nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới. Trên môi trường nuôi cấy khuẩn lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm, khuẩn ty màu trắng đến hơi nâu, không có vách ngăn (Cao Ngọc Hải, 2012). Nhiệt độ phát triển thích hợp để nấm nảy mầm và hình thành bào tử là 26 -32oC, tối ưu ở 28oC, nhiệt độ trên 50oC sẽ làm chết bào tử và khuẩn ty, độ ẩm tối ưu là 92% (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). 2.3.3. Cơ chế gây bệnh của Colletotrichum spp. 16 Hình 2.4 Chu kỳ gây bệnh của nấm Colletotrichum spp. Nấm Colletotrichum spp. tồn tại trong tàn dư thực vật, quả, hạt bị bỏ lại trên cánh đồng khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ xâm nhập vào tế bào chủ bằng nhiều con đường khác nhau như sản xuất một số cấu trúc gây nhiễm vào tế bào chủ: ống mầm, đĩa áp (tạo áp lực), sợi nấm nội bào, sợi nấm sơ cấp, sợi nấm thứ cấp. Chúng xâm nhiễm dưới lớp biểu bì của tế bào chủ hoặc trong tế bào. Đầu tiên, chúng bám và nảy mầm trên bề mặt tế bào chủ, hình thành giác bám có vòi xâm nhiễm tạo áp lực xâm nhập vào tế bào chủ. Sau khi xâm nhập, hình thành nên sợi nấm nội bào và sợi nấm sơ cấp. Từ sợi nấm sơ cấp hình thành nên nhiều sợi nấm thứ cấp. Các sợi nấm này đâm xuyên hoặc len lỏi qua các tế bào, xâm chiếm khắp vùng dưới lớp biểu bì và nhanh chóng lan rộng khắp các mô. Các mô bị xâm nhiễm sẽ chết và hình thành các vùng lõm, các vết bệnh sẽ loang dần ra và liên kết với nhau tạo thành các vết bệnh lớn, sau đó bào tử sẽ được phát tán nhờ gió hay nước mưa làm phát tán bệnh sang các bộ phận khác của cây hoặc từ cây này sang cây khác và lặp lại vòng tuần hoàn xâm nhiễm này. 2.3.5. Một số loài Colletotrichum spp. gây bệnh trên cây ớt. 17 2.3.5.1. Colletotrichum acutatum Hình 2.5 Colletotrichum acutatum Nấm Colletotrichum acutatum lây lan rất nhanh đến nỗi vào thời điểm phát hiện triệu chứng thì tình trạng bệnh đã rất nghiêm trọng. Bệnh thường xuất hiện trên quả và thỉnh thoảng bị thối cuống lá, với các triệu chứng như tạo vết trũng ngậm nước, sau đó mở rộng dần và bao phủ hết bề mặt quả trong vòng 2-3 ngày, trên các cơ quan màu nâu sẫm sẽ xuất hiện khối bào tử màu hồng. Đối với cây trồng khác như cỏ chân ngỗng và cần tây, thối ngọn và xoắn lá là triệu chứng chính. Khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy có màu trắng, xanh xám hoặc màu da cam nhạt, đôi khi tạo ra sắc tố màu hồng tím đậm. Đĩa cành (Conidiomata) thường kém phát triển, với ít hoặc không có lông cứng, đặc biệt là trong nuôi cấy. Tế bào Conidiogenous hình trụ, đôi khi phát sinh thành các chùm nhỏ, và tạo bào tử đơn. Bào tử đính có kích thước 8 - 16 mm x 2,5 - 4 mm, hình thoi, thành mỏng, có vách ngăn và trong suốt. Appressoria rất ít về số lượng có kích thước 6,5 - 11 mm x 4,5 - 7,5 mm, Hình chùy hoặc tròn và có màu nâu sáng đấn nâu sẫm (Mordue, 1979, Sutton, 1980, Baxter et al.1983 và Gunnell & Gubler,1992). 2.3.5.2. Colletotrichum gloeosporioides 18 Hình 2.6 Colletotrichum gloeosporioides Trong các tác nhân gây bệnh thán thư trên ớt thì nấm Colletotrichum gloeosporioides là loài phổ biến nhất. Trên nhiều loại cây trồng nhiệt đới khi tiến hành phân lập các dòng nấm bệnh, người ta thường bắt gặp loài nấm này tồn tại dưới hai dạng: nội ký sinh và ngoại ký sinh trên bề mặt mô cây. Theo Lee và Chung, (1990) nấm C. gloeosporioides được tìm thấy chiếm 41% trong vỏ hạt, 36% trong nội nhũ và 2% trong phôi hạt ớt cay. Qua quan sát mô tế bào ở cây non cho thấy nấm có khả năng truyền từ nội nhũ sang trụ dưới lá mầm rồi đến rễ mầm. Trên môi trường PDA, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm. Ở một số mẫu phân lập sợi nấm ký sinh chỉ hình thành những chòm liên quan đến sự hình thành quả thể và đôi khi hình thành trên tản nấm non phổ biến hơn so với tản nấm già. Quả thể mở hình thành trên các bộ phận khác nhau của cây trồng, mọc riêng rẽ hoặc từng đám hình cầu hay hình quả lê, kích thước đường kính 85 - 350 µm. Bên trong quả thể có các túi bào tử nằm rải rác, xen kẽ với các sợi nấm vô tính, thường có 8 bào tử túi hình trụ hoặc hình chùy, kích thước 35 - 80 µm x 8 – 14 µm. Đĩa cành hình thành trên các bộ phận của cây, có lông cứng dài, màu nâu, thuôn về phía đỉnh, hơi phồng nhẹ ở phần gốc, kích thước chiều dài khoảng 500 µm, đường kính 4 - 8 µm, có 1 - 4 vách ngăn. Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào tử ngắn, hẹp, trong suốt, hình trụ, đầu hơi tù, đỉnh tròn, không có vách ngăn, kích thước 9 – 24 µm x 3 - 6 µm. Trên môi trường PDA, khối bào tử màu hồng nhạt được hình thành trên cành bào tử phân sinh. 19 Bào tử nảy mầm và hình thành giác bám màu nâu, hình ô van hoặc hình quả đấm, kích thước 6 - 20 µm x 4 - 12 µm. 2.3.5.3. Colletotrichum capsici Hình 2.7 Colletotrichum capsici Theo Maiti và Sen (1982) nấm Colletotrichum capsici gây bệnh trên nhiều ký chủ khác nhau như ớt (Capsicum annuum) và hồ tiêu. Colletotrichum capsici có đĩa cành trên quả, lá và thân, tròn hoặc thon dài, kích thước khoảng 350µm. Lông gai màu nâu, có 1 - 5 vách ngăn, cứng, phình to ở phía gốc, phía đỉnh nhọn, mảnh và màu sắc nhạt dần, kích thước khoảng 250 x 6µm. Bào tử phân sinh hình lưỡi liềm, trong suốt, đỉnh nhọn, đơn bào, không có vách ngăn, được hình thành từ cành bào tử hình trụ màu nâu nhạt. Tản nấm trên môi trường PDA đầu tiên có màu trắng sau chuyển dần thành màu xám. Sợi nấm hình thành mịn, màu trắng đến xám tối trên bề mặt tản nấm. Lông gai được hình thành trên những vùng mỏng hơn, hạch nấm hiếm gặp hoặc không có. Cụm bào tử màu nâu sẩm đến màu da cam. Giác bám và các cấu trúc phụ của chúng hình thành với số lượng lớn áp vào bề mặt đĩa petri. 2.4. Vi khuẩn Bacillus spp. 2.4.1 Giới thiệu chung về Bacillus spp. Bacillus xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que gồm gần 200 loài các vi khuẩn hình que, Gam dương, hiếu khí thuộc 1 trong 5 chi có khả năng sinh bào tử trong họ Bacillaceae. Theo Bergey, 1994, vi khuẩn Bacillus thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Eubacterriales, họ Bacillaceae, Giống Bacillus. 20