Tài liệu Khoá luận tốt nghiệp “Nghiên cứu tác dụng của Bokashi trầu lên sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm sú (Penaeus monodon)”

Lêi C¶m ¬n §Ó cã kÕt qu¶ hoµn thµnh bµi Kho¸ LuËn Tèt NghiÖp nµy t«i xin göi lêi c¶m ¬n tíi tÊt c¶ b¹n bÌ , tíi gia ®×nh t«i ®· ®éng viªn t«i trong qu¸ tr×nh thùc tËp, ®Æc biÖt t«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n ThÇy gi¸o h íng dÉn cña t«i, trong qu¸ tr×nh thùc tËp vµ hoµn thµnh luËn v¨n tèt nghiÖp nµy t«i ®· nhËn ® îc sù híng dÉn rÊt chu ®¸o vµ tËn t×nh cïng nh÷ng lêi khuyªn bæ Ých cña thÇy gi¸o NguyÔn Ngäc Ph íc , t«i v« cïng biÕt ¬n sù quan t©m cña c¸c thÇy c« gi¸o trong khoa Thuû S¶n, trêng §¹i Häc N«ng L©m HuÕ,vµ sù gióp ®ì nhiÖt t×nh cña c¸c c« trong Khoa Vi Sinh thuéc BÖnh ViÖn Trung ¦¬ng HuÕ Trong thêi gian nghiªn cøu vµ hoµn thµnh ®Ò tµi thùc tËp tèt nghiÖp, mÆc dï ®· cã rÊt nhiÒu cè g¾ng, tuy nhiªn do thêi gian cã h¹n vµ kiÕn thøc cßn h¹n chÕ nªn vÉn kh«ng thÓ tr¸nh ® îc nh÷ng sai xãt . RÊt mong ®îc sù quan t©m, gãp ý cña c¸c thÇy c« gi¸o, vµ c¸c b¹n sinh viªn HuÕ, th¸ng 5 n¨m 2008 TrÇn Nam Hµ MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG...........................................................................................4 DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................4 1. ĐẶT VẤN ĐỀ.....................................................................................................5 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................................7 2.1 Tình hình nghiên cứu dịch bệnh tôm trên thế giới và Việt Nam.......................7 2.1.1 Tình hình dịch bệnh....................................................................................7 2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh.............................................................................10 2.2.1. Trên thế giới.............................................................................................10 2.2.2. Tại Việt Nam............................................................................................12 2.3. Tình hình sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược......................................13 2.3.1. Trên thế giới.............................................................................................13 2.3.2. Tại Việt Nam............................................................................................15 2.3 Một số thảo dược sử dụng trong nuôi trồng thủy sản dùng trong việc chữa bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản....................................................................16 2.3.1. Cây thuốc cá (Derris spp)........................................................................16 2.3.2. Cây xoan (Melia azedarach)....................................................................16 2.3.3. Cây thàn mát (Milletia ichthyochtona Drake )......................................17 2.3.4. Cây sở (Cammellia sasanqua).................................................................17 2.3.5. Cây bồ hòn (Sapindus mukorossi Gaetrn)..............................................17 2.3.6. Cây thầu dầu tía (Ricinus communis L.).................................................17 2.3.7. Cây nghể (Polygonum hydropipe L.)......................................................17 2.3.8. Cây rau sam (Portulacaoler acea L.)......................................................17 2.3.9. Cây tía đỏ ( Ricinus communis L.).........................................................18 2.3.10. Tỏi (Allium sativum L.).......................................................................18 2.3.11. Cây cau (Areca catechu)........................................................................18 2.4. Vài nét về chế phẩm EM và Bokashi trầu......................................................18 2.4.1. Chế phẩm EM..........................................................................................18 2.4.2. Cây trầu....................................................................................................19 2.4.3. Bokashi trầu.............................................................................................21 2.4. Một số loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản....................21 2.4.1 Erythromycin............................................................................................21 2.4.2. Tetracyline................................................................................................21 2.4.3. Rifampin..................................................................................................22 2.4.4. Nhóm Sunfamid......................................................................................22 2.4.5. Trimethroprim..........................................................................................22 2.4.6. Co-Trimoxazone ( Bactrim)....................................................................22 2.5. Những tồn tại trong việc sử dụng kháng sinh.................................................22 3. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................24 3.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu.....................................................24 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu..............................................................................24 3.1.2. Thời gian nghiên cứu...............................................................................24 3.1.3. Địa điểm nghiên cứu................................................................................24 3.2 Vật liệu nghiên cứu..........................................................................................24 3.2.1. Dụng cụ thí nghiệm.................................................................................24 3.2.2. Môi trường , hoá chất..............................................................................25 3.3. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................25 3.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................25 3.4.1. Phương pháp thu mẫu..............................................................................25 3.4.2. Phương pháp nuôi cấy , phân lập vi khuẩn.............................................26 3.4.3. Nuôi cấy...................................................................................................26 3.4.4. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn..................................................26 3.4.5. Phương pháp nhuộm vi khuẩn.................................................................27 3.4.6. Phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ.................................................28 3.4.7. Thiết kế thí nghiệm..................................................................................28 3.5. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................31 3.5.1. Giá trị trung bình.....................................................................................31 3.5.2. Độ lệch chuẩn..........................................................................................31 3.5.3. Công thức tính mật độ vi khuẩn..............................................................31 3.5.4. Xử lí số liệu..............................................................................................31 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................................................32 4.1. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh............................................32 4.1.1. Dấu hiệu bệnh lí.......................................................................................32 4.1.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn.....................................................32 4.2. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các công thức Bokashi trầu khác nhau................................................................................................................36 4.2.1. Kết quả thí nghiệm sàng lọc các công thức Bokashi thí nghiệm............36 4.2.2. Kết quả thí nghiệm sàng lọc nồng độ ức chế..........................................38 4.2.3. Kết quả thử nghiệm nồng độ ức chế vi khuẩn của bokashi trầu.............39 4.2.4. Kết quả thử nghiệm khả năng tiêu diệt vi khuẩn của bokashi trầu.........40 4.3. Kết quả so sánh độ nhạy các loại kháng sinh và Bokashi trầu trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm...............................................................................................42 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................45 5.1. Kết luận...........................................................................................................45 5.2. Kiến nghị.........................................................................................................45 TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................46 3 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. 1. Thiệt hại do bệnh tôm gây ra ở các tỉnh miền Nam năm 1996..................8 Bảng 2. 2. Tình hình nuôi trồng thuỷ sản trên địa bàn Thừa Thiên Huế năm 2007. 10 Bảng 4. 1. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm.33 Bảng 4. 2. Kết quả sàng lọc khả năng kháng khuẩn của các công thức Bokashi trầu lên vi khuẩn V. harveyi.......................................................................................36 Bảng 4. 3. Kết quả sàng lọc khả năng kháng khuẩn của các công thức Bokashi trầu lên vi khuẩn V. alginolyticus..............................................................................36 Bảng 4. 4. Kết quả sàng lọc nồng độ ức chế trên vi khuẩn V.harveyi.......................38 Bảng 4. 5. Kết quả sàng lọc nồng độ ức chế trên vi khuẩn V. alginolyticus.............39 Bảng 4. 6. Khả năng ức chế của bokashi trầu lên vi khuẩn V. harveyi......................39 Bảng 4. 7. Khả năng ức chế của bokashi trầu lên vi khuẩn V. alginolyticus.............39 Bảng 4. 8. Khả năng tiêu diệt vi khuẩn V. harveyi của Bokashi trầu........................40 Bảng 4. 9. Khả năng tiêu diệt vi khuẩn V. alginolyticus của dịch lá trầu và Bokashi trầu......................................................................................................................40 Bảng 4. 10. Các nồng độ ức chế và tiêu diệt vi khuẩn của Bokashi trầu..................41 Bảng 4. 11. Kết quả so sánh độ nhạy của các loại kháng sinh và Bokashi trầu trên vi khuẩn V. harveyi.................................................................................................42 Bảng 4. 12. Kết quả so sánh độ nhạy của các loại kháng sinh và Bokashi trầu trên vi khuẩn V. alginolyticus....................................................................................42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2. 1. Lá trầu (Piper betle .L).............................................................................19 Hình 3. 1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch......28 Hình 3. 2. Sơ đồ nghiên cứu tổng thể........................................................................30 Hình 4. 1. Thức ăn trong ruột phân bố không đều ở tôm bị bệnh viêm ruột.............32 Hình 4. 2. Vibrio harveyi Hình 4. 3. Vibrio alginolyticus....................................34 Hình 4. 4. Khuẩn lạc màu xanh của vi khuẩn Vibrio harvey trên môi trường TCBS ............................................................................................................................34 Hình 4. 5. Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio alginolyticus trên môi trường TCBS...35 Hình 4. 6. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn cuả các công thức thí nghiệm.................37 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Với hơn 1.9 triệu ha diện tích mặt nước Việt Nam có tiềm năng lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản. Cùng với nghề khai thác biển, nhà nước ta rất chú trọng phát triển nuôi trồng thủy sản. Nhằm có một cơ cấu bền vững về nguồn lợi nhằm góp phần đảm bảo an ninh lương thực, xóa đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm cho người lao động, nuôi trồng thủy sản đã trở thành một ngành sản xuất chủ yếu trong cả nước, chiếm vị trí hàng đầu của nền kinh tế nước nhà trong hai thập kỷ qua. [ 6 ] Tuy nhiên, trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản đang phải đối mặt với những thử thách lớn đó là dịch bệnh và ô nhiễm môi trường. Nghề nuôi tôm sú bắt đầu phát triển từ những năm đầu của thập kỉ 90, nhưng do sự phát triển ồ ạt, chưa có quy hoạch cụ thể nên từ năm 1995 – 1997, dịch bệnh trên tôm đã bùng nổ và gây thiệt hại, tổn thất lớn đối với nền thủy sản Việt Nam. Thiệt hại do dịch bệnh gây ra trên tôm sú tăng từ 0,5 tỉ USD năm 1995-1997 lên đến 1,5 tỉ USD trong giai đoạn 2001 – 2002 [25]. Trong số những dịch bệnh thủy sản thì bệnh do vi khuẩn gây lên chiểm tỷ lệ khá lớn, gây ra những vụ dịch bệnh quy mô lớn.Vi khuẩn cũng là một trở ngại lớn trong việc phát triển công nghiệp sản xuất giống thủy sản. Bệnh phân trắng xảy ra trên tôm sú phần lớn là do nhóm vi khuẩn đường ruột ở tôm gây lên, bệnh đã gây thiệt hại lớn đối với người nuôi, gây ra những vụ mất trắng cho ngư dân.[10],[11], [12], [27], [28] Thông thường, các loại hóa chất và kháng sinh là những loại mà người nuôi thường sử dụng để hạn chế dịch bệnh, tuy nhiên việc sử dụng hóa chất, kháng sinh không đúng quy cách, không đúng liều lượng đã gây lên tác hại lớn như là tạo ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc, làm suy thoái môi trường , ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người [21], [27],[28] [31]. Hơn nữa hiện nay theo các quy định về an toàn thực phẩm, nghiêm cấm sự tồn dư các loại hóa chất và kháng sinh có trong động vật thủy sản. Nếu chúng ta không có biện pháp tốt để vượt qua những rào cản này thì sẽ làm giảm đáng kể về mặt kinh tế đối với xuất khẩu thủy sản, và thủy sản việt nam khó đứng vững trên thị trường thế giới [8] Những năm gần đây xu hướng dùng thảo dược trong chữa trị bệnh trên động vật thủy sản ngày càng được phổ biến do biên độ an toàn cao [19], các chiết xuất từ thảo dược được sử dụng rộng rãi trong bảo quản và điều trị bệnh nấm và vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản Tại Việt Nam, lá trầu (Piper betel. L) được sử dụng trong điều trị bệnh vi khuẩn trên người [7]. Đây là một loại thảo dược có nguồn gốc từ tự nhiên, có tác dụng kháng sinh mạnh mẽ, chất kháng sinh trong lá trầu diệt được nhiều vi khuẩn gây bệnh [2]. Trong lá trầu có chất chavicol, chavibetel và một số hợp chất phenic khác. Năm 1996, kết quả nghiên cứu từ bộ môn Ký sinh trùng, Đại học Y Dược Hà Nội cho thấy trầu có tác dụng kháng sinh mạnh đối với vi trùng tụ cầu, B. subtilis, trực trùng E. coli. Trong nuôi trồng thủy sản, ngư dân nhiều nơi đã biết dùng lá trầu để phòng trị bệnh cho vật nuôi, nhưng đa số mới chỉ dừng ở mức kinh nghiệm, làm theo ý thích, chưa có phương pháp khoa học cụ thể, chưa tìm ra liều lượng đúng Qua thực tế tìm hiểu về tác hại của bệnh vi khuẩn gây lên trên động vật thủy sản, và tác dụng của lá trầu, được sự đồng ý của bộ môn Ngư y, Khoa Thủy sản, trường Đại học Nông Lâm Huế, cùng sự giúp đỡ của giáo viên hướng dẫn, tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu tác dụng của Bokashi trầu lên sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm sú (Penaeus monodon)” Mục tiêu đề tài : Phân lập, xác định loài vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm sú. Thử nghiệm tác dụng của hoạt chất lá trầu và bokashi trầu lên việc điều trị bệnh do vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm sú Tập làm quen với công tác nghiên cứu khoa học 6 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu dịch bệnh tôm trên thế giới và Việt Nam 2.1.1 Tình hình dịch bệnh 2.1.1.1. Trên thế giới Nghề nuôi tôm trong những năm gần đây, nuôi trồng thủy sản đã có những bước tiến vượt bậc về cả diện tích lẫn năng suất nuôi trồng đã đạt được, tuy nhiên hiện nay chúng ta dang phải đối mặt với những thách thức từ môi trường, dịch bệnh lan tràn, gây thiệt hại lớn cho người nuôi[27], [30], [31] Năm 1992, Trung Quốc là một nước có sản lượng tôm lớn nhất thế giới 150.000 tấn nhưng đến năm 1993 lại bị thiệt hại nặng nề do dịch bệnh và đã làm sản lượng giảm 50% so với năm 1992. Trên thế giới, năng suất tôm sú giảm chỉ còn 639.000 (giảm 12% so với năm 1992). Năm 1996, tổng diện tích nuôi tôm trên thế giới là 1.372.800 ha tăng 20,5% so với năm 1995 nhưng năng suất chỉ đạt 693000 tấn giảm 2,5% so với năm 1995 do dịch bệnh virus bùng phát trên toàn thế giới [28], [30] Năm 1998, chỉ tính riêng Trung Quốc thất thoát gần 1tỷ USD do dịch bệnh xảy ra trên tôm. Ở Thái Lan thiệt hại do bệnh ước tính khoảng 40% tổng năng suất (70.000 tấn) tương đương 500 triệu USD. Những cuộc điều tra cấp nông hộ ở 16 nước ở Châu Á cho thấy rằng bệnh và các vấn đề liên quan đến môi trường gây thất thoát cho sản lượng nuôi thuỷ sản trên 3 tỷ USD/năm [28] Tình hình dịch bệnh đã trở thành một mối đe doạ đối với sự phát triển của nghề nuôi tôm ,trước nguy cơ này các nhà khoa học, nhà sản xuất đã đầu tư tiền bạc thời gian để nhằm hạn chế dịch bệnh và tìm ra những loại thuốc đặc hiệu những phương pháp nuôi mới, nuôi sinh thái để ngành nuôi tôm ngày càng phát triển một cách bền vững hơn [8], [30] 2.1.1.2. Tại Việt Nam Tại Việt Nam, nghề nuôi tôm cũng đã phát triển khá lâu nhưng thực sự phát triển mạnh trong nhưng năm gần đây. Do những lợi nhuận mang lại từ con tôm sú (P. monodon) và do ưu đãi của thiên nhiên nên nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ trong cả nước đặc biệt là miền trung và Đồng bằng sông Cửu Long[27], [28] 7 Năm 1990, ở Việt Nam có 187.000 ha mặt nước nuôi tôm và sản lượng đạt được là 31.000 tấn. Đến năm 1995, diện tích nuôi tăng lên 260.000 ha và sản lượng đạt được là 52.000 tấn. Nhưng mặt trái của sự phát triển nhanh chóng và không có quy hoạch là dịch bệnh bùng phát ở nhiều nơi. Năm 1994, dịch bệnh bùng phát tại Đồng bằng sông Cửu Long: Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng, Long An, Nha Trang … gây thiệt hại hàng chục tỷ đồng cho bà con nuôi tôm. [28] Bảng 2. 1. Thiệt hại do bệnh tôm gây ra ở các tỉnh miền Nam năm 1996 Địa phương Diện tích bị bệnh (ha) Quảng QCCT canh Bán Thâm thâm canh Sản Giá trị kinh lượng tế (tấn) đồng) (tỷ canh Phú Yên 104 2,06 Khánh Hoà 20 10 Vũng Tàu 150 246 640 340 500 25 66,2 25,6 23,5 0,358 2.035 110 179,2 20 3.000 800 23,006 750 1.875 2,063 20.000 1.200 205 4.000 700 15 5.219 284,08 Tp Hồ Chí 1.000 16 0,1 1,5 Minh Tiền Giang Bến Tre 1.017 Trà Vinh Sóc Trăng Minh Hải 50.000 Kiên Giang Tổng 52.017 29.011 3.829,6 8 Nơi thiệt hại lớn nhất là tỉnh Bến Tre (20% tôm thả bị chết ), Trà Vinh là 15% theo báo cáo nghiên cứu khoa học năm 1997 của Nguyễn Việt Thắng thì trong những tháng đầu của năm 1997 là thời điểm dịch bệnh bùng phát nghiêm trọng ở các tỉnh Miền Trung đặc biệt là vào tháng 2 – 3 tổng số diện tích bị dịch bệnh chiếm khoảng 80% tổng diện tích nuôi trồng gây thiệt hại lớn cho các tỉnh Miền Trung 2.1.1.3. Tại Thừa Thiên Huế Năm 2007, diện tích nuôi tôm của Thừa Thiên Huế là 3.712,1 ha,do thời tiết năm nay diễn biến phức tạp, nắng nóng kéo dài xen giữa có 3 đợt gió mùa kèm theo mưa dẫn đến nhiệt độ và môi trường biến động quá cao rất bất lợi cho nuôi tôm, từ đầu vụ đã xảy ra bệnh tôm sớm trên tôm đất ở ngoài tự nhiên tại các hồ nuôi tôm sú chưa được cải tạo vùng Quảng An, Quảng Phước huyện Quảng Điền, qua kiểm tra thấy tôm bị nhiễm virus đốm trắng. Tiếp đến là diện tích nuôi tôm sú bị bệnh ở các xã thuộc huyện Phú Lộc, Phú Vang và sau đó lây lan trên diện rộngDiện tích tôm bệnh: 1.052,98 ha chiếm tỷ lệ 36,91% tổng diện tích nuôi, tăng 31,28% so với năm 2006, trong đó hai huyện là Phú Lộc và Phong Điền bị thiệt hại nhiều nhất [20] 9 Bảng 2. 2. Tình hình nuôi trồng thuỷ sản trên địa bàn Thừa Thiên Huế năm 2007 TT Tên Tổng Tổng Tỷ lệ % huyện diện diện so với tích bị tích diện bệnh nuôi tích thả (ha) tôm nuôi (ha) Phân ra các loại bệnh Bệnh Đốm trắng Bệnh Còi Diện Diện tích 1 Phú 305,56 1160 26,34% Vang 2 Phú 138,8 Quảng 600 900 66,67% Phong tích Diện tích (%) tỷ lệ (%) 11,97 0 0,00% 166,73 14,37 600 66,67 0 0,00% 2,5 0,54% 0,55 0,12% 0,00 % 120,02 459,5 26,12% Điền 4 (%) tỷ lệ 3 Lộc 3 tỷ lệ Bệnh khác 116,9 25,46 7 % 22,9 57,6 39,76 21,9 38,02 0 0,00 1 1,74 4,5 276 1,63 0 0,00 0 0,00 4,5 1,63 Tổng 1052,9 2853, 36,91 877,7 30,76 2,5 0,09 172,78 6,06 cộng 8 1 Điền 5 Hương Trà 2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh 2.2.1. Trên thế giới Cuối thế kỉ XIX, một số tác giả đã xuất bản cuốn sách hưướng dẫn dịch bệnh cá nhưng cơ bản vẫn là mô tả những triêuh chứng lâm sàng. Sang đầu thế kỷ XX, các nhà khoa học thế giới đã bắt đầu nghiên cứu và viết sách hướng dẫn các bệnh cá. Năm 1904, Bruno Hofer người Đức viết cuốn sách “Tác nhân gây bệnh ở cá” (Father Of Fish Pathology). Năm 1929, viện sĩ V.A.Dogiel thuộc viện hàn lâm khoa học Liên Xô cũ là người có công lớn đóng góp vào công trình nghiên cứu ký sinh trùng cho cá, năm 1939 ông viết tiếp cuốn sách “Bệnh vi khuẩn của cá” ( Bacterial Diseases Of Fish). Từ năm 1930 -1970 việc nghiên cứu bệnh ký sinh trùng gây ra ở cá có nhiều thành công với nhiều công trình được thông báo ở Hungari, Nhật bản, Trung Quốc.. mà tác giả tiêu biểu chủ biên phải kể như: E.M.Lyaiman chủ biên cuốn sách giáo khoa về bệnh cá học ở Liên Xô, mãi đến những năm của thập kỷ 50, 60 các tác giả chuyên nghiên cứu về bệnh cá tiếp tục phát triển ở các nước: Bychowsky, Bauer, Mysselius, Gusser Liên Xô Cũ, Schaper Claus của Đức, Yamaguti của Nhật, Hoffman của Mỹ. Phải đến đầu những năm 80 của thế kỷ XX, khi mà nghề nuôi trồng thuỷ sản phát triển mạnh, đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các nước Châu Á – Thái Bình Dương từ đó dịch bệnh tôm xảy ra gắn liền với nghề nuôi tôm. So với các ngành như Y học,thú y, bệnh cá, thì trong lĩnh vực nghiên cứu bệnh tôm còn khá non trẻ, nhưng do nhu cầu của sản xuất nên lĩnh vực này đang được các quốc gia, tổ chức, các nhà khoa học … đầu tư, nghiên cứu với mục đích giảm thiệt hại tới mức nhỏ nhất nhằm giúp cho nghề nuôi ổn định và phát triển. Đến nay người ta đã phát hiện rất nhiều loài là tác nhân gây bệnh cho động vật thuỷ sản như: bệnh virus cá đã phân lập được 60 loài virus, bệnh virus ở nhiễm thể có 12 loài thuộc 8 họ, bệnh virus ở giáp xác có 14 loài ở tôm và 3 loài ở cua thuộc 5 họ, trong đó gặp nhiều nhất là 7 bệnh Baculovirus[ bùi quang tề] Các loài vi khuẩn gây bệnh đa số thuộc nhóm vi khuẩn Aeromonas. spp, Pseudomonas. spp gây bệnh ở nước ngọt và nhóm Vibrio gây bệnh ở nước mặn. Về nấm thì có các loại gây bệnh ở nước ngọt Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces, và các loài nấm phổ biến ở nước mặn là: Lagenidium, Fusarium, Halipthoros , Sirolipidium. 11 Ngoài các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, nấm, virus, thì cón có các tác nhân khác như kí sinh trùng, chỉ tính riêng số lượng kí sinh trùng gây bệnh cho cá cũng đã lên tới 2000 loài 2.2.2. Tại Việt Nam Ở Việt Nam bệnh thuỷ sản được nghiên cứu chậm hơn so với các nước trên thế giới. Việc nghiên cứu bệnh thuỷ sản ở nước ta bắt đầu từ những năm của thập niên 60 và ngày càng được chú trọng. Hàng loạt các công trình khoa học được công bố. Năm 1967, ở nước ta đã phát hiện 120 loài ký sinh trùng gây bệnh, trong đó có 42 loài mang tên Hà Ký (Hà Ký, 1967). Từ năm 1980 trở lại đây nhiều công trình nghiên cứu vi khuẩn, virus được công bố góp phần thúc đẩy nghề nuôi cá ngày càng ổn định và phát triển. Lúc này nghề nuôi tôm đã bắt đầu được chú trọng tại Việt Nam, và đi cùng với sự phát triển của nghề nuôi thìđịch bệnh cũng phát sinh làm giảm năng suất của người nuôi. Năm 1985, các nhà khoa học, các chuyên gia về thuỷ sản bắt đầu nghiên cứu và đi sâu vào lĩnh vực bệnh tôm, tuy còn non trẻ, nhưng do nhu cầu của thực tiễn, nên chỉ trong một thời gian ngắn hàng loạt công trình lớn đã được áp dụng rộng rãi vào sản xuất, đem lại hiều quả cao cho nghề nuôi Năm 1991, Nguyễn Trọng Nho và ctv khi nghiên cứu một số bệnh trên tôm sú ở Khánh Hoà đã thông báo một số dấu hiệu bệnh lý trên tôm sú nuôi. Đỗ Thị Hoà và cộng tác viên năm 1994, với đề tài nghiên cứu một số bệnh do tác nhân vi khuẩn, nấm nguyên sinh, động vật và giun tròn. Trong đó một số bệnh gây tác hại lớn được tác giả cho biết đó là: bệnh phát sáng, bệnh đỏ dọc thân trên tôm sú, bệnh mềm vỏ và bệnh do động vật đơn bào. Ngoài ra, tác giả còn thông báo một số bệnh do các tác nhân vô cơ gây ra như: bệnh dị hình, bệnh cong thân, bệnh tôm chết do nhiệt độ cao. Năm 1994, khi dịch bệnh tôm gây chết hàng loạt ở đồng bằng sông Cửu Long. Nguyễn Việt Thắng và ctv đã nghiên cứu đề tài “Tìm hiểu nguyên nhân tôm chết ở đồng bằng sông Cửu Long”. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Việt Thắng (1997) cho thấy vi khuẩn hiển diện khá cao trên tổng số mẫu thu xét nghiệm, nhiều loại Vibrio xuất hiện với tần số lớn, 2/3 xã điều tra cho thấy hiện tượng nhiễm khuẩn (Pycnozec nhân) chiếm tỷ lệ 80-100%, điều này cho thấy các 12 mô hình nuôi quảng canh, nhất là mô hình nuôi tôm sú trên ruộng lúa. Bên cạnh tác nhân virus, vi khuẩn cũng là một tác nhân khá nguy hại khác cho tôm nuôi nếu đàn tôm bị nhiễm khuẩn với cường độ cao và số lượng lớn. Năm 1996, Đỗ Thị Hoà cùng ctv đã đi sâu vào nghiên cứu các tác nhân gây bệnh trên tôm Sú ở khu vực Nam Trung Bộ đã phát hiện: Virus, vi khuẩn, protozoa cảm nhiễm trên tôm, kết quả này đã mở ra nhiều triển vọng cho nghề nuôi tôm tại Việt Nam. Gần đây công trình nghiên cứu lớn là đề tài cấp nhà nước mang mã số : KN -04-12 do Hà Ký đã nghiên cứu được 13 loại bệnh vi khuẩn tôm ông đã công bố đầy đủ các khâu từ phân lập vi khuẩn, tác nhân gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, phân bố và lan truyền, biện pháp phòng trị với một số bệnh được đi sâu nghiên cứu như: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú, bệnh đỏ dọc thân ở ấu trùng tôm sú, bệnh hoại tử đốm nâu ở tôm càng xanh, bệnh hoại tử do vi khuẩn gây ra trên cá trê, bệnh xuất huyết ở cá trắm cỏ nuôi lồng 2.3. Tình hình sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược 2.3.1. Trên thế giới Việc tăng năng suất và sản lượng nuôi bằng cách ồ ạt phát triển nghề nuôi tôm dã khiến cho dịch bệnh ngày càng là một vấn đề gây nhức nhối cho người nuôi. Để xử lý vấn đề này, các loại hoá chất và kháng sinh là những biện pháp đầu tiên được con người sử dụng để điều trị cho các loại thuỷ sản. tuy nhiên, việc sử dụng các loại hoá chất và kháng sinh không đứng quy cách và liều lượng đang gây ảnh hưởng lớn tới sinh thái môi trường và sinh thái nghề nuôi, bên cạnh đó việc tồn dư kháng sinh còn ảnh hưởng rất lớn tới sức khoẻ của con người. Trong những năm gần đây, xu hướng sử dụng thảo dược trong điều trị cho bệnh thuỷ sản đang được sử dung rộng rãi trong việc điều trị bệnh trên động vât thuỷ sản vì việc sử dụng thảo dược có biên độ an toàn lớn, ít ảnh hưởng tới môi trường sinh thái cũng như môi trương nuôi, và không anh hưởng tới sức khoẻ của con người [19 ]. Các chiết xuất từ thảo dược như Hinokiticol, Citral và allylisocyanate được sử dụng rộng rãi trong bảo quản và điều trị bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra . [19 ] 13 Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá Hồ Đào đối với Bacillus anthracis. R.Koch (1887) cũng đã nghiên cứu chứng minh tính kháng khuẩn của nhiều loại tinh dầu. Năm 1959, Horak và Santavi chiết xuất từ cannabit sativa- Cannabinnacea, được chất Cannabiriolic, dung dịch 10- 15µg/ml có tác dụng diệt khuẩn với vi khuẩn gây bệnh lao ở người và vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn kháng lại penicillin [14], [21],[24 ] Mọt nghiên cứu khác của Tokin (1928) đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh có tác dụng với vi khuẩn được gọi là Phytocid, nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật rất phong phú ,có phạm vi ứng dụng rất rộng rãi. [22 ], [24 ] Horak và Santavi (1959) đã chiết xuất từ canabit santiva được chất canabiriolic, dung dịch 10 µg/l có tác dụng với vi khuẩn lao trên người và một số vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn kháng lại Penicilin,chế phẩm này được sản xuất theo dây chuyền công nghiệp, tạo ra các sản phẩm dạng mỡ, dạng bột dùng trong y học [22 ] Năm 1985, Khuê Lập Trung đã đưa ra 22 loài thảo dược, chủ yếu là phòng trị các bệnh về vi khuẩn, ngoại ký sinh trùng và bệnh đường ruột cho tôm, cá và nhuyễn thể như là : Xuyên Tâm liên, Địa Niên thảo, Lưu Xổ tử, Quản trọng, Ngủ Bội tử, Tiền thảo,... [15 ] [22 ] Tại Thái Lan, Sataporn Direkbusarakom và cộng sự (1997) đã thử nghiệm thành công khả năng kháng khuẩn của các loài thảo dược như: O.sanctum, C.alata, Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanthus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P. pulcher, P. acidus, P. debelis, P. amarus, P. debelis và P. urinaria đối với vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ có hai cây P.guajava và M.charantina có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp. Nồng độ ức chế tối thiểu của P. guajava là 0,625mg/ml và M. charantina là 1,25mg/ml. [22 ] Gần đây, Trung Quốc đã chiết tách được một loại Ankanoid từ cây Xoan rừng tên là “Yanatren” hoặc sử dụng hạt với tên Kosam, enkosam có tác dụng điều trị lỵ Amip [27 ], [29 ], [31 ] 14 Các kết quả trên chỉ mới bước đầu thử nghiệm sàng lọc các loại thảo dược chưa xác định được thành phần nào trong thực vật có tác dụng trên virus và vi khuẩn 2.3.2. Tại Việt Nam Từ xa xưa, dân ta đã biết dùng những cây cỏ quen thuộc trong vườn nhà để trị các bệnh thông thường như một số bệnh đường ruột, bệnh đường hô hấp, tiết niệu trị mụn nhọt, rửa vết thương,... [14 ], [23 ], [29 ] Theo y học cổ truyền,phần lớn những cây thuốc có tác dụng chữa bệnh nhiẽm khuẩn đã được xếp trong nhóm thuốc gọi là “thanh nhiệt giải độc, thanh nhiệt, táo thấp, thuốc khử hàn”...vv. như alicin trong tỏi, odorin trong hẹ,... [14 ] Từ thế kỷ XIV, Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều thảo mộc như tỏi , hẹ ,tô mộc,hạt cải, trầu không... để trị một số bệnh viêm nhiễm [14 ] Từ giữa thế kỉ XX trở lại đây, theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Ngữ (1956) trên 500 loài cây thuốc , đã khẳng định rằng nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn rất lớn. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn hưởng và cộng sự (1959), trên 1000 cây thuốc cũng chỉ ra rằng kháng sinh thực vật sử dụng rất an toàn, có tác dụng mạnh, nhóm nghiên cứu đã đưa ra Chế Phẩm cây Tô Mộc trị bệnh tiêu chảy Ở Miền Bắc, Hà Ký (1995) và cộng sự trong chương trình KN 04-12 đã nghiên cứu một số loài thảo dược dùng để phòng trị bệnh trên ca. Bước đầu đã chọn được 9 loài cây thuốc sau: rau nghể (Polygonum hydropiper), rau sam (Portulaca cleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu lacae), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium indicum) và cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) là những loài thảo dựoc có thể sử dụng trong phòng trị bệnh trên động vật thuỷ sản[[6 ] Ở Miền Nam, các cây cỏ được dùng trong phòng trị bệnh cho vật nuôi thuỷ sản chủ yếu từ kinh nghiệm dân gian người dân đã biết dùng cây cỏ mực (Eclipta alba), cây trầu (Piper betel) để trị bệnh kí sinh trùng cho động vật thuỷ sản Và một số địa phương khác theo kinh nghiệm người dân cũng biết dùng một số loài thực vật quen thuộc để chữa bệnh cho tôm cá đem lại hiệu quả như ở Nghệ 15 An, ở Huế và một số nơi dùng cây tỏi (Allium sativum) để phòng và trị bệnh cho động vât thuỷ sản [27 ], [29 ] Từ năm 2000, Nguyễn Ngọc Hạnh và cộng sự đã nghiên cứu thử nghiệm thành công các hợp chất chiết xuất từ thảo dược, như Hepato và Alixin có tác dụng hỗ trợ tiêu hoá tốt, giúp tôm khoẻ mạnh, sinh trưởng bình thường, có khả năng chống nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về gan. Trong đó Hepato có công dụng hỗ trợ và bảo vệ gan phòng và trị bệnh về gan như MBV và teo gan [14 ] Nghiên cứu khác của Phan Xuân Thanh và cộng tác viên (2002) đã xác định được chất: 2-hydroxy-6-pentandecatrienilbenzoat có nguồn gốc từ thảo dược, có tác dụng phòng trừ các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra. Nhằm mục đích sử dụng các hoạt chất sinh học thay thế các hoá chất độc và kháng sinh trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản [26] Gần đây khi nghiên cứu khả năng kháng nấm của dịch chiết lá Trầu, Nguyễn Ngọc Phước và cộng sự (2006) kết luận chiết xuất từ lá Trầu có khả năng tiêu diệt các loài nấm thuộc họ Lagenladium, đây là chủng nấm gây bệnh phổ biến trên Tôm nước lợ, mặn. Dịch chiết lá trầu có khả năng ức chế và tiêu diệt các loại vi khuẩn Aeromonas hydrophyla và Vibrio sp.[11] 2.3 Một số thảo dược sử dụng trong nuôi trồng thủy sản dùng trong việc chữa bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản 2.3.1. Cây thuốc cá (Derris spp) Dùng cây thuốc cá để diệt cá tạp trong ao, đầm nuôi tôm: lấy rễ cây đập giập nát để ra chất nhựa trắng, sau đó đem ngâm nước, lấy nước đó té đều xuống ao, hoặc ngâm xuống ao với liều lượng 3-5kg rễ tươi/1.000m 2 ao ở mức nước 15-20cm. [ 21] ,[22], [27] 2.3.2. Cây xoan (Melia azedarach) Dùng lá xoan để diệt trùng mỏ neo và trùng bánh cho cá rất tốt: lấy cành lá xoan non bó thành bó ngâm trong lồng nuôi cá đang bị bệnh trùng mỏ neo, trùng bánh xe, hoặc ngâm trong cá nuôi ở phía đầu nguồn nước với lượng 150-200kg lá xoan/1.000m2 ao có mức nước 1,5 - 2m hoặc 20-25kg lá xoan/lồng cá 8m 2. [22], [27], [21] 16 2.3.3. Cây thàn mát (Milletia ichthyochtona Drake ) Quả khi già hạt có chứa 30-40% dầu và chất gây độc (như rotenon, sapotoxin) đối với cá. Có thể dùng hạt thàn mát để diệt cá tạp trong ao nuôi tôm. Cách dùng: nghiền nát hạt rồi hoà vào nước, dùng nước đó tưới đều lên ao; hoặc đập nát cho vào bao tải ngâm ở ao, tác dụng chậm hơn. Liều lượng cứ 0,5-1kg hạt dùng cho một ao 1.000m2 ở mức nước 15-20cm. [21], [22 ], [27] 2.3.4. Cây sở (Cammellia sasanqua) Sở là cây ép lấy dầu, bã làm thành bánh (khô dầu sở) có chứa chất saponozit gây độc làm chết cá và có tác dụng diệt khuẩn. Khô dầu sở có tác dụng để cải tạo ao đầm nuôi tôm. Khi dùng, cần nghiền nát khô dầu sở rồi rải xuống ao, hay ngâm trong nước. [ 21] [22]. [27] 2.3.5. Cây bồ hòn (Sapindus mukorossi Gaetrn) Quả bồ hòn có nhân, hạt rất độc. Người nuôi cá, tôm dùng hạt để diệt cá tạp khi cải tạo ao đầm. Khi dùng, giã hạt thật nhỏ, hoà tan với nước, dùng nước này té đều khắp ao với liều lượng 0,5-1kg hạt/1.000m2 ao có mức nước 15-20cm. 2.3.6. Cây thầu dầu tía (Ricinus communis L.) Lá thầu dầu có chất đắng, dùng để chữa bệnh loét mang, đốm đỏ cho cá rất hiệu quả: lấy lá thầu dầu bó thành từng bó ngâm xuống ao với lượng 250-300kg lá thầu dầu/ha ao, với mức nước sâu 1,5-2m. [21], [22 ], [27] 2.3.7. Cây nghể (Polygonum hydropipe L.) Nghể là cây có vị cay nóng, hắc. Dùng cây này chữa bệnh viêm ruột, loét mang cho cá trắm cỏ, rô phi, có hiệu quả nhất đối với cá giống: lấy thân cây và lá băm nhỏ, nấu kỹ lấy nước, sau đó trộn với thức ăn cho cá ăn, với liều lượng 3kg thân lá nghể tươi/100kg cá giống, cho cá ăn liên tục từ 3-6 ngày. Cũng có thể dùng lá nghể khô xay thành bột trộn với thức ăn cho cá, 1-2kg nghể khô/100kg cá giống. 2.3.8. Cây rau sam (Portulacaoler acea L.) Dùng rau sam để chữa bệnh viêm ruột do vi khuẩn đối với cá trắm cỏ. Khi dùng, rửa sạch rau rồi vô trùng bằng nước muối 3%, rải rau trong khung nổi ở ao hoặc trong lồng cá, mỗi ngày cho ăn một lần, liên tục trong 6 ngày với liều lượng 17 1,5-3kg rau sam/100kg cá. Đối với cá giống cần băm nhỏ rau, rắc đều trên mặt ao hoặc trong lồng cá. [21], [22 ] [27] 2.3.9. Cây tía đỏ ( Ricinus communis L.) Cây tía đỏ thường được dùng để chữa bệnh đường ruột cho động vật thuỷ sản. Khi dùng lấy thân và lá cây băm nhỏ, nấu kỹ, lấy nước trộn với thức ăn tinh rồi cho ăn lượng 0,2-0,5kg lá/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong 3-5 ngày. [21] [22] [27] 2.3.10. Tỏi (Allium sativum L.) Tỏi được dùng chữa bệnh đường ruột cho cá nuôi. Khi dùng cần nghiền nát củ tỏi, trộn lẫn với thức ăn tinh cho cá ăn, liều lượng 0,5-1,5kg tỏi, trộn với thức ăn/100kg cá, cho cá ăn liên tục 6 ngày. [21] [22] [27] 2.3.11. Cây cau (Areca catechu) Chất arecolin trong hạt cau có tác dụng oxy hoá protein của tế bào kí sinh trùng làm tê liệt thần kinh của giun sán, làm tê liệt cả cơ trơn làm giun sán không bám vào thành ruột được nên dễ bị đẩy ra ngoài Dùng hạt cau với liều lượng 4g hạt cau/ 1kg cá/ 1 ngày, cho ăn trong 3 ngày để trị giun tròn kí sinh trong ruột cá trê (Spinitectus clariasi) [21] [22] [27] 2.4. Vài nét về chế phẩm EM và Bokashi trầu 2.4.1. Chế phẩm EM EM (Effective Microoganisms) có nghĩa là các vi sinh vật hữu hiệu. Chế phẩm này do Teruo Higa - trường Đại học Tổng hợp Ryukyus, Okinawoa, Nhật Bản sáng tạo và áp dụng thực tiễn vào đầu năm 1980. Trong chế phẩm này có khoảng 80 loài vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí thuộc các nhóm : vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn. 80 loài vi sinh vật này được lựa chọn từ hơn 2000 loài được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm và công nghệ lên men [16], [27] , [29], [30] Chế phẩm gốc có tên gọi là EM1, có màu nâu, mùi thơm, vị chua ngọt, độ pH < 3,5. Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng mặt trời trực tiếp chiếu vào. Thời gian bảo quản từ 6 tháng đến 1 năm. 18 Từ chế phẩm EM1 có thể chế ra các chế phẩm khác như : EM thứ cấp, EM Bokashi B (làm thức ăn cho gia súc) và EM Bokashi C (để xử lý môi trường). 2.4.2. Cây trầu 2.4.2.1. Hệ thống phân loại Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliophyta Bộ : Piperales Họ : Piperaceae Giống : Piper Loài : P. betle Hình 2. 1. Lá trầu (Piper betle .L) Trầu không hay trầu (Piper betle . L) là một loài cây gia vị hay cây thuốc, lá của nó có các tính chất dược học. [2, 319], [29], [30], [31] 19 Đây là loài cây thường xanh, lá mọc so le, cuống có bẹ, dài 1,5 - 3,5cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10 - 13cm, rộng 4,5 - 9cm, phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc) đầu lá nhọn, khi soi lên thấy rất nhiều điểm chứa tinh dầu rất nhỏ, lá thường có 5 gân. Hoa khác gốc mọc thành bông. Quả mộng không có vòi sót loại dây leo và sống lâu năm, với các lá hình trái tim có mặt bóng và các hoa đuôi sóc màu trắng, có thể cao tới 1 mét . . [2,320] [29], [30], [31] 2.4.2.2. Thành phần hoạt chất và tác dụng Lá trầu chứa từ 0,8 – 1,8 % tinh dầu thơm, có vị nồng trong lá Trầu có chứa Chavicol, chavibetle và một số hợp chất khác của phenonic, Chúng có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các loại vi trùng, tụ cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, song cầu khuẩn, vi khuẩn Bacillus subtilis và trực trùng E. coli, trầu thường đựơc người dân dùng để chữa trị các bệnh vi khuẩn trên người . [2,320] [7] [ 9] [29], [30], [31] 2.4.2.3. Tình hình sử dụng cây trầu Tại Malaysia, trầu được sử dụng để điều trị chứng đau đầu, viêm khớp và các thương tổn khớp. Tại Thái Lan và Trung Quốc, người ta dùng trầu để làm dịu bệnh đau răng. Tại Indonesia, trầu được uống như một loại trà và sử dụng như là thuốc kháng sinh. Trầu còn được sử dụng trong trà để điều trị chứng khó tiêu, chứng táo bón cũng như trong thuốc mỡ hay thuốc hít để điều trị đau đầu, giúp thông mũi. Ngoài ra, tinh dầu trầu có tác dụng hạ huyết áp, duỗi bắp cơ, trị giun sán, chữa dị ứng. [31] Ở Việt Nam từ xưa đã có tục ăn trầu. Ăn trầu có tác dụng bảo vệ răng miệng, làm cho cơ thể ấm lên. Lá trầu có chứa một số hợp chất của phenol sát khuẩn mạnh thường được dùng ngoài để chữa các bệnh nhiễm khuẩn .Ngoài ra, nước lá trầu còn dùng để rửa các vết loét, mẫn ngứa, viêm mạch bạch huyết, trị chốc lở. Dịch chiết lá trầu dùng để chữa viêm kết mạc, chữa bệnh chàm mặt ở trẻ em, bã lá trầu đắp lên ngực để chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú để ngừng tiết sữa [2,320] Nhóm nghiên cứu trường Đại học Y và bệnh viện E Hà Nội đã công bố kết quả nghiên cứu tính kháng khuẩn Helicobacter pylori (HP) trong bệnh lý viêm dạ dày mạn tính của hoạt chất toàn phần chiết xuất từ lá Trầu có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tất cả các chủng HP phân lập được trên invitro. 20