Tài liệu Khảo sát tình hình nhiễm listeria monocytogenes trong rau xà lách

1 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu đồ án, em đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của thầy cô và bạn bè. Nhân đây em xin chân thành cảm ơn: - Quý Thầy Cô Trường Đại học Nha Trang đã giảng dạy chúng em trong những năm học đại học. - Đặc biệt TS Nguyễn Minh Trí và Th.S Nguyễn Thị Thanh Hải đã hướng dẫn em hết sức tận tình và chu đáo. Quý thầy cô trong bộ môn Hóa – Vi sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ em về tinh thần cũng như vật chất trong khi làm đề tài. Các bạn trong khoa chế biến đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong quá trình làm. - Gia đình đã động viên, ủng hộ, khích lệ con trong thời gian qua. Nha Trang, tháng 6, năm 2011 Sinh Viên Nguyễn Thị Thảo My 2 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ 1 DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... 4 DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... 6 CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................. 8 1.1. GIỚI THIỆU ................................................................................................ 8 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI............................................................................ 9 1.3. NỘI DUNG ĐỀ TÀI .................................................................................... 9 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN ............................................................................. 10 2.1. TỔNG QUAN VỀ RAU XÀ LÁCH:.......................................................... 10 2.1.1. Giới thiệu về Họ rau cải ....................................................................... 10 2.1.2. Rau xà lách .......................................................................................... 10 2.2. GIỚI THIỆU VỀ PHÉP THỬ CẢM QUAN CHO ĐIỂM........................... 13 2.2.1 Giới thiệu về phép thử........................................................................... 13 2.2.2 Phương pháp tiến hành.......................................................................... 14 2.2.3 Xử lý kết quả......................................................................................... 14 2.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Listeria monocytogenes ............................ 14 2.3.1. Sơ lượt về vi khuẩn ............................................................................ 14 2.3.2. Giới thiệu chung về giống vi khuẩn Listeria spp và loài Listeria monocytogenes............................................................................................... 22 2.4. Các phương pháp định lượng Listeria monocytogenes trong thực phẩm. .... 26 2.4.1. Định nghĩa ........................................................................................... 26 2.4.2. Các phương pháp định lượng ............................................................... 26 CHƯƠNG III: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 31 3 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .................................................................... 31 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................ 31 3.2.1. Xà Lách................................................................................................ 31 3.2.2. Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .............................................. 32 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................... 33 3.3.1. Bố trí thí nghiệm .................................................................................. 33 3.3.2. Quy Trình Thực hiện............................................................................ 34 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 39 4.1. ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN XÀ LÁCH THEO CÁC CÁCH XỬ LÝ ........... 39 4.1.1. Kết quả đánh giá cảm quan về chỉ tiêu màu sắc và trạng thái rau xà lách theo phương pháp cho điểm. .......................................................................... 39 4.1.2. Kết luận................................................................................................ 41 4.2. TÌNH HÌNH NHIỄM Listeria monocytogenes TRÊN RAU XÀ LÁCH ..... 41 4.2.1. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes tại các vườn rau. .................. 41 4.2.2. Ảnh hưởng của các quá trình xử lý đến mức nhiễm Listeria monocytogenes43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ................................................................. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 47 Phụ Lục 1 ............................................................................................................. 49 Phụ lục 2 .............................................................................................................. 56 Phụ lục 3 .............................................................................................................. 62 4 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 4.1 4.2 Nội dung Thành phần hóa học của vi khuẩn gram (+) và gram (-) Rau xà lách sau 5 ngày bảo quản lạnh (<40C) theo các cách xử lý Kết quả dánh giá của cảm quan viên về chỉ tiêu màu sắc và trạng thái của rau xà lách theo phương pháp cho điểm Trang 16 39 40 4.3 Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở vùng kiểm tra 41 4.4 Liên hệ giữa nước tưới và mức nhiễm L. monocytogenes 42 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 Số lượng Listeria monocytogenes trong rau xà lách sau khi đã qua xử lý. Bảng Mac Crandy Xây dựng thang điểm chỉ tiêu màu sắc và trạng thái của rau xà lách theo phương pháp cho điểm cảm quan. Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Vĩnh Hải Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Phú Sương 1 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Phú Sương 2 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Phước Hải Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes đường Rhamnose tại vườn rau Phú Thạnh Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Đồng Nai 44 56 57 57 58 58 59 59 60 5 4.14 4.15 4.16 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Diên Phú 1 Kết quả dương tính với Listeria monocytogenes tại vườn rau Diên Phú 2 Kết quả dương tính với tại Listeria monocytogenes vườn rau Diên Phú 3 60 61 61 6 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Nội dung Trang 2.1 Xà lách cuộn 10 2.2 Tiên mao và khuẩn mao ở vi khuẩn 20 2.3 Các loại tiên mao ở vi khuẩn 21 2.4 Khuẩn mao ở vi khuẩn E. coli 22 2.5 Vi khuẩn Listeria monocytogenes 23 2.6 Cận cảnh Listeria monocytogenes qua kính hiển vi điện tử 23 2.7 Buồng đếm hồng cầu 27 2.8 Phương pháp cấy trên đĩa từ các ống tăng sinh 28 3.1 Bản đồ mô tả khu vực lấy mẫu 31 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các phương pháp xử lý đến sự biến đổi bên ngoài của cây rau 33 3.3 Sơ đồ qua quá trình kiểm tra Listeria monocytogenes 33 3.4 Sơ đồ xử lý mẫu và tăng sinh 34 3.5 Sơ đồ định danh Listeria monocytogenes 36 3.6 3.7 Esculin dương tính (bên trái)_ Esculin dương tính (bên phải) Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose_ dương tính (mầu vàng) âm tính (mầu xanh) 36 37 3.8 Hình ảnh Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu 38 3.9 Sơ đồ cách tra bảng Mac Crandy 38 4.1 4.2 Biểu dồ biểu diễn tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở các vùng kiểm tra Máy hấp vô trùng 41 62 7 4.3 Phòng cấy vi sinh 62 4.4 Tủ sấy 62 4.5 Máy cân điện tử 62 4.6 Đường Rhamnose 62 4.7 Dung dich BPW 62 4.8 Ống canh thang chứa môi trường BLEB 63 4.9 Môi trường thạch OXA 63 4.10 Các ống giứ chủng vi khuẩn Listeria monocytogenes 63 8 CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. GIỚI THIỆU Đã từ lâu thực phẩm là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho hoạt động sống của sinh vật cũng như con người nói riêng. Xã hội phát triển, quan niệm ‘ăn no mặc ấm’ không còn phù hợp nữa khi chất lượng cuộc sống đang ngày một được nâng cao đối với đại bộ phận con người ngày nay. Minh chứng cho điều đó là thực phẩm đang tràn ngập trên các thị trường, đa dạng về chủng loại, mẫu mã, hình thức.Vậy khi mua hay ăn thức ăn chúng ta thường quan tâm trước nhất là khẩu vị hay độ an toàn? Theo thói quen và tập quán của người Á Đông và đặc biệt là ở Việt Nam, người tiêu dùng đã quen với việc tới các chợ cóc, chợ tạm để mua thực phẩm tươi sống về sử dụng. Người tiêu dùng nghĩ rằng thực phẩm tươi sống đảm bảo chất dinh dưỡng và ngon miệng hơn so với các sản phẩm đông lạnh, nhưng việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho những mặt hàng này thì các cơ quan chức năng không thể đảm bảo 100% tất cả các sản phẩm bày bán tại các chợ đó được kiểm định. Các mặt hàng thực phẩm tươi sống được bày bán tại các chợ tiềm ẩn các nguy cơ gây ra các bệnh dịch. Đối với thực phẩm đông lạnh: Các nước phát triển trên thế giới đa phần sử dụng thực phẩm đông lạnh và là thực phẩm chính trong các bữa ăn hàng ngày bởi nó được đảm bảo vệ sinh tuyệt đối, được cấp chứng nhận về vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhưng dù nói gì đi chăng nữa, chúng ta không thể làm lơ trước những vụ ngộ độc nghiêm trọng do thực phẩm gây ra. Thông tin từ Bộ Y tế cho biết, trong năm 2010 toàn quốc đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp tử vong. Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong do độc tố cá nóc tại các tỉnh Phú Yên, Bến Tre, Bình Thuận, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên [5] Vấn đề an toàn thực phẩm đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm như do nguyên liệu dùng chế 9 biến hay thực phẩm bị nhiễm dộc tố của vi khuẩn nhưng phần lớn nguồn gốc từ vi sinh vật. Lâu nay, trong vấn đề an toàn thực phẩm, chúng ta chỉ lưu ý đến một số loại vi khuẩn chủ yếu như E.coli, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringgens ... mà chưa lưu ý đến một số loại khác như Listeria monocytogenes. Trong một đợt dịch gần đây, các chuyên gia dịch tễ học Hoa Kỳ đã thống kê cho thấy tỉ lệ tử vong 35% do nhiễm Listeria monocytogenes ở người lớn không có thai nghén, 11% ở những người dưới 40 tuổi và 63% ở những người trên 60 tuổi [18] Điều đáng nói là ngành y tế nước ta vẫn chưa quan tâm nghiên cứu, tầm soát. Có thể nói chúng ta đã bỏ sót loại vi khuẩn này là tác nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm, khả năng thực phẩm bị nhiễm Listeria monocytogenes tại Việt Nam không phải là chưa từng xảy ra, mà vấn đề là công tác điều tra dịch tễ, sàng lọc và thống kê tác nhân gây bệnh chưa đạt yêu cầu, cũng như nhận thức của cộng đồng về an toàn vệ sinh thực phẩm chưa đầy đủ. Nguyên nhân không phải là vì chúng ta không biết về những nguy hiểm do Listeria monocytogenes gây ra mà vì với các phương pháp xét nghiệm lâu nay chúng ta áp dụng như soi trên kính, nhuộm v.v... chỉ thấy được các nhóm vi khuẩn chung, còn việc tìm cụ thể một vi khuẩn như Listeria monocytogenes thì phải cần nhiều đến kỹ thuật chuyên môn vi sinh. Xuất phát từ thực tế trên, cùng với sự định hướng và giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, sau gần 3 tháng nghiên cứu đến nay em đã cơ bản hoàn thành đề tài: ”Khảo sát tình hình nhiễm Listeria monocytogenes trong rau xà lách”. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định mức độ nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogene ở rau xà lách và tác dụng của cách rửa thường dùng đến mức nhiễm vi khuẩn này trên rau. 1.3. NỘI DUNG ĐỀ TÀI - Xác định lượng vi khuẩn Listeria monocytogene nhiễm trong rau xà lách khi chưa qua bất kỳ xử lý nào. - Ảnh hưởng của các cách rửa khác nhau: rửa dưới vòi nước chảy, ngâm rửa với dung dịch nước muối 0,85% và ngâm rửa với thuốc tím 10 ppm đến số lượng vi khuẩn Listeria monocytogene có trong xà lách 10 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1. TỔNG QUAN VỀ RAU XÀ LÁCH: 2.1.1. Giới thiệu về Họ rau cải Họ Cải (danh pháp khoa học: Brassicaceae), còn gọi là họ Thập tự (Cruciferae), là một họ thực vật có hoa. Các loại cây trồng trong họ này gần như đều có chứa chữ cải trong tên gọi. Họ này chứa một số loài có tầm quan trọng kinh tế lớn, cung cấp nhiều loại rau về mùa đông trên khắp thế giới. Các loại rau họ cải bao gồm cây bông cải xanh, rau diếp, xà lách, cải bắp, súp lơ và cải xoăn [9]. 2.1.2. Rau xà lách Là loại rau có mặt trong danh sách loại rau được ăn sống nhiều nhất cùng với xà lách xoang, rau muống, cải bẹ xanh, rau đắng, rau tần ô (cải cúc), rau má, rau thơm gia vị (húng, tía tô, húng quế...).[7] Hình 2.1: Xà lách cuộn a. Nguồn gốc Xà lách là loại cây thân thảo, ngắn ngày, dùng để ăn lá có nguồn gốc từ khu vực Địa Trung Hải, được chú ý làm thức ăn cho người cách nay khoảng 4.500 năm. Đến nay, cây rau xà lách được trồng ở khắp nơi trên thế giới. Hiện tại có khoảng 2 loại xà lách khác nhau: xà lách cuốn bắp tròn, xà lách cuốn bắp dài [9] 11 Với người Việt Nam, xà lách thật sự quen thuộc khi hầu như luôn có mặt trong các bữa ăn hàng ngày. Xà lách là rau ăn kèm nhiều loại thực phẩm khác nhau như các món : riêu cua, riêu cá, bánh tôm, nem rán, bún chả, bún riêu, bún ốc... Theo thống kê, hiện lượng người tiêu thụ khoảng 200g rau/ người/ ngày [7] b.Thành phần và công dụng của xà lách Cứ 100 gam xà lách sẽ cung cấp khoảng 2,2 gam carbohydrate, 1,2 gam chất xơ, 90 gam nước, 166 microgram vitamin A, 73 microgram folate (vitamin B9). Xà lách còn chứa rất nhiều muối khoáng với những nguyên tố kiềm, nhờ đó giúp cơ thể “dọn dẹp” máu, giúp tinh thần tỉnh táo và giúp cơ thể tránh được nhiều bệnh tật. Là một kho cung cấp chất xơ, giàu cellulose nên xà lách còn giúp ruột co bóp, nhờ đó giúp thoát khỏi tình trạng táo bón. Cải xà lách đem lại giấc ngủ tốt vì có chứa một chất gây ngủ là letucarium. Đối với bệnh nhân tiểu đường, xà lách là một loại thực phẩm lý tưởng vì thuộc nhóm rau cải có thành phần carbohydrate thấp hơn 3%. Xà lách còn chứa một hàm lượng đáng kể chất sắt nên là một loại thực phẩm rất tốt cho những người bị thiếu máu do thiếu sắt [9] Nhờ có chứa nhiều beta-carotene nên xà lách được các nhà y học xem là một ứng cử viên tiềm năng trong việc ngăn ngừa ung thư, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, thấp khớp, đục thủy tinh thể ... Một nghiên cứu đã được thực hiện tại ĐH Y khoa Utah (Mỹ) cho thấy rau xà lách có thể làm giảm tần suất rủi ro bị ung thư ruột kết ở cả nam lẫn nữ, do trong cải xà lách có chứa một tác nhân kháng ung thư là lutein. Do hàm lượng nước cao và các vitamin nên ăn xà lách còn giúp người sử dụng có một làn da tươi mát. Ngoài những công dụng trên, ăn xà lách còn hưởng được vô số lợi ích khác như giảm stress, chống lở loét, các bệnh nhiễm trùng đường tiểu hóa…. Theo Đông y Trung Quốc thì xà lách vị đắng ngọt, hơi hàn. Công năng ích ngũ tạng, thông kinh mạch, cứng gân cốt, lợi tiểu tiện và làm trắng răng đẹp da. Dùng chữa tăng huyết áp viêm thận mạn, sữa không thông sau sinh nở ... [8] 12 c. Kỹ thuật trồng xà lách: Thời vụ: Xà lách có thể trồng được quanh năm nhưng vụ Đông xuân và Xuân hè cho năng suất cao hơn. Nếu trồng trong vụ Hè phải có giàn che nắng, hệ thống nước tưới đẩy đủ. Giống: Sử dụng một số giống có năng suất cao, kháng sâu bệnh tốt (xà lách dún Trang Nông, xà lách hai mũi tên, xà lách búp Mineto..). Xử lý hạt giống trước khi gieo bằng Rorval, Aliette, Benlat C, Viben C… Lượng giống gieo cho 500m2: 300g. Sau khi gieo phủ một lớp đất mỏng đã trộn phân huồng hoai, phủ một lớp rơm mỏng. Mùa khô cần tưới đủ ẩm Đất: Có thể trồng cải trên nhiều loại đất khác nhau, chủ động tưới tiêu. Đất cần được cày xới, phơi ải trước 10 ngày trước khi lên liếp. Nên xử lý vôi trước khi gieo trồng 30kg/500m2. Mùa mưa cần che phủ đất bằng rơm hoặc bạt nilon để hạn chế cỏ dại và rửa trôi phân. Không nên trồng liên tục nhiều vụ rau cải trên cùng chân đất. Lên luống: cao 15  20cm, rộng 90cm, rãnh 30cm, đất mặt luống phải bằng phẳng, tơi xốp không gồ ghề để dễ phủ bạt và đục lỗ. Bón lót: toàn bộ phân chuồng (200kg hữu cơ Humix), 30kg lân vi sinh, 30kg Bánh dầu, 3kg Ure, 3kg Kali. Phủ bạt: dùng bạt kích cỡ 90cm, kéo căng, dùng ghim tre ghim thật chặt, hoặc đắp đất cố định bạt. Sâu và bệnh hại: Sâu hại chính trên cây họ cải gồm sâu xanh, sâu khoang, sâu tơ, sâu xanh da láng.. sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh phòng trị: BT, Vi-BT, Dipel, Delfin, Amectin , Thiamectin, Centari…. Bệnh hại chính: Chết cây con, thối nhũn, đốm vòng: sử dụng Aliette, COC85, Ridomil, Monceren, Validacine phun phòng trị. Liều lượng phun có ghi trên bao bì sản phẩm, chú ý ngừng phun thuốc trước khi thu hoạch 8-10 ngày. Thu hoạch và bảo quản: Sau khi cấy ra ruộng 35  40 ngày có thể thu hoạch, không để quá già làm giảm chất lượng sản phẩm, khi thu dùng dao cắt sát gốc. Bảo quản cẩn thận, tránh để sản phẩm bị dập nát và bụi bặm bám vào, nên đóng gói trước khi vận chuyển, phải đảm bảo tươi, sạch khi đưa ra tiêu thụ [8] 13 2.Những nghiên cứu khoa học về rau xà lách: Nghiên cứu trồng rau xà lách trong một số dung dịch thủy canh nhằm sản xuất rau an toàn của tác giả Lê Văn Thiên. Nghiên cứu sự hút thu Cu, Pb, Zn và tìm hiểu khả năng sử dụng phân bón để giảm thiểu sự tích lũy chúng trong rau cải xanh và rau xà lách của PGS.TS Nguyễn Xuân Cự. Studies on lettuce seed germination-I .Coumarin induced dormancy (nghiên cứu sự nẩy mầm của rau xà lách và chất gây ngủ ở xà lách) của A.M.M.Berrie, W. Parker, B.A.Knights and M.R.Hendrie. Departments of Botany and Chemistry, University of Glasgow, Glasgow, France W.2. Studies on irrigation systems to grow lettuce (Lactuca Sativa l.) Transplants (Nghiên cứu trên hệ thống thủy lợi để phát triển rau xà lách) của S. Nicola, J.Hoeberechts, E. Fontana. 2.2. GIỚI THIỆU VỀ PHÉP THỬ CẢM QUAN CHO ĐIỂM 2.2.1 Giới thiệu về phép thử Trong thực tế nhiều khi người ta muốn so sánh nhiều mẫu với nhau về nhiều tính chất cảm quan ở các mức độ khác nhau. Phép thử cho điểm thường dùng để xác định xem mức độ khác nhau về một tính chất cảm quan nào đó giữa hai hay nhiều sản phẩm là bao nhiêu. Trong phép thử này người thử sẽ nhận được đồng thời tất cả sản phẩm đánh giá. Những người này thường là những chuyên gia cảm quan, đã có thời gian dài huấn luyện và làm việc trong lĩnh vực này. Sau khi nếm thử, người thử sẽ đánh giá cường độ của tính chất cảm quan của mỗi sản phẩm thông qua một điểm số tương ứng với một thuật ngữ mô tả cường độ tính chất ấy đã được quy định sẵn. Thang điểm thường dùng trong phép thử này là thang điểm 6. Thang điểm hay thuật ngữ mô tả cường độ là do người điều hành thí nghiệm lựa chọn, tuy nhiên cần tránh những thuật ngữ không rõ nghĩa [11] 14 2.2.2 Phương pháp tiến hành Để đảm bảo cho chất lượng của phép thử người ta lập phiếu chuẩn bị thí nghiệm.Trên phiếu cũng gồm các nội dung như trật tự trình bày mẫu cho mỗi người thử và cho mỗi lần cặp, các bộ mã số ngẫu nhiên dùng cho các mẫu, bảng ghi lại kết quả cho điểm của người thử… Trên phiếu trả lời của phép thử này ngoài phần giới thiệu của nội dung phép thử thì cần ghi lại thang điểm sử dụng với những thuật ngữ mô tả cấp độ của tính chất cần so sánh [11] 2.2.3 Xử lý kết quả Trường hợp có 3 mẫu trở lên người ta thường dùng phương pháp phân tích phương sai ANOVA (Analysis of Variance). Phương pháp giúp tính được chuẩn F để kiểm định xem liệu ba mẫu có khác nhau không? Nếu có ta sẽ dùng chuẩn tiếp tstudent để xác định mẫu nào khác mẫu nào hoặc các thành viên cho điểm có khác nhau không. Chuẩn F là tương quan giữa phương sai tính riêng cho từng yếu tố (mẫu hay người thử) so với phương sai sai số của từng thực nghiệm. Nếu giá trị F tính được lớn hơn hoặc bằng giá trị Ftc ở một mức ý nghĩa nào đó thì sự khác nhau về yếu tố đó được coi là có nghĩa ở mức ý nghĩa đó [11] 2.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Listeria monocytogenes 2.3.1. Sơ lượt về vi khuẩn 2.3.1.1. Đặc điểm chung của vi sinh vật. Vi sinh vật (microorganisms) là tên gọi chung tất cả các vi sinh vật nhỏ bé, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Chúng sống mọi nơi trên trên trái đất, ngay cả trong những nơi mà điều kiện tưởng chừng hết sức khắc nghiệt vẫn thấy có sự phát triển cúa chúng. Trong đường ruột của con người có không dưới 100  400 loài vi sinh vật khác nhau, chúng chiếm tới 1/3 khối lượng khô của phân. Chiếm số lượng cao nhất trong đường ruột 15 của người là vi khuẩn Bactiroides Fragilis, gấp 100  1000 lần số lượng của vi khuẩn Escherichia coli. Ở độ sâu 10.000m của Đông Thái Bình Dương, nơi hoàn toàn tối tăm lạnh lẽo và có áp suất cao người ta vẫn phát hiện thấy có khoảng 1 triệu  10 tỉ vi khuẩn/1ml (chủ yếu là vi khuẩn Lưu huỳnh). Ở dộ cao tới 84 km người ta vẫn phát hiện thấy có vi sinh vật. Mặt khác khi khoang lớp đá trầm tích sâu tới 427m ở châu nam cực người ta vẫn phát hiện vi sinh vật sống. Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau. Đường kính cúa phần lớn vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2  2 µm, chiều dài cơ thể khoảng 0,5-8,0 µm. Những hình dạng chyủ yếu của vi khuẩn là hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn, hình có sợi ... Mỗi tế bào vi khuẩn đều rất nhỏ và trong suốt.Vì thế khi dùng phương pháp soi tươi (phương pháp giọt treo) dưới kính hiển vi chỉ có thể thấy được đại thể về hình dạng và tình trạng di động của chúng hoặc muốn biết vi khuẩn đó là gram dương hay gram âm dùng phương pháp nhuộm gram. Có khả năng hấp thụ nhiều, chuyển hóa nhanh. Chẳng hạn vi khuẩn lactic (Lactobacillus) trong một giờ có thể phân giải lượng đường Lactozơ nặng hơn 1000  10000 lần khối lượng của chúng, còn ở nấm men rượu (Sacharomyces cerevisiae) là 110, ở vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas là 1200, ở vi khuẩn thuộc chi Azotobacter là 2000. Năng lực chuyển hóa sinh hóa mạnh mẽ của vi sinh vật dẫn đến những tác dụng hết sức lớn lao của chúng trong thiên nhiên cũng như hoạt động sống của con người. Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh. So các vi sinh vật khác thì vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng và sinh sôi nẩy nở cực kỳ lớn. Vi khuẩn Escherichia coli trong điều kiện thích hợp cứ khoảng 12  20 phút lại phân cắt 1 lần. Thường tính chung khoảng 20 phút phân cắt 3 lần, 24 giờ phân cắt 72 lần, và từ 1 tế bào ban đầu sẽ sinh ra 4.722.366.500.000.000.000.000 tế bào (nặng 4722 tấn). Tất nhiên trong thực tế không thể tạo ra các điều kiện sinh trưởng lí tưởng như vậy được cho nên số lượng vi khuẩn thu được trong 11 ml dịch nuôi cấy thường chỉ đạt từ 108  109. Thời gian thế hệ của Sacharomyces cerevisiae là 120 phút, cuả vi khuẩn lam là 23 giờ. 16 Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị. Người ta nhận thấy số lượng enzim thích ứng chiếm tới 10% lượng chứa protein trong tế bào vi sinh vật. Phần lớn vi sinh vật có thể giữ nguyên sức sống ở nhiệt độ nitơ lỏng (-1960C), thậm chí ở nhiệt độ của hidro lỏng (-2530C). Chúng dồng thời cũng dễ phát sinh biến dị bởi vì thường là đơn bào, đơn bội, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống. Tần số biến dị ở vi sinh vật là 10-5  10-10. Hình thức biến dị là đột biến gene và dẫn đến nhiều thay đổi về hình thái cấu tạo, kiểu tao đổi chất, sản phẩm trao đổi chất, tính kháng nguyên, tính đề kháng…. [1] 2.3.1.2. Cấu tạo của vi sinh vật: a.Thành tế bào : Thành tế bào (cell wall) giúp duy trì hình thái của tế bào, hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao (flagellum), giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào, cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể (bacteriophage). Năm 1884 H.Christian Gram đã phát hiện ra phương pháp nhuộm phân biệt để phân chia vi khuẩn thành 2 nhóm khác nhau: vi khuẩn Gram dương (G+) và vi khuẩn Gram âm (G-). Phương pháp nhuộm Gram về sau được sử dụng rộng rãi khi định loại vi sinh vật. Thành phần hoá học của 2 nhóm này khác nhau chủ yếu như sau: Bảng 2.1: Thành phần hóa học của gram (+) và gram (-) Gram dương Thành phần Peptidoglycan Acid teicoic (Teichoic acid) Lipid Protein Gram âm Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào 30-95 5-20 Cao 0 Hầu như không có 20 Không có hoặc có ít Cao 17 Peptidoglycan là loại polyme xốp, khá bền vững, cấu tạo bởi 3 thành phần: - N-Acetylglucosamin ( N-Acetylglucosamine, NAG) - Acid N-Acetylmuramic (N-Acetylmuramic acid, NAM) - Tetrapeptid chứa cả D- và L- acid amin b. Màng sinh chất: Màng sinh chất hay Màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane, CM) ở vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Chúng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL), chiếm 30  40% khối lượng của màng, và các protein (nằm trong, ngoài hay xen giữa màng), chiếm 60  70% khối lượng của màng. Đầu phosphat của PL tích điện, phân cực, ưa nước, đuôi hydrocarbon không tích điện, không phân cực, kỵ nước. Cytoplasmic membrane có các chức năng chủ yếu sau đây:  Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất  Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường trong tế bào  Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của thành tế bào và các polyme của bao nhày (capsule)  Là nơi tiến hành quá trình phosphoryl oxy hoá và quá trình phosphoryl quang hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng)  Là nơi tổng hợp nhiều enzym, các protein của chuỗi hô hấp.  Cung cấp năng lượng cho sự hoạt động của tiên mao c. Tế bào chất : Tế bào chất (TBC- Cytoplasm) là phần vật chất dạng keo nằm bên trong màng sinh chất, chứa tới 80% là nước. Trong tế bào chất có protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lượng phân tử thấp. 18 Bào quan đáng lưu ý trong TBC là ribosom. Ribosom nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng khô của TBC. Ribosom gồm 2 tiểu phần (50S và 30S), hai tiểu phần này kết hợp với nhau tạo thành ribosom 70S (S là đơn vị Svedberg - đại lượng đo tốc độ lắng khi siêu ly tâm). Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ như các hạt glycogen, hạt PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat), Cyanophycin, Phycocyanin, các hạt dị nhiễm sắc (metachromatic body), các giọt lưu huỳnh. Ở loài vi khuẩn diệt côn trùng Bacillus thuringiensis và Bacillus sphaericus còn gặp tinh thể độc (parasoral body) hình quả trám, có bản chất protein và chứa những độc tố có thể giết hại trên 100 loài sâu hại (tinh thể độc chỉ giải phóng độc tố trong môi trường kiềm do đó các vi khuẩn này hoàn toàn vô hại với người, gia súc, gia cầm, thuỷ hải sản- có hại đối với tằm). d. Thể nhân: Thể nhân (Nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có hình dạng cố định, và vì vậy còn được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy thể nhân hiện màu tím. Đó là 1 nhiễm sắc thể (NST, chromosome) duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi ADN xoắn kép (ở Xạ khuẩn Streptomyces có thể gặp nhiễm sắc thể dạng thẳng). NST ở vi khuẩn Escherichia coli dài tới 1mm (!), có khối lượng phân tử là 3.109, chứa 4,6.106 cặp base nitơ. Thể nhân là bộ phận chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn. Ngoài NST, trong tế bào nhiều vi khuẩn còn gặp những ADN ngoài NST. Đó là những ADN xoắn kép có dạng vòng khép kín, có khả năng sao chép độc lập, chúng có tên là Plasmid. e. Bao nhầy: Bao nhầy hay Giáp mạc (Capsule) gặp ở một số loài vi khuẩn với các mức độ khác nhau: - Bao nhầy mỏng (Vi giáp mạc, Microcapssule) 19 - Bao nhầy (Giáp mạc, Capsule) - Khối nhầy (Zooglea) Muốn quan sát bao nhầy thường lên tiêu bản với mực tàu, bao nhày có màu trắng hiện lên trên nền tối. Thành phần chủ yếu của bao nhầy là polysaccarid, ngoài ra cũng có polypeptid và protein.Trong thành phần polysaccarid ngoài glucose còn có glucozamin, ramnose, acid 2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic... Ý nghĩa sinh học của bao nhầy: - Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn, bảo vệ vi khuẩn tránh bị thực bào (trường hợp Phế cầu khuẩn-Diplococcus pneumoniae). - Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn. - Là nơi tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan...) - Giúp vi khuẩn bám vào giá thể (trường hợp các vi khuẩn gây sâu răng như Streptococcus salivarrius, Streptococcus mutans...). i. Tiên mao và khuẩn mao : Tiên mao (Lông roi, flagella) không phải có mặt ở mọi vi khuẩn, chúng quyết định khả năng và phương thức di động của vi khuẩn. Tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ khi nhuộm theo phương pháp riêng. Dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rất rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao. Để xác định xem vi khuẩn có tiên mao hay không còn có cách thử gián tiếp nhằm biết khả năng di động của chúng. Cấy bằng que cấy nhọn đầu vào môi trường thạch đứng chứa 0,4% thạch (agar-agar), còn gọi là môi trường thạch mềm. Nếu thấy vết cấy lan nhanh ra xung quanh thì chứng tỏ là vi khuẩn có tiên mao, có khả năng di động. Tiên mao có thể gốc (basal body), gồm 1 trụ nhỏ được gắn với 4 đĩa tròn (vi khuẩn G -) có dạng vòng nhẫn (ring), ký hiệu là các vòng L, P, S và M. Vòng L nằm ngoài cùng, tương ứng với lớp liposaccarid của màng ngoài; vòng P tương 20 ứng với lớp peptidoglycan, vòng S tương ứng với lớp không gian chu chất; vòng M nằm ở trong cùng. Vi khuẩn G+ chỉ có 2 vòng: 1 vòng nằm ngoài tương ứng với thành tế bào và 1 vòng trong tương ứng với màng sinh chất. Xuyên giữa các vòng là 1 trụ nhỏ (rod) có đường kính 7nm. Bao bọc tiêm mao ở phần phía ngoài là một bao ngắn có hình móc (hook). Sợi tiên mao (filament) dài khoảng 10  200m và có đường kính khoảng 13  20nm. Đường kính của bao hình móc là 17nm. Khoảng cách giữa vòng S và vòng M là 3mm, giữa vòng P và vòng L là 9nm, giữa vòng P và vòng S là 12nm. Đường kính của các vòng là 22nm, đường kính các lỗ ở các vòng là 10nm. Khoảng cách từ mặt ngoài của vòng L đến mặt trong của vòng M là 27nm. Sợi tiên mao cấu tạo bởi loại protein có tên là flagellin, có trọng lượng phân tử là 30.000  60 000. Một số vi khuẩn có bao lông (sheath) bao bọc suốt chiều dài sợi, như ở trường hợp chi Bdellovibrio hay vi khuẩn tả Vibrio cholera. Hình 2.2: Tiên mao và khuẩn mao ở vi khuẩn Tiên mao của vi khuẩn có các loại khác nhau tuỳ từng loài : - Không có tiên mao (vô mao, atrichia) - Có 1 tiên mao mọc ở cực (đơn mao, monotricha) - Có 1 chùm tiên mao mọc ở cực (chùm mao, lophotricha) - Có 2 chùm tiên mao mọc ở 2 cực (song chùm mao, amphitricha) - Có nhiều tiên mao mọc khắp quanh tế bào (chu mao, peritricha) - Có loại tiên mao mọc ở giữa tế bào như trường hợp vi khuẩn Selenomonas ruminantium.