Tài liệu Khảo sát vi nấm và một số yếu tố môi trường nước trong ao nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus) thâm canh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ KIM TUYẾN KHẢO SÁT VI NẤM VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG NƯỚC TRONG AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ KIM TUYẾN KHẢO SÁT VI NẤM VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG NƯỚC TRONG AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) THÂM CANH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. PHẠM MINH ĐỨC 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm của bộ môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ. Với sự nổ lực của bản thân cùng với sự giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp “Khảo sát vi nấm và một số yếu tố môi trường nước trong ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh”. Qua đây em xin chân thành gởi lời cám ơn đến  Tất cả các Thầy Cô trong Bộ môn đã chỉ dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện và hoàn thành đề tài. Đặc biệt em xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Đức, cô Đặng Thị Mai Thy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.  Gia đình và bạn bè đã tận tình giúp đỡ vật chất và tinh thần để em có thể hoàn thành tốt đề tài. Xin chân thành cảm ơn. Cần Thơ, ngày 10 tháng 7 năm 2013 Sinh viên thực hiện Lê Kim Tuyến i TÓM TẮT Đề tài khảo sát vi nấm và một số yếu tố môi trường nước trong ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh nhằm xác định thành phần mầm bệnh vi nấm và một số yếu tố môi trường nước trong ao nuôi cá tra thâm ở canh An Giang làm cơ sở đề xuất giải pháp phòng mầm bệnh vi nấm. Nội dung nghiên cứu của đề tài là: (i) phân lập và định danh thành phần vi nấm trong môi trường nước ao nuôi cá tra và (ii) khảo sát một số yếu tố môi trường nước ao nuôi đồng thời với thu mẫu phân lập mầm bệnh vi nấm. Đề tài được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2013 tại Tỉnh An Giang. Thu mẫu nước với nhịp thu mẫu là 2 tuần/lần để phân lập vi nấm và phân tích một số yếu tố môi trường tại 4 ao nuôi cá tra thâm canh và 2 kênh cấp nước tại hai địa điểm nuôi khác nhau. Phân lập và định danh vi nấm dựa vào đặc điểm hình thái của vi nấm và căn cứ theo khóa phân loại của (Coker, 1923) đối với vi nấm bậc thấp và khóa phân loại của (Hoog et al., 2000) đối với vi nấm bậc cao. Phương pháp nuôi cấy vi nấm trên lam kính theo phương pháp Riddells (Game et al., 1980). Yếu tố thủy lý môi trường gồm nhiệt độ, pH và oxy hòa tan được đo trực tiếp bằng máy đo chuyên dùng. Yếu tố thủy hóa gồm N-NH4+ phân tích bằng phương pháp so màu quang phổ tại phòng thí nghiệm thủy hóa, N-NO3và N-NO2- phân tích bằng phương pháp so màu nhanh theo bộ test. Kết quả nghiên cứu về phân lập và định danh vi nấm là tìm thấy được 11 chủng trong đó có 2 nhóm chính là Fusarium sp. (63,63%) và Aspergillus sp. (36,37%). Nhiệt độ nằm trong khoảng 28-32oC, pH từ 6,2-7,5 và oxy 0,6-5,3 mg/l. Phân tích mối tương quan giữa một số yếu tố môi trường với mật độ khuẩn lạc vi nấm trong môi trường nước ao nuôi chưa cao, tuy nhiên hàm lượng N-NH4+ có mối tương quan với mật độ khuẩn lạc vi nấm. Như vậy, nghiên cứu này đã cung cấp dẫn liệu khoa học về 2 giống vi nấm bậc cao là Fusarium sp. và Aspergillus sp. xuất hiện trong môi trường ao nuôi cá tra thâm canh ở An Giang và kết quả bước đầu cho thấy mật độ khuẩn lạc vi nấm có sự biến động theo chu kỳ nuôi cá tra và có mối liên quan tương đối với hàm lượng N-NH4+. ii DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Sự biến động của các yếu tố thủy lý trong ao nuôi cá tra thâm canh ........ 15 Bảng 4.2: Mật số khuẩn lạc vi nấm (CFU/mL) trong môi trường nước ao nuôi và kênh cấp theo thời gian (ngày nuôi) .................................................................................. 21 Bảng 4.3. Hệ số tương quan (Spearson correlation, r) và mức ý nghĩa (P<0,05) của mật số khuẩn lạc vi nấm trong môi trường nước với một số yếu tố môi trường.................. 22 iii DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1. Sự biến động của NO2- trong ao nuôi cá thâm canh............................... 16 Hình 4.2. Sự biến động của NO3- trong ao nuôi cá thâm canh............................... 17 Hình 4.3. Sự biến động của NH4+ trong ao nuôi cá thâm canh .............................. 18 Hình 4.4. Mật độ trung bình của vi nấm trong ao nuôi cá thâm canh .................... 19 Hình 4.5. Đặc điểm hình thái vi nấm Fusarium sp................................................ 20 Hình 4.6. Đặc điểm hình thái vi nấm Aspergillus sp. ........................................... 21 iv MỤC LỤC Lời cảm ơn .............................................................................................................i Tóm tắt..................................................................................................................ii Danh sách bảng ....................................................................................................iii Danh sách hình.....................................................................................................iv PHẦN I: GIỚI THIỆU………………. …………………………………………. 3 1.1 Đặt vấn đề . ..................................................................................................... 3 1.2 Mục tiêu đề tài................................................................................................. 4 1.3 Nội dung đề tài ................................................................................................ 4 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................. 5 2.1 Ảnh hưởng các yếu tố môi trường trong ao nuôi thủy sản................................ 5 2.2 Nghiên cứu về một số yếu tố môi trường trong ao nuôi cá tra.......................... 6 2.3 Bệnh do vi nấm trên cá .................................................................................... 8 2.3.1 Bệnh do vi nấm bậc thấp ............................................................................... 8 2.3.2 Bệnh do nấm bậc cao..................................................................................... 9 2.4 Một số nghiên cứu vi nấm trong môi trường..................................................... 9 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................... 11 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................... 11 3.1.1 Địa điểm thu mẫu ........................................................................................ 11 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu.................................................................................... 11 3.1.3 Thời gian thực hiện nghiên cứu ................................................................... 11 3.2 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 11 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu vi nấm.......................................................................... 11 3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 12 3.3.1 Phương pháp thu mẫu môi trường............................................................... 12 3.3.2 Phương pháp xác định mật số vi nấm tổng cộng trong môi trường nước ...... 12 3.3.3 Phương pháp phân lập và định danh vi nấm từ mẫu nước ............................ 12 3.3.4 Phương pháp thu thập, tính toán và xử lý số liệu.......................................... 13 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 14 4.1 Biến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi cá Tra thâm canh..................14 4.1.1 Nhiệt độ, oxy, pH ........................................................................................ 15 4.1.2 NH4+ ............................................................................................................ 16 4.1.3 NO2- ............................................................................................................ 17 4.1.4 NO3- ............................................................................................................ 18 4.2 Phân lập và định danh nấm trong môi trường nước ao nuôi ............................ 19 4.2.1 Mật số vi nấm tổng cộng trong môi trường nước ......................................... 19 4.2.2 Phân lập và định danh nấm trong môi trường nước ao nuôi cá tra ................ 19 4.2.2.1 Fusarium sp.............................................................................................. 19 4.2.2.2 Aspergillus sp ........................................................................................... 21 4.2.3 Mối tương quan giữa vi nấm với các chỉ tiêu môi trường nước .................... 21 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................ 22 5.1 Kết luận.......................................................................................................... 22 5.2 Đề xuất........................................................................................................... 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................23 Phụ lục ................................................................................................................. 25 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam đang phát triển nhanh chóng về thủy hải sản và là ngành kinh tế mũi nhọn và vươn lên trở thành một trong những quốc gia đứng đầu thế giới. Theo đánh giá của VASEP (2010) cá tra là sản phẩm có tốc độ phát triển nhanh và được thị trường ưa chuộng. Theo Tổng cục thống kê cho biết sản lượng cá tra 6 tháng đầu năm 2013 chỉ đạt 560.000 tấn, giảm 3% so với cùng kỳ năm 2012. Diện tích nuôi và sản lượng cá tra giảm nhiều là An Giang 846 ha, giảm 3% (sản lượng 130.000 tấn), Cần Thơ 746 ha, giảm 5,1%, (61.000 tấn), Vĩnh Long 434 ha, giảm 10,6% (52.000 tấn), Bến Tre 416 ha, giảm 7,1% (90.000 tấn). Sản lượng này giảm chủ yếu là do sản xuất cá tra thua lỗ kéo dài, giá cá tra nguyên liệu giảm, chi phí đầu vào tăng cao, nhu cầu nhập khẩu bị thu hẹp. Toàn vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long hiện có 6000 ha nuôi cá tra xuất khẩu, theo số liệu từ VASEP, 5 tháng đầu năm 2013, xuất khẩu cá tra sang EU đạt 159 triệu USD, chiếm 22,4% tổng kim ngạch xuất khẩu cá tra của Việt Nam, giảm tới 17,6% so với cùng kỳ năm 2012. Nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL đã phát triển mạnh trong thời gian qua về mọi mặt như kỹ thuật nuôi, thức ăn, nâng cao chất lượng con giống, thử nghiệm vắc xin. Nhiều nghiên cứu về bệnh trên cá tra nuôi thương phẩm đã được công bố như bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila (Từ Thanh Dung, 2005). Bệnh trắng da do vi khuẩn Flavobacterium columnare cũng gây nhiều thiệt hại (Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010). Bệnh gạo do nhiễm bào tử trùng Myxosporea và vi bào tử trùng Microspora (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2011). Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu về vi nấm trên cá tra và một số loài cá nước ngọt khác như cá chép, rô phi, cá mè, trê (Nguyễn Thị Thu Hằng và Phạm Minh Đức, 2009). Tuy nhiên, việc nghiên cứu các chỉ tiêu môi trường nước ở trong ao nuôi cá tra thâm canh đã được rất nhiều tác giả nghiên cứu như “Biến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi cá tra ở An Giang” Huỳnh Trường Giang và ctv, (2008). Cho thấy được sự biến động của các yếu tố môi trường, hàm lượng các muối hòa tan dinh dưỡng không khác biệt nhiều ở các ao nhưng lại tăng lên rất cao không phù hợp với môi trường nuôi. NO3- thì tăng rất cao ở mùa khô, ở những ao cá bệnh hoặc cá khỏe. Còn nghiên cứu của Đỗ Thị Thanh Hương, Nguyễn Thị Kim Hà và ctv (2012) “ Ảnh hưởng của oxy lên tăng trưởng và tiêu hóa của cá tra” thì cho rằng các yếu tố môi trường nuôi ở các nghiệm thức 1 hoặc ao nuôi thì phù hợp, riêng oxy trong ao nuôi cá tra đạt mức bão hòa thì cá sẽ có tốc độ tăng trưởng đạt mức cao nhất. Đối với Lê Bảo Ngọc, (2004). “Đánh giá chất lượng môi trường ao nuôi cá Tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở xã Tân Lộc, huyện Thốt Nốt, Thành phố Cần Thơ” thì các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thực hiện thí nghiệm thì tùy vào các chỉ tiêu môi trường nhiệt độ, oxy, pH thì dao động lên xuống nhưng lại cao hơn các nghiêm thức khác...tuy vậy việc nghiên cứu mối tương quan giữa môi trường và bệnh vi nấm thì chưa được tìm hiểu nhiều về riêng khía cạnh của nước, chính vì thế nên đề tài “Khảo sát vi nấm và một số yếu tố môi trường nước trong ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Xác định thành phần mầm bệnh vi nấm và một số yếu tố môi trường trong môi trường nước ao nuôi cá tra thâm canh làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về bệnh trên động vật thủy sản. 1.3 Nội dung nghiên cứu  Phân lập thành phần vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra thâm canh.  Khảo sát một số yếu tố môi trường nhiệt độ, pH, DO, NO2-, NO3- và NH4+ trong ao nuôi cá tra thâm canh. 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Ảnh hưởng các yếu tố môi trường trong ao nuôi thủy sản Cá là loài biến nhiệt, nhiệt độ cơ thể cá thay đổi theo nhiệt độ nước. Khi nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng, cá bị sốc, ít ăn và chậm lớn. Nhiệt độ thích hợp cho cá, tôm vùng nhiệt đới nằm trong khoảng 25-32oC. Tuy nhiên, cá có thể chịu đựng nhiệt độ trong khoảng 20-35oC. Nhiệt độ từ 26–30 oC là lý tưởng đối với việc nuôi cá da trơn (NRC, 1993). Có thể đo nhiệt độ bằng nhiệt kế thủy ngân hoặc nhiệt kế rượu, khi đo nhiệt độ cần chú ý thường nhiệt độ ở tầng mặt và tầng đáy chênh lệch nhau 5oC, nên nếu đo nhiệt độ tầng mặt sẽ không thể hiện được nhiệt độ của nước. Tuy nhiên, sự biến động nhiệt độ nước không chỉ phụ thuộc vào thời tiết mà còn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố khác như: độ sâu của ao, cường độ trao đổi nước, thời điểm ánh sáng trong ngày... Ngoài thức ăn, oxy cũng là yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cá. Lượng oxy trong nước thay đổi liên tục. Vào ban ngày, lượng oxy trong nước cao do có ánh sáng giúp tảo quang hợp và tạo ra nhiều oxy trong nước. Ban đêm không có ánh sáng tảo không quang hợp được nên không tạo ra oxy. Hơn nữa, ban đêm tảo phải thở nhiều nên lượng oxy giảm thấp nhất là sáng sớm (56 giờ sáng). Có thể đo hàm lượng oxy trong nước bằng hộp dung dịch (bộ test kit Oxygen) hoặc máy đo. Nên đo lượng oxy trong nước trước khi mặt trời mọc. Hàm lượng oxy tốt nhất cho ao nuôi tôm cá khoảng 3-5 mg/lít vào sáng sớm. Vì vậy thiếu oxy cá sẽ bỏ ăn và chậm lớn, biểu hiện dễ dàng nhận thấy khi thiếu oxy là cá sẽ nổi đầu vào sáng sớm (Swingle, 1969). pH là một nhân tố môi trường có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến đời sống thủy sinh vật. Khi nước ao có màu xanh, độ pH thường cao vào ban ngày. Nếu độ pH quá cao sẽ làm gia tăng độc tính của khí độc (NH3), có hại cho cá tôm, làm thay đổi độ thẩm thấu của màng tế bào dẫn đến làm rối loạn quá trình trao đổi muối của cơ thể với môi trường ngoài (Trương Quốc Phú, 2006). pH tăng cao (> 9,0) giúp tảo phát triển rất nhanh. Ngoài ra ở thời điểm khác pH đo được có giá trị < 7,0, vì thế pH có thể sẽ rất thấp vào lúc sáng sớm nên sẽ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cá (Huỳnh Trường Giang và ctv, 2008). NO2- sinh ra do sự chuyển hoá của Nitrosomonas trong quá trình nitrate hóa và phản nitrat hoá. Nguyên nhân có thể do Bacillus trong bể đã tham gia vào quá trình phân hủy hữu cơ, tạo ra các muối amon, là nguồn thức ăn phong phú cho vi khuẩn Nitrosomonas sớm phát triển. Theo Boyd et al. (1998) thì NO2- có 3 tác dụng gây độc cho tôm cá khi lớn hơn 2 mg/L, hàm lượng thích hợp cho ao nuôi thủy sản phải nhỏ hơn 0,3 mg/l. Vào mùa mưa hàm lượng NO2- cao hơn thời điểm giao mùa khô-mưa. Timmons et al. (2002) khuyến cáo hàm lượng NO2- trong ao nuôi thủy sản phải nhỏ hơn 1,0 mg/L. Khi NO2- ở nồng độ > 0,1 mg/L và pH<7 thì máu cá có thể trở nên có màu nâu do NO2- kết hợp với Hemoglobine của máu cá (Schmittou, 1993). Theo Schwedler et al. (1985) thì hàm lượng chloride, pH, kích cỡ cá, oxy hòa tan, tình trạng dinh dưỡng ảnh hưởng đến độ độc của NO2- nên không thể xác định được nồng độ gây chết, hay nồng độ an toàn cho động vật trong ao nuôi thủy sản. Hàm lượng NO3- sinh ra do sự chuyển hoá của nhóm vi khuẩn Nitrobacter trong quá trình nitrat hóa. NO3- là dạng đạm được thực vật sễ hấp thu nhất, không độc đối với sinh vật, nguyên nhân làm biến động có thể do sự phát triển của tảo. Theo nghiên cứu của Boyd et al,. (1998) hàm lượng NO3- thích hợp từ 0,2–10 mg/L. Hàm lượng này cao sẽ không có lợi, dễ xảy ra hiện tượng tảo nở hoa gây biến đổi chất lượng nước trong ao nuôi. Hàm lượng TAN trong ao nuôi thủy sản được nhắc đến ở 2 dạng là NH3 tự do và ion NH4+. NH3 là dạng gây độc ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vật nuôi. Theo Colt và Armstrong (1979) thì NH3 trong nước cao sẽ làm cá khó bài tiết NH3 ra môi trường ngoài, làm thay đổi độ thẩm thấu của màng tế bào đưa đến cá chết… còn ion NH4+ rất cần thiết cho sự phát triển của các sinh vật nhưng nếu hàm lượng NH4+ quá cao sẽ làm cho thực vật phù du phát triển mạnh không có lợi cho cá. Tôm cá có thể tồn tại và phát triển tốt ở hàm lượng TAN dao động từ 0,2-2 mg/L và theo Boyd et al., (2002) và TAN trong môi trường ao nuôi phải nhỏ hơn hoặc bằng 3 mg/L thì thích hợp. (Whestone et al,. 2002; Boyd et al,. 2002) 2.2 Nghiên cứu về một số yếu tố môi trường trong ao nuôi cá tra Nghiên cứu của Huỳnh Trường Giang và ctv (2008) về “ Đánh giá chất lượng nước trong ao nuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh tại tỉnh An Giang” được thực hiện nhằm đánh giá diễn biến môi trường nước trong hệ thống các ao tại các vùng nuôi trọng điểm của tỉnh An Giang thì nhiệt độ ở các ao nuôi dao động trong khoảng 27-34 oC. Nhiệt độ ở các ao cá khỏe cao hơn (30,7±1,5 oC) và khác biệt có ý nghĩa với nhiệt độ ở các ao cá bệnh (29,8±1,5 o C). Nhiệt độ từ 26-30 oC là lý tưởng đối với việc nuôi cá da trơn (NRC, 1993), nhiệt độ ở các ao nghiên cứu phù hợp với sự phát triển bình thường của cá, Huỳnh Trường Giang và ctv (2008). Còn theo nghiên cứu của Đỗ Thị Thanh Hương và ctv (2012) thì khoảng nhiệt độ nằm trong khoảng dao động 4 26-27 oC là khoảng thích hợp, không ảnh hưởng cho quá trình làm nghiên cứu về “ ảnh hưởng của oxy lên tăng trưởng và tiêu hóa của cá tra”. Hàm lượng oxy hòa tan trong các ao cá khỏe dao động từ 0,44–15,9 mg/L và trong các ao cá bệnh là 0,7-12,1 mg/L, trong các đợt thu mẫu thì hàm lượng oxy giảm rất thấp nhỏ hơn 1,0 mg/L, Huỳnh Trường Giang và ctv (2008). Kết quả cho đợt thu mẫu oxy của Huỳnh Trường Giang và ctv (2008), cho thấy hàm lượng oxy hòa tan trong các ao cá khỏe và ao cá bệnh khác biệt không ý nghĩa, hàm lượng oxy hòa tan trong các ao nuôi vào mùa mưa cao hơn các mùa khác. Còn kết quả nghiên cứu của Dương Thuý Yên (2003) thì cá tra có khả năng sống được trong môi trường có hàm lượng oxy nhỏ hơn 2 mg/L. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Dung (2001) cho thấy pH trong các ao nuôi cá tra thâm canh tại An Giang chỉ dao động từ 6,5-7,0, trong khi đó pH đo được từ nghiên cứu của Lê Bảo Ngọc (2004) thì biến động từ 8,06-8,12. pH càng ngày càng tăng lên là sự thâm canh hóa của ao nuôi càng cao, lượng thức cung cấp ngày càng nhiều dẫn đến tăng dần tần xuất tích tụ hàm lượng dinh dưỡng làm tảo phát triển và pH tăng theo ngày một cao hơn (Trương Quốc Phú, 2006). Hàm lượng NO2- trong các ao cá khỏe trung bình 0,158± 0,272 mg/L và ở các ao cá bệnh là 0,178± 0,211 mg/L (Huỳnh Trường Giang và ctv, 2008). Vào mùa mưa thì hàm lượng NO2- cao hơn thời điểm mùa khô, cao nhất là 1,359 mg/L. Theo Boyd et al. (1998) và Timmons et al. (2002) khuyến cáo hàm lượng NO2- trong ao nuôi thủy sản phải nhỏ hơn 1,0 mg/L. Theo Schmittou (1993), khi NO2- ở nồng độ lớn hơn 0,1 mg/L và pH nhỏ hơn 7 thì máu cá có thể trở nên có màu nâu do NO2- kết hợp với Hemoglobine của máu cá. Hàm lượng NO3- biến thiên từ 0,122-18,00 mg/L, dao động từ 0,12-1,63 mg/L trong các ao cá khỏe và 0,188-18,00 mg/L trong các ao cá bệnh (Huỳnh Trường Giang và ctv, 2008). NO3- đã cao hơn giới hạn về chất lượng nước cho ao nuôi cá (Boyd, 1998). Hàm lượng NO3- chịu ảnh hưởng rất nhiều từ NO2-, NO3- cũng là yếu tố không gây độc cho cá nhưng NO3- quá nhiều trong ao sẽ dẫn tới hiện tượng phú dưỡng trong ao nuôi. Theo Châu Minh Khôi và ctv (2012), sự tích tụ hàm lượng đạm, lân vô cơ và hữu cơ trong nước và bùn đáy ao nuôi cá tra thâm canh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long thì NH4+ là dạng N vô cơ chủ yếu trong nước ao, dao động trong khoảng 0,02 – 8,2 mg/l. Hàm lượng NH4+ ở các ao nuôi rất biến động trong khoảng 0,033 – 4,602 mg/L. Khi hàm lượng này vượt mức 2,0 mg/L biểu thị môi trường ao nuôi giàu dinh dưỡng (Huỳnh Trường Giang và ctv, 2008). Trong ao nuôi cá tra, hàm lượng NH4+ hòa tan tăng theo thời gian nuôi, đạt cao nhất khoảng 8 mg/l vào giai đoạn 3 – 4,5 tháng sau khi nuôi. Hàm lượng 5 NH4+ gia tăng theo tuổi cá tương ứng với sự gia tăng lượng thức ăn cung cấp và chất thải của cá. 2.3 Bệnh do vi nấm trên cá 2.3.1 Bệnh do vi nấm bậc thấp Bệnh nấm ở động vật thủy sản là do nấm bệnh gây ra, chúng ký sinh hấp thụ chất dinh dưỡng, làm cơ bi hoại tử, phụ bộ bị hủy hoại và mất đi. Nấm ký sinh ở mang ảnh hưởng quá trình hô hấp, ký sinh ở trứng cá và trứng giáp xác làm chúng không phát triển được (Phạm Minh Đức, 2009). Nấm gây bệnh ở động vật thủy sản thường là nấm hình sợi, đơn bào hay đa bào. Sợi nấm có vách ngăn gọi là nấm bậc cao chủ yếu nhóm nấm bất toàn hoặc không có vách ngăn gọi là nấm bậc thấp chủ yếu nấm thủy mi. Sợi nấm thường có kích thước lớn, tùy thuộc vào giống loài như Aphanomyces piscicida... còn một số loài thuộc các giống như, Achlya, Aphanomyces và Saprolegnia phổ biến gây bệnh ở động vật thủy sản (Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề và ctv, 2004). Một số loài thuộc Saprolegnia phổ biến gây bệnh ở động vật thủy sản như Saprolegnia dicnina, S. parasitica, S. ferax. Saprolegnia có vòng đời phức tạp vì có thể sinh sản hữu tính bằng noãn bào tử (oospore) và sinh sản vô tính bằng động bào tử (zoospore). Động bào tử được sinh ra ở đầu mút của khuẩn ty được gọi là túi bào tử (zoosporangia). Đây là phương cách sinh sản thường xuyên và cũng là phương cách lan truyền bệnh. Tiền bào tử được sinh ra từ túi nang, thành bào tử dày, nảy mầm, cho ra động bào tử, đây là giai đọan vận động mạnh và phát tán mạnh. Động bào tử thường bám vào trứng cá và có thể trở lại giai đọan bào tử dày nếu vật chủ không thích hợp. Sự nhiễm nấm ở trứng cá đã gây ra nhiều khó khăn cho việc sản xuất giống. Nấm thường xâm nhập và phát triển mạnh ở những trứng không thụ tinh, cạnh tranh sự trao đổi oxy đối với trứng thụ tinh khác (Phạm Minh Đức, 2009). Nấm Aphanomyces sp. gây bệnh trên ba ba giống Pelodiscus sinensis, (Sinmuk et al., 1996). Cá lóc bông Channa pleurophthalmus và cá sặc rằn Trichogaster tritropterus (Hanjavanit et al., 1997). Ngoài ra Aphanomyces frigidophilus nhiễm bệnh trên trứng cá hồi chấm hồng (Salvelinus leucomaenis) ở Nhật Bản Aphanomyces có khả năng sinh sản vô tính và hữu tính (Kitancharoen and Hatai, 1997; Yanong, 2003). Aphanomyces sp. được phân lập từ vỏ giáp của ba ba giống. Dấu hiệu bệnh lý thể hiện trên vỏ giáp xuất hiện nhiều đốm trắng giống như bông gòn, vỏ bị hoại tử. Cá lóc bông và cá sặc rằn có dấu hiệu bệnh lý là những búi trắng giống như bông gòn ở vùng bị tổn thương (Hanjavanit et al,. 1997). 6 2.3.2 Bệnh do nấm bậc cao Bên cạnh các tác nhân gây bệnh do ký sinh trùng và vi khuẩn thì nấm cũng là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến ở động vật thủy sản đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới. Ngoài ra, nấm bậc cao chủ yếu là nấm: Fusarium, Exophiala, Ochroconis, Acremodium và Plectosphorium (Phạm Minh Đức, 2010). Theo những nghiên cứu gần đây, các giống Acremonium, Geotrichum và Fusarium đã được phân lập và tìm thấy trên cá rô đồng (Anabas testudineus) bị bệnh “nấm nhớt’’ trong ao nuôi thâm canh ở Hậu Giang và Cần Thơ với các dấu hiệu nhiều nhớt trên thân, vảy xù xì, sau đó lan rộng toàn thân (Trần Ngọc Tuấn, 2010). Theo Phạm Minh Đức (2010) thì Acremonium thường được nhận dạng bởi sự xuất hiện của thể bình có một vách ngăn ở gốc. Các loài nấm khác với thể bình ngắn, dạng búp măng và không có vách ngăn thường thuộc giống Phialemonium. Các loài nấm có các bào tử được hình thành trực tiếp từ các khuẩn ty có thể thuộc giống Lecythophora (có viền cổ áo ở đỉnh) hoặc Hormonema (không có viền cổ áo ở đỉnh). Nghiên cứu của Phạm Minh Trúc và ctv (2012) định danh được 44 chủng nấm gây bệnh trương bóng hơi trên cá tra nuôi thâm canh thuộc giống Fusarium sp. Kết quả giải trình từ gen 28S rRNA và tra cứu trên Blast search cho kết quả 2 chủng phân lập từ cá bệnh F1P2 và F12P2 lần lượt thuộc loài Fusarium oxysporium và Fusarium subglutinans. 2.4 Một số nghiên cứu vi nấm trong môi trường Theo nghiên cứu của Marano and Steciow (2006) về tần số xuất hiện và sự phong phú của các giống nấm trong môi trường nước ở Argentina. Trong nghiên cứu này nhóm tác giả quan tâm tới tám giống nấm thường gặp như: Achlya, Aphanomyces, Dictyuchus, Olpidiopsis, Phytophthora, Pythium, Rhizophlyctis và Saprolegnia. Đây là những giống nấm phân bố khá nhiều ở vùng nước ngọt và đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái như một nhân tố phân hủy vật chất hữu cơ trong nước (Müeller et al., 2004). Trong một nghiên cứu khác thì chỉ ra rằng nhóm nấm thủy mi xuất hiện ở những dòng sông, suối nhiều hơn ở những vùng nước tĩnh (Johnson et al., 2002). Kết quả của Marano và Steciow thu được 115 chủng nấm thu ở 03 vùng nước chảy ở Argentina; trong đó có 93% chủng nấm thuộc nhóm Saprolegniomycetidae và 7% là nhóm Peronosporomycetidae. Nghiên cứu của Kiziewicz and Nalepa (2008) phát hiện có 31 giống nấm được tìm thấy trong môi trường nước ở hồ Michigan. Nấm xuất hiện với tần số khá 7 cao như Achlya (7 loài), Pythium (4 loài), Aphanomyces (3 loài), Myzocytium (3 loài). Đồng thời nấm phân bố nhiều trong môi trường nước. Không tìm thấy nhiều sự khác biệt khi phân tích nấm trong mẫu nước được thu ở gần bờ hay xa bờ bề mặt và đáy ao (Kiziewicz và Nalepa, 2008). 8 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm thu mẫu và thời gian nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm thu mẫu Nghiên cứu được thực hiện tại các ao nuôi cá tra thâm canh ở An Giang. 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm nấm, Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần thơ. 3.1.3 Thời gian thực hiện nghiên cứu: từ tháng 02 đến tháng 07 năm 2013. 3.2 Vật liệu nghiên cứu  Thiết bị và dụng cụ thu phân tích môi trường Dụng cụ: chai chịu nhiệt 250 ml (Đức) vô trùng, lọ nhựa, thùng lạnh, đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, micropipette, bộ tiểu phẩu, ống cắt số 2, khay nhựa, que cấy, thước kẹp. Thiết bị: máy đo pH Hanna sản xuất tại (Romania), máy đo oxy Consort C5020 được sản xuất tại (Thụy Sĩ), bộ test môi trường gồm NO2-, NO3-, NH4+, Tủ lạnh, kính hiển vi, kính hiển vi đảo chiều, kính hiển vi huỳnh quang, tủ ủ, tủ cấy, nồi tiệt trùng, tủ lạnh. 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu vi nấm Mẫu nước Mẫu nước trong ao nuôi cá tra thâm canh theo định kỳ đi thu mẫu là 2 tuần/lần. Các loại thuốc và hóa chất dùng trong phân lập vi nấm Thuốc kháng sinh: Ampicilin và Streptomycin. Hóa chất: lacto-phenol cotton blue, nước muối sinh lý nước cất và cồn tuyệt đối. Ngoài ra còn có nước muối sinh lý, nước cất, và NaCl. Môi trường nuôi cấy nấm: Môi trường thạch GYA (1% glucose, 0,25% Yeast-extract và 1,5% agar), môi trường lỏng GY (1% glucose, 0,25% Yeastextract) và môi trường PDA (39g/1000 ml). 9 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu mẫu môi trường Mẫu nước được thu trực tiếp từ các ao nuôi cá tra thâm canh ở 4 ao và 2 kênh cấp thu định kì 2 tuần/lần. Mẫu được thu tại các vị trí gồm ở hệ thống cấp nước, thoát nước và giữa ao. Mẫu thu được giữ trong chai chịu nhiệt 250 ml tiệt trùng trữ lạnh và đem về phân tích trong phòng thí nghiệm. Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, DO, pH, NO2-, NO3- và NH4+ cũng được xác định bằng máy đo và bộ test. 3.3.2 Phương pháp xác định mật số vi nấm tổng cộng trong môi trường nước Chuẩn bị môi trường: Môi trường GYA kháng sinh chuẩn bị sẵn để trong tủ mát. Cách xác định: Dùng ống micropipet cho 0,5ml mẫu nước ao vào môi trường GYA có kháng sinh Ampicilin và Streptomycin với liều lượng 500 µg/ml vào xung quanh để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, trãi đều mẫu bằng que thủy tinh cho đến khi dung dịch mẫu thấm vào bề mặt agar. Mẫu nước được lập 5 lần, sau đó ủ trong tủ ấm 28oC, đọc kết quả 2-5 ngày bằng cách đếm tổng số khuẩn lạc ở mỗi đĩa. Mật độ được tính ở những đợt thu theo công thức: CFU/ml = Số khuẩn lạc x độ pha loãng x 2 Trong đó: A: số khuẩn lạc trung bình ở 5 đĩa môi trường của ao. 3.3.3 Phương pháp phân lập và định danh vi nấm từ mẫu nước.  Nấm bậc thấp Định danh nấm bậc thấp căn cứ vào đặc điểm hình thái sinh sản vô tính. Dựa vào đặc điểm màu sắc khuẩn lạc trên môi trường GYA, đặc điểm hình thái trong môi trường lỏng GY và sự hình thành bào tử. Nấm được định danh theo khóa phân loại của Coker (1923). Phương pháp nuôi cấy nấm sinh sản vô tính để định danh nấm: Chuẩn bị dụng cụ vô trùng gồm đĩa petri, môi trường GY lỏng (1% glucose, 0,25% yeastextract), môi trường thạch GYA, môi trường nước vòi. Tiếp theo, tạo sinh khối nấm bằng cách cắt 2-3 khối agar nấm (5 mm2) trong môi trường GYA cấy sang môi trường GY lỏng, ủ khoảng 28oC khoảng 2 ngày (chờ khi khuẩn ty phát triển nhiều). Sau đó, cắt 2-3 khối sợi nấm trong môi trường GY lỏng, 10 rửa 3 lần nước vòi vô trùng và chuyển những sợi nấm vào đĩa petri chứa nước vòi vô trùng (25 mL/đĩa), ủ 28oC khoảng 14-16 giờ. Cuối cùng, quan sát hình thái sinh sản vô tính: sau thời gian ủ 14-16 giờ theo dõi liên tục quá trình sinh sản bằng kính hiển vi đảo chiều và chụp hình.  Nấm bậc cao Nấm được định danh theo khóa phân loại của de Hoog et al. (2000) dựa vào các đặc điểm màu sắc khuẩn lạc trên môi trường GYA và PDA, đặc điểm hình thái sợi nấm và kích thước, đặc điểm cuống bào tử và bào tử về hình dạng và kích thước trong quá trình sinh sản của chủng nấm phân lập được. Phương pháp nuôi cấy nấm trên lam theo phương pháp Riddells’s (Game et al., 1980) để quan sát các đặc điểm về hình thái của nấm. Phương pháp cấy trên lam được thực hiện như sau: thực hiện trong điều kiện vô trùng dùng dao cắt một khối môi trường agar (khoảng 1x1x1 cm); đưa khối agar này lên lam đã vô trùng được gác trên que thủy tinh hình chữ V, bên dưới có lớp giấy thấm nhỏ nước cất vô trùng để giữ ẩm đặt trong đĩa Petri; cấy nấm vào 4 mặt bên của khối agar; đặt lam lên khối agar này; ủ đĩa cấy ở nhiệt độ 28oC cho đến khi quan sát thấy nấm phát triển bao phủ lam; nhẹ nhàng lấy lam ra; lam có nấm phát triển được để trên một lam có nhỏ giọt thuốc nhuộm cotton blue; giữ nguyên và cố định bằng keo sơn móng tay. Quan sát dưới kính hiển vi, ghi nhận kết quả và chụp hình. 3.4.4 Phương pháp thu thập, tính toán và xử lý số liệu  Số liệu của mầm bệnh vi nấm và mối liên hệ của vi nấm với một số yếu tố môi trường trong ao nuôi cá tra thâm canh thì được đưa về phòng thí nghiệm phân tích.Vẽ đồ thị, biểu bảng và viết luận văn bằng phần mềm Microsoft excel và Microsoft word. 11 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Biến động các yếu tố môi trường trong ao nuôi cá Tra thâm canh Để đánh giá được kết quả các yếu tố môi trường trong suốt quá trình nuôi, ta cần bảng số liệu thể hiện rõ được vấn đề cần thiết này, sau đây là bảng số liệu về chỉ tiêu thủy lý sau các đợt thu mẫu. 4.1.1 Nhiệt độ, oxy và pH: Bảng 4.1: Sự biến động của các yếu tố thủy lý trong ao nuôi cá tra thâm canh Thời gian nuôi (tuần) Yếu tố Tuần 1 Nhiệt độ (oC) Oxy (mg/L) pH Tuần 3 Tuần 5 Ao I Kênh I Ao II Kênh II Ao I Kênh I Ao II Kênh II Ao I Kênh I 30,60±0,71 30,30±0,14 32,10±0,0 31,60±0,0 Ao II Kênh II 31,45±0,78 Tuần 7 Tuần 9 Tuần 11 30,70±0,0 32,85±0,07 32,55±0,21 30,80±1,13 31,30±0,0 32,00±0,0 32,20±0,0 30,00±0,0 31,50±0,42 30,95±0,49 33,25±0,35 33,25±0,78 31,30±0,42 31,50±0,0 32,10±0,0 30,40±0,0 32,40±0,0 32,90±0,0 30,90±0,0 1,25±0,21 2,15±0,49 0,60±0,0 2,70±1,41 1,80±0,42 0,65±0,07 3,30±0,0 3,30±0,0 3,60±0,0 5,30±0,0 4,40±0,0 3,20±0,0 2,45±0,35 3,10±0,0 2,20±1,41 3,65±0,07 3,35±0,35 1,75±0,49 1,60±0,0 1,40±0,0 1,30±0,0 1,40±0,0 2,10±0,0 2,20±0,0 6,35±0,21 6,35±0,21 6,75±0,07 6,85±0,07 6,65±0,21 6,80±0,14 6,80±0,0 7,10±0,0 7,20±0,0 7,10±0,0 7,20±0,0 6,30±0,0 7,05±0,07 7,25±0,07 7,30±0,0 7,10±0,28 7,25±0,21 6,80±0,14 7,30±0,0 7,90±0,0 7,50±0,0 7,50±0,0 7,30±0,0 7,40±0,0 Trong nghiên cứu này cho thấy các yếu tố thủy lý biến động không đáng kể (Bảng 4.1). Yếu tố nhiệt độ ở các ao nuôi cũng như kênh cấp khá ổn định qua các đợt thu mẫu, vì thời gian thu mẫu từ tháng 02 đến tháng 07 năm 2013, đây là thời điểm từ mùa khô sang mùa đầu mùa mưa. Tuy nhiên, nhiệt độ trong ao nuôi và kênh cấp không có sự khác biệt đáng kể, dao động trong khoảng từ 30oC đến 33oC, đo lúc 8h30 sáng. Theo Boyd (1990), khoảng nhiệt độ thích hợp cho cá da trơn phát triển 4-35oC, và khoảng nhiệt độ phát triển tốt nhất là 28-30oC. Bên cạnh đó, NRC (1993) cũng đưa ra kết quả nhiệt độ lý tưởng để 12