Tài liệu Khảo sát và phân tích mức độ methyl hóa tại vùng promoter của gen dnmt3l trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT VÀ PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI VÙNG PROMOTER CỦA GEN DNMT3L TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG Mã số: Chủ nhiệm đề tài: ThS. LÊ THỊ TRÚC LINH TP. HCM, Tháng 12/ 2012 MỤC LỤC Trang DANH MỤC HÌNH ẢNH iii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU v INFORMATION ON RESEARCH RESULTS vii PHẦN I: TỔNG QUAN 1 I. TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS VÀ SỰ METHYL HOÁ DNA I.1. Định nghĩa sự methyl hóa DNA I.2. Enzyme xúc tác I.3. Sự methyl hoá DNA trong ung thư II. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA DNA III. 1 1 2 3 4 II.1. Phương pháp MSP 4 II.1.1. Nguyên tắc MSP II.1.2. Xử lý DNA bằng sodium bisulfite II.1.3. Đọc kết quả phản ứng MSP II.2. Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR) II.3. Phương pháp Q-MSP (Quantitative-MSP) Mục tiêu của nghiên cứu 4 5 5 6 6 7 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 9 II.1. VẬT LIỆU 9 II.2. PHƯƠNG PHÁP 9 II.2.1. Khai thác dữ liệu III.2.2. Khảo sát in silico II.2.3. Thực nghiệm II.2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA bằng phenol/chloroform II.2.3.2. Xác định nồng độ DNA II.2.3.3. Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng Epitect bisulfite kit 9 9 10 10 11 11 i II.2.3.4. Phương pháp BSP trên DNA chứng và trên mẫu bệnh phẩm 12 II..2.3.5. Phương pháp điện di trên gel agarose 13 II.2.3.6. Giải trình tự sản phẩm BSP và hiệu chỉnh trình tự sau giải 14 PHẦN III: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 15 III.1. Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico III.1.1. DNMT3A (DNA 5-Cytosine Methyltransferase 3a) III.1.2. Gen DNMT3B (DNA 5-Cytosine Methyltransferase 3B) III.1.3. Gen DNMT3L 15 16 19 20 III.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 24 III.2.1. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm Q-MSP sử dụng DNA chứng III.2.2. Thực hiện phản ứng BSP sử dụng DNA bệnh phẩm III.2.3. Thực hiện giải trình tự sản phẩm BSP 24 24 27 PHẦN IV: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 32 IV.1. KẾT LUẬN IV.2.ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 32 32 ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình I.1: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp nucleotide CpGtrong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT) 1 Hình I.2: Sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen 2 Hình I.3: Phương pháp MSP 5 Hình I.4: Sự chuyển từ Cytosine thành Uracil trong sodium bisulfite 5 Hình I.5: Đọc kết quả MSP 6 Hình III.1. Gen DNMT3A 19 Hình III.2. Gen DNMT3B 20 Hình III.3. Gen DNMT3L 23 Hình III.4: Kết quả phân tích phản ứng QMSP và điện di trên gel agarose sản phẩm QMSP từ cặp mồi DNMT3L 24 Hình III.5: Kết quả điện di sản phẩm BSP (3μl) từ cặp mồi DNMT3L thực hiện trên DNA bệnh phẩm. LAD thang chuẩn 100 bp 25 Hình III.7: Kết quả điện di sản phẩm BSP (3μl) trên hai mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (31, 545) 26 Hình III.8: Kết quả điện di sản phẩm BSP (3μl) trên ha mẫu bệnh phẩm sinh thiết mô M1 và M2 26 Hình III.9: Kết quả điện di sản phẩm BSP (3μl) trên 8 mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào (1-8), 9 26 Hình III.10A. Kết quả xác định kiểu gen bằng PCR reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm số 545 27 Hình III.10B. Kết quả xác định kiểu gen bằng PCR reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm số 31 27 Hình III.10C. Kết quả xác định kiểu gen bằng PCR reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm số M1 27 Hình III.10D. Kết quả xác định kiểu gen bằng PCR reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm số M2 27 Hình III.11. Kết quả giải trình tự sản phẩm BSP mẫu số 1 28 Hình III.12. Gen DNMT3L 31 iii DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng II.1: Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite DNA sử dụng EpiTect bisulfite Kit Bảng II.2: Thành phần của phản ứng BSP Bảng II.3: Chu kì nhiệt của phản ứng BSP Bảng III.1. Các bộ mồi sử dụng trong các thực nghiệm có liên quan đến họ gia đình gen DNMTs đã được công bố Bảng III.1. Các thông số vật lý của cặp mồi DNMT3L-SF và SR Bảng III.2. Kết quả Pap’smear, PCR reverse dot blot và real-time PCR trên các mẫu khảo sát 11 13 13 17 23 28 iv Mẫu NCKH-09. Thông tin kết quả nghiên cứu BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc __________________ _________________ THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: KHẢO SÁT VÀ PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI VÙNG PROMOTER CỦA GEN DMNT3L TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Trúc Linh - Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Mở TP.HCM - Thời gian thực hiện: (12 tháng) 2. Mục tiêu: − Xác định đảo CpG thuộc vùng promoter và dự đoán các vị trí CpG bị methyl quan trọng có khả năng làm thay đổi chức năng của gen ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của ung thư cổ tử cung. − Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng MSP và bisulfite sequencing trên gen DNMT3L. − Xác định các vị trí bị methyl hóa thường xuyên và phân tích tình trạng methyl hóa tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen DNMT3L trên một số mẫu chứng và mẫu bệnh ung thư cổ tử cung từ những bệnh nhân tại các bệnh viện miền Nam Việt Nam. 3. Tính mới và sáng tạo: − Xây dựng DNA methylation profile ở vùng promoter trên gen DNMT3L ở người Việt Nam bị ung thư cổ tử cung. 4. Kết quả nghiên cứu: − Qua khai thác dữ liệu, gen DNMT3L là một gen ứng viên được lựa chọn thuộc họ gen DNMTs mà hoạt động bất thường của gen này rất có thể có liên quan đến bệnh ung thư. v − Chúng tôi lựa chọn phương pháp phù hợp nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm khảo sát mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG cần thiết trên gen này là Bisulfite sequencing PCR (BSP). − Đã thiết kế và đánh giá cặp mồi cho phản ứng BSP: cặp mồi này cho phép phát hiện tính chất methyl hóa tại 11 vị trí CpG quan trọng thuộc vùng promoter của gen DNMT3L. − Thực nghiệm tiến hành tổng thể (từ tách chiết, biến đổi bisulfite DNA, BSP, giải trình tự) trên 8 mẫu trong đó có 4 mẫu bệnh phẩm (gồm 2 mẫu dịch phết tế bào âm đạo và 2 mẫu sinh thiết mô từ các bệnh nhân ung thư cổ tử cung) và 4 mẫu dịch phết tế bào người lành cho kết quả bước đầu: tính chất giải methyl hóa (hypomethylation) rất có khả năng là một điểm đặc trưng của các tế bào ung thư. 5. Sản phẩm: − Bộ dữ liệu về tình trạng methyl hóa của các đảo CpG thuộc vùng promoter trên gen DNMT3L. − Qui trình khảo sát mức độ methyl hóa của các đảo CpG thuộc vùng promoter trên DNMT3L. − Bài báo đăng trên tạp chí chuyên ngành. 6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: Công trình nghiên cứu này có ý nghĩa thiết thực, cần thiết trong chuẩn đoán bệnh, dự báo tiến triển của bệnh và liệu pháp điều trị trong hướng nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để tìm hiểu về các phân tử biomarker cho bệnh ung thư cổ tử cung. Cơ quan chủ trì xác nhận Ngày tháng năm KT. HIỆU TRƯỞNG Chủ nhiệm đề tài PHÓ HIỆU TRƯỞNG (Ký, Họ và tên) vi Mẫu NCKH-10. Thông tin kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information: Project title: Study and analysis identifies frequency of DMNT3L promoter methylation in cervical cancer patients. Code number: Coordinator: Lê Thị Trúc Linh Implementing institution: University, Ho Chi Minh City. Department Biology Technology- Open Duration: 12 months 2. Objective(s): - - To determine CpG islands within the promoter of DNMT3L gene and predict methylation of CpG sites which able to change function of gene and may affect the formation and development of cervical cancer. Design primers for Methylation-Specific PCR (MSP) and BisulfiteSequencing PCR (BSP) of DNMT3L gene. To determine methylation frequencies of CpG sites and analyze status of methylation of CpG islands within the promoter of DNMT3L gene in positive samples and samples of cervical cancer patients from hospital in South Vietnam. 3. Creativeness and innovativeness: - - To establish DNA methylation profile for the promoter of DNMT3L gene of cervical cancer patients in VietNam. 4. Research results: By data mining, we identified DNMT3L gene is a candidate gene of the family of DNMT genes and extraordinary activities of this gene may relate to cancer . We use Bisulfite sequencing PCR (BSP), which is an appropriate method to the condition of the laboratory, to study the methylation frequency of CpG sites in DNMT3L gene. vii - - To design and evaluate primers for Bisulfite-Sequencing PCR (BSP) of DNMT3L gene that may detect methylated properties of CpG important sites the promoter of DNMT3L gene. The experimental process (DNA extraction, bisulfite treatment of DNA, BSP, DNA sequence) were implemented of 8 samples which are 4 specimens (2 vaginal specimens, 2 tissue biopsy sampling of cervical cancer patients) and 4 vaginal specimens of healthy person. From the initial results, it can be show n that hypomethylation is a feature of cancer cells. 5. Products: − The data set for the status of methylation status of methylation of CpG islands within the promoter of DNMT3L gene. − The process surveys methylation frequencies of CpG islands within the promoter of DNMT3L gene. − A article has published in the scientific journal. 6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability: This study is significant that is the fundamental of diagnostic and prediction about the progression of disease and therapy for the most promising methylation marker candidates for cervical cancer by application techniques of molecular biology. viii Thành viên đề tài 1/ThS. Trương Kim Phượng ĐẶT VẤN ĐỀ Sự methyl hóa - là một biến đổi cộng hóa trị dẫn đến sự bổ sung nhóm -CH3 vào vị trí cacbon số 5 của Cytosine trong cặp nucleotide CpG nhờ sự xúc tác của hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs), là biến đổi epigenetics chính trong bộ gen động vật có vú (Laird,2003). Nhóm enzym này được mã hóa bởi họ gen DNA (cytosine-5-)methyltransferase. Các sản phẩm của họ gen này chịu trách nhiệm phần lớn trong tình trạng methyl hóa DNA của các tế bào. Trong những năm gần đây, hiện tượng này đang được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm theo khuynh hướng sử dụng chúng như dấu chứng sinh học (biomarker) và thực tế cho thấy đã chứng minh cho thấy có sự methyl hóa bất thường trên một số gen đè nén khối u và gen gây ung thư dưới xúc tác của họ enzyme DNA methyltransferase có liên quan chặt chẽ với ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng (Hirst M and Marra MA, 2008; Brooks JP and Zeleniuch JA, 2009; Duenas-Gonzalez A et al, 2005).Vì vậy, những biến đổi bất thường trên họ gen DNMTs như sự bất hoạt hay hoạt hóa bất thường trên gen DNMTs sẽ gây nên sự giảm biểu hiện hay sự biểu hiện quá mức của các protein DNMTs, điều này có thể là nguyên nhân dẫn đến tình trạng methyl hóa bất thường của tế bào. Không như những nghiên cứu trước đây của nhóm chúng tôi về hướng epigenetics này; tức là chúng tôi đã và đang tập trung tìm hiểu sự methyl hóa xảy ra như thế nào trên một số gen - chủ yếu là gen ức chế khối u ở các bệnh nhân ung thư cổ tử cung, ung thư vú với định hướng sử dụng chùm thông tin về tính chất methyl hóa bất thường của các gen này như một dấu chứng sinh học đặc trưng cho người bệnh Việt Nam; nghiên cứu này sẽ tiếp cận tính chất methyl hóa bằng việc tìm hiểu ngay trên gen chịu trách nhiệm xúc tác cho quá trình methyl hóa. Trong số 6 gen đã được công bố cho đến nay thuộc gia đình gen mã hóa cho enzyme DNA methyltransferase ở Eukaryote bao gồm DNMT1, DNMT2, DNMT3 (DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L) (Bestor TH, 2000; Colot V et al, 1999; Nakayama T et al, 2001), những gen nào hoạt động bình thường hay bất thường của nó là thực sự có liên quan đến bệnh lý ung thư. Nghiên cứu vì vậy sẽ được bắt đầu bằng việc khai thác dữ liệu nhằm rút ra cơ sở khoa học cho thực nghiệm sau này. Các nội dung chính mà đề tài nghiên cứu khoa học: “KHẢO SÁT VÀ PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ METHYL 1 HÓA TẠI VÙNG PROMOTER CỦA GEN DNMT3L TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG” sẽ tập trung bao gồm: 1) Khai thác dữ liệu, lựa chọn gen (các gen) thuộc gia đình DNMTs mà hoạt động (có thể bình thường hoặc bất thường) của nó có liên quan đến bệnh (ung thư) 2) Lựa chọn phương pháp khảo sát tính chất methyl hóa của gen (các gen) nói trên trong thực nghiệm: điều này hoàn toàn phụ thuộc vào tính chất di truyền phân tử của gen sẽ được khảo sát. 3) Khảo sát & phân tích tính chất methyl hóa của gen (các gen) này trên một số mẫu bệnh phẩm: kế thừa kết quả nghiên cứu trước của nhóm, chúng tôi sẽ chọn một số mẫu đã biết trước có methyl hóa trên một số gen ức chế khối u. Và bởi vì giới hạn của nguồn kinh phí eo hẹp từ đề tài NCKH cấp trường, đề tài sẽ chỉ bước đầu tiến hành thực nghiệm trên một số mẫu bệnh phẩm hạn chế. 2 PHẦN I: TỔNG QUAN I. 1. TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS VÀ SỰ METHYL HOÁ DNA Epigenetics có thể được định nghĩa là những biến đổi di truyền trong sự biểu hiện kiểu gen nhưng không đi kèm với những biến đổi trong trình tự DNA (Bestor TH, 2000). Trong những năm gần đây, hiện tượng epigenetic đang được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm theo khuynh hướng sử dụng chúng như dấu chứng sinh học (biomarker) và thực tế cho thấy có một sự liên quan hết sức chặt chẽ giữa hiện tượng epigenetic với nhiều loại ung thư. Một trong những kiểu epigenetic được chứng minh có tiềm năng trở thành dấu chứng sinh học cao, đó là sự bất hoạt của các gen đè nén u (tumour suppressor gene) bằng cơ chế methyl hoá quá mức ở các nucleotide cytosine hiện diện trong đảo CpG, và sự methyl hoá quá mức này thường được ghi nhận tại vùng promoter hay kéo dài qua đến exon thứ nhất của các gen nói trên. I.1. 1. Định nghĩa sự methyl hóa DNA Sự methyl hóa DNA là một biến đổi cộng hóa trị dẫn đến sự bổ sung nhóm -CH 3 vào vị trí carbone số 5 của Cytosine trong cặp nucleotide CpG nhờ sự xúc tác của hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs), enzyme này thúc đẩy phản ứng chuyển nhóm -CH 3 từ S-adenosylmethionine (SAM) đến Cytosine (Hình I.1). Sự methyl hóa này là biến đổi epigenetics chính trong bộ gen động vật có vú. Khoảng 70% các cặp nucleotide CpG trong bộ gen của động vật có vú đều bị methyl hóa (Laird WP, 2003). Cytosine 5 – Methylcytosine Hình I.1: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp nucleotide CpG trong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT) 3 I.1. 2. Enzyme xúc tác Quá trình methyl hóa DNA được thực hiện bởi một nhóm enzyme DNMTs (Hình I.2) đã được biết đến như DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b và DNMT3L (Das PM and Singal R, 2004). Trong đó, giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành sự methyl hóa de novo và duy trì sự methyl hóa này là nhờ 3 enzyme DNMT1, DNMT3a, DNMT3b. DNMT3a và DNMT3b là các de novo DNA methyltransferase có nhiệm vụ thiết lập DNA methyl hóa đầu tiên bằng cách gắn những gốc methyl mới vào Cytosine trong cặp CpG mà trước đó không bị methyl hóa, DNMT1 là methyltransferase có nhiệm vụ duy trì gốc methyl ở những vị trí Cystosine trên sợi đơn DNA vừa được tổng hợp trong quá trình tái bản DNA. Do đó sự methyl hóa DNA được di truyền cho các thế hệ tế bào tiếp theo nhờ vào cơ chế methyl hóa DNA mạch khuôn (Gozuacik D and Kimchi A, 2006). Các enzyme này cũng góp phần vào sự methyl hóa bất thường và dẫn đến sự phát triển của ung thư. Sự biểu hiện quá mức của gen DNMTs ở mức độ mRNA đã được nhận thấy ở một vài bệnh ung thư, và sự biểu hiện của DNMT1 tăng trong tế bào bình thường thì có thể gây nên sự methyl hóa de novo bất thường ở đảo CpG. Mức độ biểu hiện của các mRNA của DNMTs là khác nhau trong suốt chu trình tế bào, và sự biểu hiện DNMTs không phù hợp có thể góp phần thay đổi sự methyl hóa trong các tế bào ung thư (Narayan G et al, 2003). Hình I.2: Sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen Sự methyl hóa quá mức đảo CpG ở vùng promoter của gen gây ức chế quá trình phiên mã của gen, làm cho gen im lặng dẫn đến sự phát sinh ung thư 4 I.1. 3. Sự methyl hoá DNA trong ung thư Sự methyl hóa có một vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các quá trình của tế bào như: sự phát triển phôi thai, sự phiên mã, ức chế nhiễm sắc thể X (X chromosomes inactivation), và “in dấu bộ gen” (genome imprinting) (Hirst M and Marra MA, 2008). Tuy nhiên khi sự methyl hóa diễn ra bất thường trên các cặp nucleotide CpG thuộc vùng promoter của gen đè nén u hay các gen liên quan đến khối u sẽ gây ra những biến đổi có thể dẫn tới ung thư vì nó gây ra hiện tượng giảm hoạt tính phiên mã các gen này. Trong một số bệnh ung thư đang được chú ý gần đây thì người ta nhận thấy luôn có một số lượng lớn các gen đã bị methyl hóa quá mức trên đảo CpG ở vùng promoter của gen đó (Nephew PK and Huang TH, 2002). Điều này củng cố hơn về vai trò của sự methyl hóa quá mức đảo CpG trong phát sinh ung thư, và là một biểu hiện sớm trong sự phát triển tế bào ung thư. Do đó sự methyl hóa DNA có thể được sử dụng như một dấu chứng sinh học phân tử hữu ích để tiên đoán ung thư (Nephew PK and Huang TH, 2002). Đảo CpG là những vùng thuộc gen có chứa nhiều cặp nucleotide CpG. Trong bộ gen động vật có vú, đảo CpG có ít nhất khoảng 200bp và có tỷ lệ CpG lớn hơn 50%. Đảo CpG thường không bị methyl hóa trong tế bào bình thường và được phân bố ở gần đầu 5’ của gen (Larid WP, 2003). Khoảng một nửa tất cả các gen của người đều chứa đảo CpG (DasPM and Singal R, 2002) và gần đây người ta đã ước tính bộ gen người chứa khoảng 29.000 đảo CpG (Nephew PK and Huang TH, 2002). Cặp nucleotide CpG phân bố ngẫu nhiên trong bộ gen nhưng đảo CpG thường nằm trong những vùng nhỏ riêng biệt của gen và khoảng 40% đảo CpG nằm trong và gần vùng promoter. Sự methyl hóa quá mức trên đảo CpG là một hiện tượng chung trong ung thư. Sự kìm hãm quá trình phiên mã của gen đè nén khối u bởi hiện tượng methyl hóa quá mức trên đảo CpG ở vùng promoter của gen có thể sẽ góp phần đến sự phát sinh ung thư (Larid WP, 2003). Hai nhóm gen chính mà khi bị đột biến trực tiếp có liên quan đến sự phát sinh các tế bào ung thư là các gen ung thư (oncogene) và gen đè nén khối u. Trong đó gen đè nén khối u có vai trò kiểm soát sự phân chia tế bào và hạn chế tối đa các đột biến hay tổn thương có thể truyền cho thế hệ tế bào kế tiếp. Do đó khi hiện tượng methyl hóa xảy ra quá mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter của gen đè nén khối u sẽ làm giảm sự biểu hiện của gen bằng cách ngăn chặn trực tiếp sự liên kết với các yếu tố phiên mã hoặc chỉ đạo gen liên kết với các protein kìm hãm. Từ đó sẽ làm bất hoạt hay làm im lặng gen này, 5 dẫn tới tế bào sẽ phân chia liên tục và những tổn thương được tích lũy lại dần dần hình thành ung thư (Hình I. 2). I. 2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA DNA Sự methyl hóa bất thường của các đảo CpG đã liên quan chặt chẽ với sự bất hoạt phiên mã của những gen ức chế khối u nhất định trong các bệnh ung thư ở người. Ngày nay, hàng trăm đảo CpG đã được biết đến để hiển thị những đặc trưng của sự methyl hóa quá mức trong các tế bào khối u. Vì vậy, việc lập bản đồ mô hình methyl hóa tại các đảo CpG đã trở nên quan trọng cho việc tìm hiểu những biểu hiện của gen trong cả các trường hợp bình thường và bệnh lý. Mức độ methyl hóa của gen có thể được phân tích dễ dàng bằng phương pháp MSP (Methylation Specific PCR) và một số phương pháp khác đi từ MSP như MSP-kết hợp giải trình tự (Bisulfite Sequencing PCR-BSP), MSP định lượng (Quantitative MSP) hay MSP-kết hợp sử dụng enzyme cắt hạn chế (MSP Combined Bisulfite Restriction AnalysisCOBRA). I.2.1. Phương pháp MSP I.2.1.1. Nguyên tắc MSP MSP (methylation-specific PCR) thực chất là phản ứng PCR. MSP là một kĩ thuật sử dụng để nghiên cứu tình trạng methyl hóa của đảo CpG, phổ biển ở vùng promoter của các gen. MSP có thể đánh giá nhanh tình trạng methyl hóa của hầu như bất kì vị trí CpG thuộc đảo CpG (Herman HG et al, 1996). MSP khác với phản ứng PCR ở chỗ mạch khuôn DNA được xử lý sodium bisulfite, và khuếch đại với các cặp mồi methyl và không methyl, dựa vào kết quả có thể phân biệt DNA có methyl hóa hay không (Hình I.3). Mồi cho phản ứng MSP được thiết kế sao cho có nhiều cytosine và vị trí cặp CpG ở gần đầu 3’ của mồi (Herman HG et al, 1996). 6 Hình I.3: Phương pháp MSP I.2.1.2. Xử lý DNA bằng sodium bisulfite Phản ứng xử lý sodium bisulfite được sử dụng để phân biệt cytosines và cyosines methyl hóa (5mC) trong DNA. Phản ứng xử lý DNA với sodium bisulfite để chuyển đổi tất cả cytosine không bị methyl hóa thành uracil, trong khi đó 5mC không phản ứng (Hình I.4). Như vậy, xử lý bisulfite cho biết sự thay đổi đặc biệt trên trình tự DNA, nó phụ thuộc vào tình trạng methyl hóa của các cytosine đơn lẻ còn lại, thông tin của các cytosine này quyết định tình trạng methyl hóa chung cho từng đoạn gen (Herman HG et al, 1996). Hình I.4: Sự chuyển từ Cytosine thành Uracil trong sodium bisulfite I.2.1.3. Đọc kết quả phản ứng MSP Ví dụ về cách đọc kết quả phản ứng MSP được mô tả trong hình I.5 như sau: 7 Hình I.5: Đọc kết quả MSP  Mẫu A: Kết quả điện di có hai vạch. Như vậy, các cặp mồi methylation và unmethylation đều đều bắt cặp đặc hiệu trong phản ứng MSP. Trường hợp này kết luận các đảo CpG khảo sát bị methyl hóa không hoàn toàn.  Mẫu B: Kết quả điện di chỉ có cặp mồi unmethylation cho kết quả. Trường hợp này kết luận các đảo CpG khảo sát không bị methyl hóa.  Mẫu C: Kết quả điện di có một vạch cho cặp mồi methylation. Kết luận mẫu này bị methyl hóa hoàn toàn. I.2.2. Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR) Đối với phương pháp BSP, đầu tiên DNA cũng phải được biến đổi bisulfite để chuyển đổi tất cả Cytosine thành Uracil ngoại trừ các Cytosine đã bị methyl hóa, sau đó PCR được thực hiện để tiến hành khuếch đại DNA đã biến đổi bisulfite (Li LC and Dahiya R, 2002). Trong phương pháp này một cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuếch đại vùng gen khảo sát, đặc điểm quan trọng trong việc thiết kế cặp mồi này là không chứa bất kì vị trí CpG nào trên trình tự của chúng để có thể khuếch đại cả allele methyl và allele unmethyl trên DNA đã biến đổi bisulfite (Li LC and Dahiya R, 2002). Phương pháp BSP có ưu điểm là có thể phát hiện được tình trạng methyl hóa của nhiều vị trí CpG nằm trong vùng khảo sát. I.2.3. Phương pháp Q-MSP (Quantitative-MSP) Phương pháp QMSP là phương pháp kết hợp giữa kỹ thuật Real-time PCR và phương pháp MSP. Phương pháp QMSP có thể dùng để phát hiện và định lượng chính xác các allele bị methyl hóa. Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phản ứng QMSP dựa trên cơ sở phản ứng MSP sử dụng chất phát huỳnh quang là Sybergreen đối với các mẫu DNA chứng của hãng Qiagen. Sybergreen là một loại màu huỳnh quang có ái lực rất cao khi có sự hiện 8 diện của DNA sợi đôi nhờ vào khả năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích trong máy real-time PCR. Phương pháp QMSP có ưu điểm hơn so với phương pháp MSP là có thể dùng để định lượng tương đối sự methyl hóa ở mức độ thấp trong các mẫu mô bình thường (Gustafson KS, 2008) nhờ vào tín hiệu huỳnh quang có thể được phát hiện ở cường độ rất thấp. 9 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP II.1. VẬT LIỆU Mẫu DNA chứng được cung cấp bởi hãng Qiagen bao gồm hai nguồn DNA người: 1/ DNA đã bị methyl hóa và 2/ DNA chưa bị methyl hóa. Sử dụng nguồn DNA chứng này sẽ giúp chúng tôi đánh giá được độ đặc hiệu của cặp mồi trong phản ứng BSP. Các mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào âm đạo đã được chẩn đoán nhiễm Human papillomavirus type độc (mẫu số 31: nhiễm type 16, mẫu số 545 nhiễm type 18), các mẫu sinh thiết mô được phẫu thuật cắt bỏ từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung (mẫu số M1 và M2) mà chúng tôi sử dụng để phân tích lần lượt được cung cấp từ phòng khám Âu lạc, công ty CP Công nghệ Việt Á và BV. Hùng Vương TP. HCM. Đồng thời cũng qua sự giúp đỡ của phòng khám Âu lạc, chúng tôi thu nhận được 8 mẫu dịch phết tế bào khác được cho là “bình thường“ (bởi chúng được thu nhận từ những người đến khám phụ khoa với kết quả pap‘ smear bình thường và hoàn toàn không nhiễm HPV). Các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -300C trước khi tiến hành tách chiết DNA. II.2. PHƯƠNG PHÁP II.2.1. Khai thác dữ liệu Chúng tôi sử dụng cở sở dữ liệu của NCBI để xác định số lượng tài liệu hiện có khảo sát trên đối tượng nghiên cứu – họ enzyme DNA methyltransferase và vai trò của họ enzyme này trong quá trình hình thành và biến đổi tình trạng methyl hóa của DNA bộ gen. Các công trình nghiên cứu có thực nghiệm khảo sát mức độ methyl hóa của họ gen này cũng như mối tương quan giữa mức độ methyl hóa này với các loại bệnh ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng sẽ được tập trung phân tích. III.2.2. Khảo sát in silico Vùng trình tự khảo sát trong các công trình nghiên cứu được lấy dựa vào các mã số truy cập (Accession number) trên cơ sở dữ liệu NCBI, được đánh giá dựa trên các tiêu chí: (1) thuộc vùng trình tự điều hòa của gen (vùng promoter); (2) thuộc đảo CpG (sử dụng chương trình trực tuyến Methprimer (www.urogen.org); (3) tính methyl hóa của vùng DNA được lựa chọn có khả năng đại diện cho cả đảo CpG về mức độ methyl hóa (sử dụng 10