Tài liệu Khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng isoniazid và đánh giá ảnh hưởng của gen nat2 của bệnh nhân lao đến tính kháng thuốc isoniazid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------- Nguyễn Thị Thu Hà KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NAT2 CỦA BỆNH NHÂN LAO ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------- Nguyễn Thị Thu Hà KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN LAO ĐIỀU TRỊ BẰNG ISONIAZID VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA GEN NAT2 CỦA BỆNH NHÂN LAO ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Vũ Thị Thơm TS. Phạm Thế Hải Hà Nội, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên Nguyễn Thị Thu Hà LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ của các Thầy Cô, nhà trường, cơ quan, gia đình và bạn bè. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS. Vũ Thị Thơm, TS. Phạm Thế Hải là những người Thầy đã tận tình hướng dẫn khoa học, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Thị Luyến - chủ nhiệm đề tài, ThS. Lê Anh Tuấn - nghiên cứu sinh của đề tài Nghị định thư hợp tác nghiên cứu giữa Đại học Quốc gia Hà Nội và Đại học Liverpool - Vương quốc Anh (Mã số HNQT/SPĐP/01.06), đã tạo điều kiện để tôi được tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các nhà khoa học trong hội đồng chấm đề cương và luận văn tốt nghiệp đã đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn. Tôi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo sau đại học, các Thầy Cô Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập, nghiên cứu tại trường. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Các cán bộ Bộ môn Y Dược học cơ sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội; các bác sĩ và nhân viên Bệnh viện Phổi Trung ương đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Sự biết ơn đối với gia đình và bạn bè đã luôn sát cánh động viên và khích lệ tôi. Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhóm nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi có thành công này. Hà Nội, ngày tháng Nguyễn Thị Thu Hà năm MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................3 1.1. Giới thiệu về vi khuẩn lao..............................................................................3 1.1.1. Hình thể, cấu trúc ......................................................................................3 1.1.2. Khả năng gây bệnh ....................................................................................4 1.1.3. Nuôi cấy vi khuẩn lao................................................................................5 1.2. Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc ..........................................................6 1.2.1. Thuốc điều trị lao và phân loại lao kháng thuốc .......................................6 1.2.2. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao ...........................................................7 1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tính kháng thuốc của vi khuẩn lao..............................................................................................................9 1.3. Isoniazid trong điều trị lao ..........................................................................10 1.3.1. Dược lý và chuyển hóa của Isoniazid .....................................................10 1.3.2. Gen liên quan đến chuyển hóa Isoniazid ở bệnh nhân lao ......................12 1.4. Đặc điểm của gen NAT2 và đa hình gen NAT2 .........................................13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................16 2.1. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................16 2.1.1. Dụng cụ, trang thiết bị .............................................................................16 2.1.2. Hóa chất, môi trường...............................................................................16 2.2. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................17 2.2.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu .............................................17 2.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ ..................................................................................17 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................17 2.3.1. Cỡ mẫu ....................................................................................................17 2.3.2. Thu thập mẫu bệnh phẩm ........................................................................18 2.3.3. Quy trình nuôi cấy đờm trên môi trường lỏng BACTEC MGIT ............18 2.3.4. Phương pháp kháng sinh đồ cho 5 thuốc chống lao hàng một................20 2.3.5. Phân tích kiểu gen NAT2 để xác định kiểu hình acetyl hóa isoniazid....26 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................27 2.3.7. Đạo đức nghiên cứu y học .......................................................................28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................29 3.1. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao đối với thuốc kháng lao hàng một ...29 3.1.1. Đặc điểm chung của quần thể bệnh nhân nghiên cứu .............................29 3.1.2. Tình hình kháng thuốc chống lao hàng 1 ở các bệnh nhân lao phổi .......32 3.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao và mối ảnh hưởng đến tính kháng thuốc Isoniazid ..............................................................................40 3.2.1. Kết quả tối ưu quy trình phân tích NAT2 ...............................................40 3.2.2. Tỷ lệ phân bố các kiểu gen NAT2 trên người bệnh lao ..........................42 3.2.3. Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen NAT2 và tình hình kháng INH ....47 KẾT LUẬN ..............................................................................................................50 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Nhận định kết quả nuôi cấy MGIT ...........................................................19 Bảng 2.2: Nồng độ thuốc và ngưỡng kháng thuốc kháng lao hàng 1 trên môi trường đặc ...................................................................................................22 Bảng 2.3: Hướng dẫn pha dung dịch thuốc (1) .........................................................23 Bảng 2.4: Đánh giá kết quả vi khuẩn mọc dựa vào khuẩn lạc ..................................25 Bảng 2.5: Đánh giá tính kháng thuốc của vi khuẩn lao ............................................25 Bảng 2.6: Thành phần tối ưu cho phản ứng nhân dòng gen NAT2 ...........................27 Bảng 3.1: Thông tin chung của quần thể nghiên cứu................................................29 Bảng 3.2: Thời gian nuôi cấy và đơn vị sinh trưởng của vi khuẩn lao .....................32 Bảng 3.3: Tỷ lệ kháng thuốc ở nhóm lao mới và lao tái trị ......................................34 Bảng 3.4: Kết quả kháng sinh đồ với từng thuốc chống lao hàng một .....................36 Bảng 3.5: Tần số phân bố allen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị ........................43 Bảng 3.6: Tần số phân bố kiểu gen NAT2 ở nhóm lao mới và lao tái trị ..................44 Bảng 3.7: Mối liên quan giữa kiểu hình chuyển hóa với thể lao ..............................45 Bảng 3.8: Tần số kiểu hình acetyl hóa NAT2 ở các vùng trên thế giới .....................46 Bảng 3.9: Mối liên quan kiểu hình chuyển hóa với tính kháng INH ........................48 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: M. tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x .......................3 Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis nuôi cấy trên môi trường đặc [23], [59] .............5 Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao .........................................................9 Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid ở gan [39]. .............................................................11 Hình 1.5: Vị trí gen NAT2 trên NST số 8..................................................................14 Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu và luân chuyển mẫu tại 3 bệnh viện .................................18 Hình 2.2: Hệ thống BACTEC MGIT 960 .................................................................19 Hình 2.3: Kháng sinh đồ PZA ...................................................................................21 Hình 2.4: Chuẩn bị huyền dịch làm kháng sinh đồ đặc ............................................24 Hình 3.1: Biểu đồ dinh dưỡng theo BMI của hai nhóm bệnh nhân ..........................31 Hình 3.2: Một số hình ảnh kết quả kháng sinh đồ trên môi trường đặc ...................33 Hình 3.3: Biểu đồ tỷ lệ số thuốc kháng mỗi loại.......................................................34 Hình 3.4: Kết quả DNA tổng số tách chiết điện di trên gel agarose 1,2% ...............41 Hình 3.5: Kết quả nhân dòng gen NAT2 của một số mẫu theo điều kiện tối ưu ......41 Hình 3.6: Kết quả đọc kiểu gen NAT2 ......................................................................42 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AFB Vi khuẩn kháng cồn kháng axit (Acid Fast Bacilli) BMI Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index) EMB Ethambutol INH Isoniazid LJ Lowenstein-Jensen MTB Vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) MDR-TB Lao đa kháng thuốc (Multi Drug Resistant Tuberculosis) MDR/RR-TB Lao đa kháng hoặc Lao kháng Rifampicin (Multi Drug Resistant - Rifampicin Resistant - Tuberculosis) MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube NAT2 N-Acetyltransferase 2 RMP Rifampicin PZA Pyrazinamid SM Streptomycin SNP Đa hình đơn nucleotit (Single Nucleotide polymorphisms) XDR-TB Lao siêu kháng thuốc (Extensively Drug Resistant-Tuberculosis) WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization) Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm có tính lây nhiễm cao, diễn biến lâm sàng phức tạp và thời gian điều trị kéo dài. Theo thống kê của WHO (2018), với sự nỗ lực không ngừng của toàn thế giới, từ năm 2000 đến 2018 ước tính có khoảng 53 triệu người đã được phát hiện và điều trị lao giúp giảm tỷ lệ tử vong do lao xuống còn 37%. Mặc dù đã được tập trung kiểm soát, bệnh lao vẫn là một trong 10 nguyên nhân tử vong hàng đầu và là nguyên nhân tử vong số 1 do bệnh truyền nhiễm (trên cả HIV). Việt Nam là một trong những điểm nóng của bệnh lao, đứng thứ 14 trong số 30 nước có gánh nặng cao do lao (WHO, 2018). Năm 2017, tổng số trường hợp mắc lao được báo cáo ở Việt Nam là 105.733 bệnh nhân trong số đó có khoảng 80% là bệnh nhân lao phổi mới mắc và tái nhiễm. Mặc dù trên toàn thế giới, tỷ lệ mắc lao đang giảm đi khoảng 2% mỗi năm nhưng đến nay bệnh lao vẫn còn là vấn đề thách thức do sự phát triển và lan rộng của lao kháng thuốc. Bệnh nhân mang lao kháng thuốc thường có thời gian điều trị kéo dài, tốn kém. Ở Việt Nam theo ước tính trung bình chi phí cho một bệnh nhân lao đa kháng thuốc khoảng gần 400 USD cao hơn nhiều so với chi phí hơn 150 USD cho bệnh nhân lao thông thường. Theo thống kê mới nhất của WHO, trên toàn cầu 3,5% trường hợp lao mới và 18% trường hợp lao tái trị có kháng Rifampicin hoặc đa kháng Rifampicin và Isoniazid (MDR/RR-TB). Ở Việt Nam con số này ước tính tương ứng là 4,1% và 17%. Tuy nhiên đây chỉ là con số ước tính vì chỉ có khoảng 32%-67% được thực hiện đánh giá tính kháng thuốc với Rifampicin (WHO, 2018). Trong các thuốc chống lao hàng một, ngoài Rifampicin và Isoniazid là hai thuốc quan trọng nhất trong các phác đồ điều trị lao còn có Streptomycin, Ethambutol, Pyrazinamid. Trong những năm gần đây, tình hình kháng thuốc với 3 loại thuốc này ít được quan tâm, báo cáo. Việc chỉ tập trung vào hai thuốc quan trọng nhất là Rifampicin và Isoniazid có thể bỏ qua các biến động đáng chú ý về tình hình kháng thuốc của ba thuốc này. Theo hướng dẫn của WHO cũng như của Bộ Y tế, Isoniazid được dùng trong hầu hết các đối tượng bệnh nhân lao theo tuổi, giới, trong các phác đồ điều trị bệnh nhân lao mới, lao tái trị và kể cả điều trị dự phòng lao. Isoniazid được chuyển hóa bởi Khoa Sinh học 1 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà enzyme NAT2 tại gan. Đa hình di truyền gen NAT2 được biết đến có liên quan chặt chẽ tới đáp ứng Isoniazid trên các bệnh nhân mắc lao. Nghiên cứu tại Nam Phi cho thấy mặc dù > 98% bệnh nhân tuân thủ điều trị nhưng tình hình kháng thuốc vẫn xảy ra và một nghiên cứu khác cũng khẳng định kháng thuốc không phải chỉ do không tuân thủ điều trị mà còn do sự khác biệt về dược động học của thuốc giữa các cá thể. Mặt khác một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng yếu tố di truyền của bệnh nhân cũng có thể là một trong những yếu tố nguy cơ đối với việc việc lây nhiễm vi khuẩn lao. Tại Việt Nam, việc chẩn đoán lao kháng thuốc thật sự còn là vấn đề hết sức khó khăn tại các bệnh viện, kể cả những bệnh viện tuyến Trung ương. Chỉ một số lượng nhất định bệnh nhân được chỉ định làm kháng sinh đồ và thời gian này mất khoảng 2-3 tháng mới có kết quả do vi khuẩn lao sinh trưởng tương đối chậm trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay một số các test phân tử được áp dụng để chẩn đoán nhanh lao kháng thuốc là Hain test hay Xpert MTB/RIF. Tuy nhiên, các xét nghiệm này giá thành khá cao và không được chỉ định rộng rãi. Hơn nữa các kit thương mại này mới chỉ đánh giá được lao kháng Rifampicin, Isoniazid chứ chưa đánh giá được với các thuốc khác trong thuốc kháng lao hàng một. Từ thực tiễn chẩn đoán và điều trị lao, với mục tiêu xác định được tính kháng thuốc của các thuốc chống lao hàng một và tiên lượng nguy cơ mắc vi khuẩn lao kháng thuốc Isoniazid liên quan đến yếu tố di truyền gen NAT2 ở bệnh nhân lao phổi, chúng tôi đề xuất đề tài “Khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn lao phân lập từ bệnh nhân lao điều trị bằng Isoniazid và đánh giá ảnh hƣởng của gen NAT2 của bệnh nhân lao đến tính kháng thuốc Isoniazid”. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được tính kháng thuốc của vi khuẩn lao với các thuốc chống lao hàng một trên bệnh nhân lao phổi; Xác định được đa hình di truyền gen NAT2 và mối liên quan tới tính kháng thuốc Isoniazid của vi khuẩn lao ở bệnh nhân lao phổi. Khoa Sinh học 2 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về vi khuẩn lao 1.1.1. Hình thể, cấu trúc Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria, ngành Actinobacteria, bộ Actinomycetales, phân bộ Corynebacterineae, họ Mycobacteriaceae, chi Mycobacterium, gồm hơn 169 loài, đa phần không gây bệnh cho người. Nhóm vi khuẩn gây bệnh lao cho người được gọi là nhóm Mycobacterium tuberculosis complex (MTBc) gồm có các loài chính như Mycobacterium tuberculosis (trực khuẩn lao người), Mycobacterium bovis (trực khuẩn lao bò), Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti. Trong đó quan trọng nhất là loài Mycobacterium tuberculosis[64]. Mycobacterium được gọi là trực khuẩn kháng cồn kháng acid, được Robert Koch phân lập năm 1882, gọi tắt là BK (Bacille de Koch). M. tuberculosis là trực khuẩn thanh mảnh, hơi cong, kích thước 0,5 x 2-6 µm. Chúng không có vỏ, không có lông và không có nha bào. Trong bệnh phẩm chúng thường đứng thành từng đám nối đầu vào nhau. Thành tế bào của M. tuberculosis chỉ chứa một lượng nhỏ peptidoglycan, nhưng chứa nhiều lipid tạo nên tính kháng cồn - kháng acid, và làm cho vi khuẩn lao không nhuộm được bằng phương pháp thông thường mà phải nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen (hình 1.1) [15]. Hình 1.1: M. tuberculosis nhuộm Ziehl - Neelsen, vật kính dầu 100x Khoa Sinh học 3 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà 1.1.2. Khả năng gây bệnh 1.1.2.1. Độc lực và con đường lây truyền Trực khuẩn lao không có ngoại độc tố và nội độc tố. Độc lực của vi khuẩn lao có thể liên quan đến yếu tố sợi và lớp sáp ở vách tế bào. Các chủng lao độc lực có chứa nhiều yếu tố sợi có bản chất hóa học là 6,6’-dimycoly trehalose. Yếu tố sợi này làm vi khuẩn lao gắn với nhau thành bó và khi mất đi sẽ làm giảm độc lực. Vi khuẩn lao có thể sống sót trong đại thực bào sau khi bị thực bào. Vi khuẩn lao phát triển trong đại thực bào, phá vỡ tế bào và xâm nhập đại thực bào khác [15]. Bệnh lao lây chủ yếu qua đường hô hấp. Người bị nhiễm lao do hít phải những giọt đờm (đường kính 1 - 5 μm) có chứa vi khuẩn lao từ bệnh nhân lao ho, hắt hơi vào không khí. Các vi khuẩn khi qua được hàng rào thứ nhất của cơ thể sẽ ở lại phế nang và tiến triển thành viêm phế quản phổi với phần lớn các trường hợp có triệu chứng không rõ ràng. Vi khuẩn cũng có thể lây nhiễm sang thai nhi bằng đường máu qua tĩnh mạch rốn nếu mẹ bị lao cấp tính hoặc qua nước ối khi chuyển dạ nếu mẹ bị lao niêm mạc tử cung, âm đạo. Đôi khi, đường lây khác có thể là đường tiêu hóa khi uống sữa bò bị bệnh do M. bovis. Từ cơ quan bị lao ban đầu, trực khuẩn lao theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác để gây bệnh (lao hạch, lao mang não lao xương). Tuy nhiên, con đường truyền bệnh quan trọng nhất với bệnh lao là đường hô hấp [11], [15]. 1.1.2.2. Cơ chế gây bệnh Bệnh lao là một loại bệnh nhiễm trùng bên trong tế bào và tiến triển mạn tính. Vi khuẩn lao khi xâm nhập vào phế nang sẽ bị các đại thực bào tiêu diệt một phần. Những tế tào không bị đại thực bào tiêu diệt sẽ tiếp tục nhân lên trong đại thực bào và dần thành nang lao. Nếu các nang lao vỡ ra vi khuẩn lao lây nhiễm rộng, sinh sản và bệnh lao xuất hiện. Khi tiếp xúc lần đầu với vi khuẩn lao thì một phản ứng viêm cấp tính nhẹ ở phổi xuất hiện. Sau khi vi khuẩn lao bị thực bào, ở người có đáp ứng miễn dịch tế bào đầy đủ, sau 4 - 6 tuần lymphokin được sản xuất, hoạt hóa đại thực bào giết Khoa Sinh học 4 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà chết vi khuẩn lao. Cơ thể sinh ra đáp ứng quá mẫn muộn với vi khuẩn lao, kết quả là hình thành u hạt. Tiếp theo là hoại tử ở trung tâm, bã đậu hoá, xơ hoá và hình thành sẹo. Sau khi liền tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao vẫn không bị diệt hoàn toàn. Chúng có thể tồn tại mãi trong cơ thể dưới dạng không hoạt động, những người nhiễm lao thường chỉ biểu hiện ở test tuberculin (+) và không có khả năng lây nhiễm. Ở những người này có khoảng 10% vi khuẩn lao tái hoạt động trở thành người mắc lao. Ngoài ra các yếu tố nguy cơ đối với việc mắc lao như: tuổi trẻ, bệnh đi kèm như đái tháo đường, bụi phổi, HIV, phụ nữ có thai, yếu tố cơ địa yếu tố gen [11]. 1.1.3. Nuôi cấy vi khuẩn lao Để chuẩn đoán xác định có nhiều phương pháp cận lâm sàng như nhuộm Ziehl-Neelsen tìm AFB, Xpert MTB/RIF, nuôi cấy…. trong đó xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn lao là tiêu chuẩn vàng. Vi khuẩn lao thuộc loại vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC và dưới áp suất của oxy là 100 mmHg. Đây là một trong những lý do giải thích tại sao lao phổi là thể bệnh gặp nhiều nhất. Vi khuẩn lao không nuôi được ở môi trường thông thường, phải nuôi ở môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng (hình 1.2). a. Khuẩn lạc đƣợc phóng đại b. Khuẩn lạc trên LJ Hình 1.2: Hình ảnh M.tuberculosis nuôi cấy trên môi trƣờng đặc [24], [60] Khoa Sinh học 5 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Vi khuẩn lao mọc rất chậm, thời gian phân chia khoảng 20-24 giờ một lần trên môi trường thử nghiệm. Trên môi trường Lowenstein- Jensen (LJ, gồm chủ yếu khoai tây, lòng đỏ trứng gà, asparagin, glycerin 0,75%), sau 4-6 tuần vi khuẩn lao mới hình thành khuẩn lạc điển hình. Khuẩn lạc dạng R, sần sùi như hình hoa lơ. Trên môi trường lỏng (canh thang Sauton, Middlebbrook 7H9, 7H12) vi khuẩn lao mọc thành váng, đám hoặc lắng cặn. Hiện nay trên môi trường thương mại Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) dạng lỏng nuôi cấy vi khuẩn lao có thể cho kết quả dương tính sau 3-13 ngày[15]. 1.2. Thuốc điều trị lao và lao kháng thuốc 1.2.1. Thuốc điều trị lao và phân loại lao kháng thuốc Hiện nay, trong thực tế điều trị, người ta phân loại 2 nhóm thuốc trị bệnh lao, thường gọi là “thuốc kháng lao hàng 1” và “thuốc kháng lao hàng 2” [18]: Kháng lao hàng 1 gồm: Bao gồm Streptomycin (viết tắt là SM hay S), Rifampicin (viết tắt RIF hay RMP hay R ), Isoniazid (INH hay H), Pyrazinamid (PZA hay Z) và Ethambutol (EMB hay E). Đây là các thuốc được lựa chọn đầu tiên để điều trị cho bệnh nhân bị lao. Kháng lao hàng 2 gồm nhiều thuốc, chia làm 4 nhóm A, B, C, D: Nhóm A gồm các thuốc thuộc nhóm kháng sinh Fluoroquinolones như Levofloxacin, Moxifloxacin, Gatifloxacin. Nhóm B là các thuốc tiêm hàng hai như Amikacin, Capreomycin, Kanamycin. Nhóm C là các thuốc hàng hai chủ đạo khác như Ethionamide, Cycloserin, Clofazimine, Linezolid, Prothionamide. Nhóm D là các thuốc bổ sung, không thuộc nhóm chủ đạo như: Isoniazid liều cao, Pyrazinamide, Ethambutol, Bedaquiline, Meropenem [18]. Đây là các thuốc được dùng khi bệnh nhân bị kháng với thuốc lao hàng một, hay dùng trong một số trường hợp đặc biệt. Các thuốc này thường có nhiều tác dụng phụ hơn và việc sử dụng thuốc cũng phức tạp hơn thuốc kháng lao hàng một. Ngoài ra, giá thành của các thuốc kháng lao hàng hai cũng đắt hơn rất nhiều. Nhận diện nhanh các chủng kháng thuốc, đặc biệt là các chủng kháng RMP và INH, sẽ tạo điều kiện để áp dụng kịp thời các biện pháp điều trị thích hợp; và điều này là vô cùng quan trọng trong giảm sự lan truyền của các chủng kháng thuốc. Khoa Sinh học 6 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Có thể phân loại lao kháng thuốc dựa vào tính kháng các loại thuốc chống lao hàng một như sau[18]: Nếu vi khuẩn kháng một loại trong các loại thuốc kháng lao hàng một mà không phải là Rifampicin thì được gọi là kháng một loại thuốc. Nếu vi khuẩn lao kháng với trên một loại thuốc chống lao hàng một nhưng không kháng Rifampicin thì được gọi là kháng nhiều loại thuốc. Nếu vi khuẩn kháng Rifampicin, có hoặc không kháng thêm các thuốc khác trừ Isoniazid thì được gọi là kháng Rifampicin. Vi khuẩn kháng đồng thời với ít nhất hai thuốc chống lao là Isoniazid và Rifampicin thì được gọi là lao đa kháng thuốc (MDR-TB). Dựa trên tính kháng thuốc với các thuốc chống lao hàng hai để phân loại lao siêu kháng thuốc. Lao tiền siêu kháng: Lao đa kháng có kháng thêm với bất cứ thuốc nào thuộc nhóm Fluoroquinolone hoặc với ít nhất một trong ba thuốc tiêm hàng hai Capreomycin, Kanamycin, Amikacin. Lao siêu kháng thuốc (XDR-TB): Lao đa kháng có kháng thêm với bất cứ thuốc nào thuộc nhóm Fluoroquinolone và bất cứ thuốc nào trong ba thuốc tiêm hàng hai (Capreomycin, Kanamycin, Amikacin). Ngoài ra còn có phân loại bệnh nhân lao theo tiền sử điều trị: - Lao mới là người bệnh lao chưa bao giờ dùng thuốc chống lao hoặc dùng thuốc dưới một tháng. Lao phổi mới là bệnh nhân lao mới mắc thể lao phổi. - Lao tái trị là người bệnh lao đã dùng thuốc chống lao từ một tháng trở lên có thể là người bệnh đã điều trị khỏi lao từ lần trước hoặc điều trị thất bại trước đây do nhiều nguyên nhân. Lao phổi tái trị là bệnh nhân lao tái trị mắc thể lao phổi Trong lao tái trị người bệnh có thể tái nhiễm ngoại sinh (chủng vi khuẩn khác với chủng vi khuẩn ban đầu) hoặc do tái phát (chủng vi khuẩn giống với chủng vi khuẩn ban đầu) [64], [21]. 1.2.2. Tính kháng thuốc của vi khuẩn lao Kháng thuốc là hiện tượng giảm độ nhạy cảm của vi khuẩn lao với thuốc điều trị lao in vitro với nồng độ vừa đủ hợp lý của một vài chủng kiểm tra so với chủng hoang dại chưa từng tiếp xúc với thuốc điều trị lao [53]. Khoa Sinh học 7 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Kháng thuốc tiên phát là kháng thuốc xảy ra ở một bệnh nhân trước đó chưa sử dụng một liệu pháp điều trị chống lao nào; kháng thuốc thứ phát là kháng thuốc sau khi bệnh nhân lao đã có tiếp xúc với thuốc. Kháng thuốc tự nhiên là tính kháng thuốc của chủng kiểu dại. Ví dụ như M.tuberculosis kháng tự nhiên với penicilin [43]. Tỷ lệ vi khuẩn lao kháng thuốc tự nhiên khác nhau tùy từng loại loại thuốc đặc hiệu: Rifampicin là 1/108, Isoniazid là 1/106, Streptomycin và Ethambutol là 1/105. Trong quá trình nhân lên của vi khuẩn tính kháng thuốc sẽ được phát sinh do các đột biến ngẫu nhiên. Khi không có mặt của thuốc, các chủng mẫn cảm sẽ phát triển lấn áp các chủng có đột biến khác. Khi có mặt của thuốc sẽ tạo thành áp lực chọn lọc và chủng đột biến kháng thuốc sẽ trở nên ưu thế và và lây lan sang người khác làm cho người bị nhiễm vi khuẩn lao này sẽ kháng thuốc ngay từ đầu [43]. Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao cũng giống như cơ chế kháng kháng sinh ở các loại vi khuẩn khác do sự hạn chế xâm nhập của kháng sinh vào bên trong thành tế bào hoặc sản xuất ra các men (enzzyme) để phá hủy kháng sinh hoặc che chắn hay làm biến đổi đích tác động của kháng sinh và làm kháng sinh mất hiệu lực. Ở 70-80% vi khuẩn lao kháng INH người ta nhận thấy có sự biến đổi ở gen katG làm giảm hoặc mất hoạt tính men catalase-peroxidase do đó sẽ làm giảm hoặc mất tác dụng của INH đối với vi khuẩn lao [5]. INH sẽ mất khả năng ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao vì vậy mà vi khuẩn lao sẽ kháng thuốc. Đối với RMP, vi khuẩn lao kháng RMP có chứa đột biến gen rpoB làm cho RMP mất khả năng ức chế men RNA-polymeraza của vi khuẩn lao. Tùy từng loại thuốc với cơ chế tác động khác nhau sẽ có cơ chế kháng thuốc khác nhau. Cơ chế kháng một số thuốc của vi khuẩn lao được trình bày trong hình 1.3. Khoa Sinh học 8 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà Hình 1.3: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao 1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về tính kháng thuốc của vi khuẩn lao Theo WHO, năm 2014 số lượng ước tính của các ca nhiễm đa kháng thuốc (MDR/RR-TB) và siêu kháng thuốc (XDR-TB) trong số bệnh nhân nhiễm mới là 480.000, nhưng chỉ khoảng 25% trong số này được chẩn đoán và báo cáo. Trong năm 2014, ước tính có 190.000 người chết vì MDR-TB. Đến năm 2015, đã có báo cáo xuất hiện XDR-TB ở 105 quốc gia; khoảng 9,7% bệnh nhân nhiễm MDR-TB sẽ bị XDR-TB. Và tính đến năm 2016 ước tính có khoảng 600.000 ca nhiễm MDR/RR-TB nhưng chỉ có 153.000 ca được báo cáo và 130.000 ca được điều trị [67]. Việt Nam nằm trong nhóm 30 quốc gia có gánh nặng lao đa kháng thuốc cao nhất thế giới, xếp thứ 14/27 quốc gia có số lượng bệnh nhân MDR-TB nhiều nhất, chiếm 1,7% toàn cầu (WHO, 2015). Bên cạnh đó, Việt Nam là 1 trong 20 quốc gia xảy ra 80% trường hợp nhiễm TB mới của thế giới. Hiện tượng kháng thuốc đã được giám sát từ năm 1978, và tỉ lệ giảm dần đến năm 1998. Năm 19961997 Việt Nam đã tham gia dự án nghiên cứu tình hình kháng thuốc lao trên toàn cầu của WHO cho thấy tỷ lệ kháng thuốc tiên phát khá cao 32,5% trong đó có cả Khoa Sinh học 9 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà 2,3% kháng đa thuốc. Nghiên cứu năm 2005-2006 tỷ lệ kháng thuốc tiên phát có giảm nhưng không đáng kể 30,9%; kháng thuốc thứ phát ở bệnh nhân lao đã điều trị là 58,9% và đặc biệt là tỷ lệ đa kháng ở lao mới (kháng tiên phát) cũng không giảm 2,7% và ở bệnh nhân lao tái trị là 19.3%. Vào năm 2006, tỉ lệ kháng thuốc lại tăng 12,52% so với năm 1978 (30,7% và 18,18%). Những nghiên cứu đơn lẻ của một số cá nhân quanh thời điểm này cũng cho thấy những kết quả kháng thuốc tương tự [3]. Lê Ngọc Hưng và cộng sự (2008) nghiên cứu 193 bệnh nhân lao phổi tái trị tại Bệnh viện Phổi trung ương cho thấy tỷ lệ kháng đa thuốc là 62,9% [8]. Chu Thị Mão và cộng sự (2007) cũng tiến hành nghiên cứu trên bệnh nhân lao phổi mới cho thấy tỷ lệ lao đa kháng là 4% [9]. Lê Thị Kim Hoa (2008) nghiên cứu trên bệnh nhân lao mới và lao tái trị cho thấy tỷ lệ đa kháng trên lao mới là 8,5% và trên lao tái trị là 40,3% [7]. Trong các năm gần đây, tỉ lệ về tính kháng ít nhất 1 thuốc được báo cáo: ví dụ kháng INH là 16% - 25%, và tỉ lệ MDR-TB là 2%-4% đối với bệnh nhân điều trị lần đầu, 17%-18% với bệnh nhân điều trị tái trị. Năm 2017, theo WHO, tại Việt Nam tỷ lệ ước tính lao kháng MDR/RR-TB ở thể lao mới là 4,1% và 17% ở thể lao tái trị. Có thể thấy, tình hình kháng thuốc lao tại Việt Nam vẫn đang được theo dõi, tập trung nhiều vào nhóm vi khuẩn lao đa kháng thuốc. 1.3. Isoniazid trong điều trị lao 1.3.1. Dược lý và chuyển hóa của Isoniazid Isoniazid (viết tắt là INH), là một hydrazid của axit isonicotinic được tổng hợp lần đầu tiên ở Praha năm 1912 nhưng đến năm 1952 mới biết được tác dụng của INH với vi khuẩn lao. Isoniazid có cấu trúc đơn giản chứa vòng pyridine và nhóm hydrazide có tác dụng kìm hãm sinh trưởng và diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào. Cơ chế tác dụng của thuốc là thông qua sự ức chế hình thành axit mycolic có ở thành tế bào vi khuẩn lao [15]. Tuy nhiên, INH cũng được phát hiện là có thể bị kháng bởi M.tuberculosis liên quan tới các đột biến ở nhiều gen, bao gồm katG, ahpC, inhA, kasA, ndh. INH là một tiền thuốc cần được hoạt hóa bởi Khoa Sinh học 10 Khoá 2016-2018 Luận văn Thạc sĩ khoa học Nguyễn Thị Thu Hà catalase/ peroxidase mã hóa bởi katG. INH đã hoạt hóa sẽ can thiệp vào quá trình tổng hợp một thành phần thiết yếu của vi khuẩn lao là mycolic acid bằng cách ức chế NADH-dependent enoyl-ACP reductase được mã hóa bởi inhA. Hai cơ chế phân tử này chính là các nguyên nhân chính dẫn đến tính kháng Isoniazid: đột biến trên katG và inhA. Sau khi uống, INH hấp thu qua ruột vào máu: 40% ở dạng tự do, một phần kết hợp với axit amin trong máu thành hydrazol; INH ở dạng tự do và hydrazol có tác dụng với vi khuẩn lao. Phần còn lại sẽ được chuyển hóa ở gan tạo thành các hợp chất không có tác dụng với vi khuẩn lao. Tại gan, 50% - 90% INH được acetyl hóa bởi enzyme NAT2 như Hình 1.4 tạo thành acetyl Isoniazid, sản phẩm tiếp tục bị thủy phân tạo thành acetyl hydrazine. Một con đường khác là INH có thể bị thủy phân trực tiếp tạo ra hydrazin. Sau đó NAT2 xúc tác quá trình acetyl hóa của hydrazin tạo acetyl hydrazin và diacetyl hydrazin. INH, Acetyl hydrazine và hydrazin có thể bị oxi hóa bởi cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) tạo thành các hợp chất trung gian gây độc cho cơ thể. Enzyme glutathione S-transferase (GST) có thể kết hợp với các chất trung gian này với glutathione và loại bỏ các chất chuyển hóa độc hại này. Các chất chuyển hóa của INH được thải trừ ra khỏi cơ thể chủ yếu qua hệ tiết niệu (chiếm 80%). Dưới 10% liều INH được đào thải qua phân [40]. CYP2E1: cytochrome P450 2E1; NAT2: N-Acetyltransferase 2 Hình 1.4: Chuyển hóa Isoniazid ở gan [40]. Khoa Sinh học 11 Khoá 2016-2018