Tài liệu Khảo sát tình hình nhiễm chlamydophila psittaci trên gà tại khánh hòa

  • Số trang: 68 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 126 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 27127 tài liệu

Mô tả:

i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Tiến sĩ Lê Lập, trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Tiến sĩ Võ Thành Thìn, phó trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, anh Lê Trung Hiếu, chị Đặng Thị Sao Mai, anh Lê Đình Hải và các anh chị thuộc Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện thú y miền Trung đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực tập tại phân viện. Tôi xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Văn Hồng Cầm, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã luôn luôn nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 06 năm 2012 Sinh viên Đoàn Văn Tiến ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i MỤC LỤC……...........................................................................................................ii DANH MỤC BẢNG...................................................................................................v DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .......................................................................vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................vii LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1 CHƯƠNG I:TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. Khái niệm và lịch sử bệnh Chlamydophilosis ....................................................3 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Chlamydophila psittaci.................................................4 1.2.1. Phân loại vi khuẩn Cp. psittaci .................................................................4 1.2.2. Hình thái vi khuẩn Cp. psittaci .................................................................4 1.2.3. Các tính chất sinh hóa vi khuẩn Cp. psittaci.............................................6 1.2.4. Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn Cp. psittaci ...........................................6 1.2.5. Độc lực của vi khuẩn Cp. psittaci .............................................................8 1.2.6. Con đường lây nhiễm Cp. psittaci ............................................................9 1.3. Triệu chứng bệnh Chlamydophilosis................................................................10 1.4. Bệnh tích bệnh Chlamydophilosis ....................................................................11 1.5. Chẩn đoán bệnh Chlamydophilosis ..................................................................12 1.5.1. Thu thập và xử lý mẫu ............................................................................12 1.5.2. Quan sát trực tiếp bằng phương pháp nhuộm .........................................13 1.5.3. Phân lập vi khuẩn Cp. psittaci ................................................................13 1.5.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào ............................................................13 1.5.3.2. Phương pháp gây nhiễm vi khuẩn trên phôi gà ................................14 1.5.4. Phát hiện các kháng nguyên đặc hiệu cho vi khuẩn Cp. psittaci ............14 1.5.5. Phát hiện các gen đặc hiệu cho vi khuẩn Cp. psittaci .............................14 1.5.6. Xét nghiệm huyết thanh học ...................................................................16 1.5.7. Chẩn đoán phân biệt................................................................................17 iii 1.6. Điều trị bệnh Chlamydophilosis .......................................................................17 1.7. Phòng bệnh Chlamydophilosis .........................................................................19 1.8. Bệnh Chlamydophilosis ở người ......................................................................19 CHƯƠNG II: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................................................................21 2.1. Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................21 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................21 2.3. Nguyên liệu nghiên cứu....................................................................................21 2.3.1. Mẫu bệnh phẩm.......................................................................................21 2.3.2. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu .........................................21 2.3.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ...............................................................22 2.4. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................23 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ngoáy hầu họng ở gà ...........................................23 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA Cp. psittaci từ mẫu ngoáy hầu họng .......23 2.4.2.1. KIT chiết tách DNA..........................................................................23 2.4.2.2. Quy trình chiết tách DNA .................................................................23 2.4.3. Chuẩn hóa nested PCR phát hiện Cp. psittaci trong mẫu bệnh phẩm ....24 2.4.3.1. Phương pháp xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi..........................25 2.4.3.2. Phương pháp xác định tính đặc hiệu của mồi ...................................25 2.4.4. Phương pháp nested PCR phát hiện gen omp1 .......................................27 2.4.5. Phát hiện DNA: Phương pháp điện di trên gel agarose ..........................29 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................31 3.1. Chuẩn hóa phản ứng nested PCR .....................................................................31 3.1.1. Xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi .....................................................31 3.1.2. Xác định tính đặc hiệu của mồi...............................................................35 3.2. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Cp. psittaci trên gà tại Khánh Hòa .............37 3.2.1. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà ...........41 3.2.2. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo loại gà...............43 iv 3.2.3. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo phương thức chăn nuôi ...........................................................................................................44 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................46 4.1. Kết luận ............................................................................................................46 4.2. Kiến nghị ..........................................................................................................46 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các serovar của Chlamydophila psittaci....................................................8 Bảng 2.1. Thành phần bộ kít tách chiết QIAamp DNA Mini Kit ............................22 Bảng 2.2. Trình tự mồi dùng cho phản ứng nested PCR..........................................28 Bảng 2.3. Thành phần của một phản ứng nested PCR .............................................28 Bảng 3.1. Nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi........................................................31 Bảng 3.2. Kết quả xác định nhiệt độ gắn thích hợp của cặp mồi xuôi và cặp mồi ngược ................................................................................................34 Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả PCR các mẫu thu được tại hai địa điểm Ninh Hòa và Cam Lâm (Khánh Hòa).......................................................................40 Bảng 3.4. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà ....42 Bảng 3.5. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo loại gà ................43 Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo phương thức chăn nuôi..................................................................................................44 vi DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Ảnh chụp hiển vi điện tử về sự lan truyền của vi khuẩn Chlamydophila psittaci dạng thể vùi (INCLUS) trong các tế bào L929 được gây nhiễm. ...............................................................................5 Hình 2.1. Sơ đồ minh họa vị trí gắn hai cặp mồi Cp1-F, Cp1-R, Cp2-F và Cp2-R trên gen omp1 của vi khuẩn Chlamydophila psittaci...................28 Hình 3.1. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R với nhiệt độ bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 48-580C .........................................32 Hình 3.2. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp2-F và Cp2-R với nhiệt độ bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 50-620C .........................................33 Hình 3.3. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi ngoài Cp1-F và Cp1-R ..................................................................................................35 Hình 3.4. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi trong Cp2-F và Cp2-R ..................................................................................................37 Hình 3.5. Kết quả chạy PCR1 của 29 mẫu ngoáy hầu họng (1-29) thu tại thị xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa .................................................................38 Hình 3.6. Kết quả chạy PCR1 của 35 mẫu ngoáy hầu họng (30-64) thu tại huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa ...........................................................39 Hình 3.7. Kết quả chạy PCR2 các mẫu dương tính với PCR1 (3, 4, 7, 9, 11, 13, 18 và 26) ............................................................................................40 Hình 3.8. Kết quả PCR2 các mẫu dương tính với PCR1 (30, 37, 38, 41, 45,61, 63 và 64) ..................................................................................................41 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Chữ viết tắt ppm part per million DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction µl microlitre opt optimum T Temperature P-value Trị số thống kê VD variable domain LD Leading peptide MOMP Major outer membrane protein 1 LỜI MỞ ĐẦU Chăn nuôi gà là nghề chăn nuôi có truyền thống lâu đời và chiếm vị trí quan trọng thứ hai (sau chăn nuôi lợn) trong toàn ngành chăn nuôi của Việt Nam. Theo Trần Công Xuân (2008), ngành chăn nuôi gà cung cấp khoảng 350-450 ngàn tấn thịt và hơn 2,5-3,5 tỷ quả trứng hàng năm. Chăn nuôi gà chiếm 72-73% trong tổng số đàn gia cầm hàng năm (Quyết định của Thủ tướng Chính phủ số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16/01/2008). Mỗi năm ngành chăn nuôi gà đã sản xuất một khối lượng thịt hơi chiếm khoảng 14- 15% trong tổng khối lượng thịt hơi các loại (thịt lợn chiếm 75-76%). Theo số liệu của Tổng Cục thống kê năm 2003, sản lượng thịt, trứng gà đạt cao nhất; khối lượng thịt gà là 271,7 ngàn tấn và số lượng trứng là 3,5 tỷ quả. Năm 2004, do dịch cúm xảy ra, ngành chăn nuôi gà bị thiệt hại lớn, sản lượng sản phẩm thịt, trứng đều giảm sút. Tính đến 1/8/2004 khối lượng thịt 231 ngàn tấn (bằng 84,89% của năm 2003), sản lượng trứng đạt 2,8 tỷ quả (bằng 81,27% của năm 2003). Theo số liệu tính quay vòng, năm 2005 sản lượng thịt đạt 453,6 ngàn tấn, sản lượng trứng đạt 2,87 tỷ quả. Năm 2006, do ảnh hưởng của dịch cúm gia cầm sản lượng thịt, trứng giảm hơn năm 2005 (thịt gà đạt 538,9 ngàn tấn, trứng đạt 2,4 tỷ quả) (Trần Công Xuân, 2008). Chăn nuôi gà phát triển mạnh, nhất là vùng Đồng bằng sông Hồng, Đồng bằng sông Cửu Long và Đông Bắc. Sản lượng đầu con của các vùng này năm 2003 tương ứng là 50,13; 34,58 và 26,57 triệu con, chiếm 60% đàn gà của cả nước. Các vùng phát triển tiếp theo là Đông Nam Bộ và Bắc Trung Bộ, chiếm 26%, các vùng có sản lượng thấp nhất là Tây Bắc và Tây Nguyên, chỉ chiếm từ 4-5% về số lượng đầu con. Do phương thức chăn nuôi nhỏ lẻ, thả rông, buôn bán, giết mổ phân tán, không đảm bảo an toàn sinh học nên dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra, gây tổn thất lớn về kinh tế. Các bệnh thường gặp là: Niucátxơn Gumbôrô, Tụ huyết trùng… 2 Trong đó, tỷ lệ gà bị bệnh Niucátxơn từ 40-53%, bệnh Gumbôrô 27-32%, tụ huyết trùng 14-15%. Theo số liệu điều tra của viện Chăn nuôi quốc gia, tỷ lệ chết từ khi nở ra cho đến lúc trưởng thành của đàn gà nuôi thả rông là 47%; chi phí thuốc thú y trị bệnh lên đến 10-12% giá thành (Trần Công Xuân, 2008). Chăn nuôi gà nông hộ vẫn bấp bênh, ngành chăn nuôi gà phát triển không bền vững. Khánh Hòa là một tỉnh thành có ngành chăn nuôi khá phát triển, đặt biệt là chăn nuôi gà. Tuy nhiên, đặc điểm khí hậu và các điều kiện tự nhiên thường thuận lợi cho sự phát triển của nhiều dịch bệnh, trong đó bệnh Chlamydophilosis do Cp. psittaci gây ra là một bệnh đáng quan tâm. Hiện nay ở nước ta chưa có những báo cáo nào liên quan đến vi khuẩn Chlamydophila psittaci và bệnh Chlamydophilosis do chúng gây ra. Tuy nhiên do đặc điểm bệnh lây lan nhanh và nguy hiểm ở cả gia cầm và người nên bệnh có thể bùng phát gây thiệt hại cho người chăn nuôi cũng như ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng. Nhằm hiểu biết thêm về tình hình nhiễm bệnh Chlamydophilosis do vi khuẩn Chlamydophila psittaci gây ra trên gà tại nội tỉnh Khánh Hòa, chúng tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát tình hình nhiễm Chlamydophila psittaci trên gà tại Khánh Hòa”. Mục tiêu của đề tài là đánh giá tình hình nhiễm Cp. psittaci trên gà ở mọi lứa tuổi tại tỉnh Khánh Hòa. Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm: - Chuẩn hóa phản ứng PCR phát hiện Cp. psittaci trong mẫu bệnh phẩm. - Xác định tỷ lệ nhiễm Chlamydophila psittaci trên gà theo các chỉ tiêu về độ tuổi, loại gà và phương thức chăn nuôi. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái niệm và lịch sử bệnh Chlamydophilosis Bệnh Chlamydophilosis (Chlamydiosis) trên gia cầm do vi khuẩn Chlamydophila psittaci (Cp. psittaci) gây ra. Bệnh được phát hiện lần đầu tiên trên Vẹt và được gọi là “bệnh sốt vẹt” (psittacosis) vào những năm 1929-1930. Trong khoảng thời gian này, bệnh được chú ý trên phạm vi toàn thế giới khi xuất hiện trên các đối tượng gia cầm ở 12 quốc gia. Tại Mỹ, người ta cho rằng bệnh lây lan do Vẹt rừng Amazon vùng Nam Mỹ. Năm 1931, các điều lệ gắt gao đã được thực hiện nhằm hạn chế việc nhập khẩu vẹt từ các nước nhiệt đới. Suốt thời gian này, Leventhal, Cole và Lillie độc lập quan sát các thể ái kiềm rất nhỏ trong mô của chim và người bị nhiễm bệnh và cho rằng chính các thể này là tác nhân gây bệnh. Mối quan hệ giữa các thể ái kiềm và nguyên nhân gây bệnh Chlamydophilosis cuối cùng cũng được thiết lập bởi Bedson và Bland (Meyer, 1965). Năm 1939, vi khuẩn Cp. psittaci phân lập được từ bồ câu tại Nam Phi và California (Mỹ). Cũng tại thời điểm này, bệnh do Cp. psittaci xuất hiện trên hai người dân New York (Mỹ) sau khi có tiếp xúc với bồ câu hoang dã nhiễm bệnh. Năm 1942, kết quả khảo sát huyết thanh cho thấy vịt và gà tây là loài vật nhiễm Cp. psittaci với tỉ lệ cao nhất. Hơn nữa, những người ở California và New York (Mỹ) tiếp xúc với vịt, gà tây nhiễm bệnh đều cho kết quả dương tính với kháng thể kháng Cp. psittaci. Đầu những năm 1950, vi khuẩn Cp. psittaci phân lập được từ gà tây và người có tiếp xúc với gà tây nhiễm bệnh tại các trang trại chăn nuôi lớn ở Mỹ. Thống kê cho thấy số lượng các loài gia cầm bị nhiễm bệnh tăng nhanh và hiện nay có trên 400 loài chim thuộc hơn 21 bộ chim bị nhiễm bệnh (Andersen và Vanrompay, 2008). Bệnh do Cp. psittaci lại bùng phát trên gà tây tại Mỹ vào những năm 1980, tại châu Âu vào những năm 1990 (Vanrompay và cs., 1993b; Ryll và cs., 1994). Tại Bỉ, bệnh do Cp. psittaci xảy ra thường xuyên trên gà tây tại các trại nuôi công 4 nghiệp (Van Loock và cs., 2005; Verminnen và cs., 2006). Gần đây, số ca bệnh Chlamydophilosis trên vịt và người tiếp xúc với vịt nhiễm bệnh gia tăng (Andersen và Vanrompay, 2008; Laroucau và cs., 2009). 1.2. Tổng quan về vi khuẩn Chlamydophila psittaci 1.2.1. Phân loại vi khuẩn Cp. psittaci Trước đây giống Chlamydia (C.) gồm có 4 loài là C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae, và C. pecorum. Tuy nhiên, lượng dữ liệu về các trình tự DNA mới của chúng trở nên nhiều hơn nên Everett và cộng sự đã thiết lập lại hệ thống phân loại dựa trên mối quan hệ về mặt di truyền và đề xuất hệ thống loại mới vào năm 1999. Theo ông và cộng sự, vi khuẩn Cp. psittaci thuộc họ Chlamydiaceae. Họ Chlamydiaceae được xác định là có 2 giống và gồm 9 loài (Everett và cs., 1999a): • Giống Chlamydia (C.) gồm các loài C. trachomatis (gây bệnh ở người), C. suis (gây bệnh ở lợn) và C. muridarum (gây bệnh ở chuột). • Giống Chlamydophila (Cp.) gồm các loài Cp. psittaci (gây bệnh trên gia cầm), Cp. felis (gây bệnh cho mèo), Cp. abortus (gây bệnh trên bò, dê, cừu), Cp. caviae (gây bệnh trên chuột lang), Cp. pneumoniae (gây bệnh cho người) và Cp. pecorum (gây bệnh trên động vật nhai lại). 1.2.2. Hình thái vi khuẩn Cp. psittaci Vi khuẩn Cp. psittaci là cầu khuẩn gram âm, sống ký sinh trong tế bào vật chủ. Thành tế bào của Cp. psittaci không có lớp peptidoglycan. Trong tế bào vật chủ, vi khuẩn Cp. psittaci thường tồn tại ở 3 dạng riêng biệt về mặt hình thái (hình 1.1): - Thể trung gian hay thể sơ cấp (elementary bodies - EB), - Thể mắc lưới không gây nhiễm (non-infectious reticulate bodies - RB) - Thể trung cấp (intermediate bodies- IB). 5 Hình 1.1. Ảnh chụp hiển vi điện tử về sự lan truyền của vi khuẩn Chlamydophila psittaci dạng thể vùi (INCLUS) trong các tế bào L929 được gây nhiễm. (Độ phóng đại: 15,000 lần (Andersen và Vanrompay, 2008)) Quá trình xâm nhiễm vào tế bào chủ được bắt đầu bởi các EB có đường kính 250-300 nm. Các EB có dạng cầu nhỏ, thường tập trung thành những đám dày đặt với lớp vỏ bền vững với môi trường và khi di chuyển giữa các tế bào vật chủ. Sau khi xâm nhiễm vào tế bào chủ, các EB được chuyển vào các không bào trong tế bào chất (intracytoplasmic vacuoles) và chuyển thành các thể mắc lưới không gây nhiễm (non-infectious reticulate bodies - RB). Các RB có đường kính khoảng 400 - 600 nm, có khả năng thẩm thấu, thành tế bào không ổn định tạo điều kiện cho các hoạt động trao đổi chất. Tại đây, quá trình nguyên phân xảy ra tạo ra các thế hệ tiếp theo, 6 sau đó chuyển thành các EB hoàn chỉnh. Các EB hoàn chỉnh phá vỡ thành tế bào chủ và giải phóng ra ngoài. Trong suốt quá trình trưởng thành của các thể EB mới, ta có thể quan sát thấy các thể IB tồn tại trong tế bào chủ. Thể IB có lõi đặc với các sợi nucleoid bao quanh. Toàn bộ quá trình xâm nhiễm, phân chia và phá vỡ tế bào chủ của vi khuẩn Cp. psittaci kéo dài khoảng 28-32 giờ (Woldehiwet, 2008). Mặc dù Cp. psittaci là vi khuẩn thuộc nhóm gram âm, song phương pháp nhuộm gram thường không phát hiện được chúng. Khi nhuộm mẫu mô nhiễm Cp. psittaci bằng các phương pháp như Castaneda, Giemsa, Gimenez, Macchiavello có thể phát hiện được các thể khác nhau của Cp. psittaci. Chúng có màu tím đậm khi được nhuộm bằng phương pháp Giemsa, có màu xanh nước biển trong phương pháp Castaneda và có màu đỏ khi nhuộm bằng phương pháp Macchiavello và Gimenez. Phương pháp nhuộm Gimenez được sử dụng nhiều nhất khi phát hiện các thể trung gian của Cp. psittaci trong lòng đỏ trứng gây nhiễm, túi khí, lách và tim gia cầm mắc bệnh (Gimenez, 1964). 1.2.3. Các tính chất sinh hóa vi khuẩn Cp. psittaci Thể RB tồn tại trong tế bào chất của tế bào chủ và hoạt động trao đổi chất được thực hiện tại đây. DNA và RNA của Cp. psittaci được tìm thấy ở cả thể EB và RB, tuy nhiên số lượng DNA, RNA ở RB cao hơn so với EB. Quá trình sinh tổng hợp DNA, RNA và protein được diễn ra chủ yếu ở thể RB (Andersen và Vanrompay, 2008). Tuy vậy, quá trình trao đổi chất của chúng vẫn có nhiều hạn chế so với các vi khuẩn sống tự do. Chẳng hạn như chúng không thể hoàn thành chu trình pentose và không sử dụng pyruvate bằng chu trình axít tricarboxylic. Tuy nhiên, chúng có thể dị hóa axít pyruvic, aspartic và glutamic, tạo ra CO2 và các sản phẩm chứa 2 và 4 carbon (Andersen và Vanrompay, 2008). 1.2.4. Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn Cp. psittaci Cấu trúc kháng nguyên của Cp. psittaci chưa được xác định rõ ngoại trừ protein màng ngoài (MOMP) (Andersen và Vanrompay, 2008; Vanrompay, 2008). 7 MOMP có trọng lượng phân tử khoảng 40 kDa và chiếm khoảng 60% trọng lượng của tất cả lớp màng ngoài. MOMP có tính kháng nguyên mạnh, việc phân loại Cp. psittaci thường dựa trên kháng thể đặc hiệu kháng MOMP (Andersen, 1991; Vanrompay và cs., 1993a). MOMP được mã hóa bởi gen omp1 (còn gọi là ompA). Gen omp1 có đầu 5’ mang tính bảo tồn cao và 4 vùng thay đổi (từ VS1 đến VS4) mã hóa cho 4 phân đoạn protein trong cấu trúc của MOMP (VDI đến VDIV). Các quyết định kháng nguyên thường nằm trên vùng không biến đổi và một phần của vùng VDIV. Quyết định kháng nguyên liên quan đến các serovar của Cp. psittaci thường nằm ở vùng VDI và VDII (Andersen và Varompay, 2008). LPS (Lipopolysaccharide) trên thành tế bào cũng có tính kháng nguyên mạnh và thường biểu hiện như là kháng nguyên bề mặt ở các thể EB và RB. LPS có trọng lượng phân tử khoảng 10 kDa và mang các đặc tính giống như LPS của vi khuẩn đường ruột (Brade và cs., 1987; Newman và cs., 1992). Bằng kĩ thuật vi miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đơn dòng kháng protein màng ngoài (MOMP), các chủng Cp. psittaci gây bệnh trên gia cầm được xác định là thuộc 8 serovar (từ A đến F, M56 và WC) (Bảng 1.1) (Andersen, 1991; Vanrompay và cs., 1993a). Các serovar gây bệnh trên gia cầm thường mang tính đặc trưng loài. Serovar A thường liên kết với loài chim và có thể gây bệnh sang người; serovar B liên kết với bồ câu nhưng cũng đã được phân lập từ các loài chim khác. Các chủng thuộc serovar B có thể là mối nguy tiềm tàng cho sức khỏe người nuôi chim mặc dù khả năng gây bệnh của chúng có vẻ như thấp hơn so với các chủng thuộc serovar A. Serovar C được xác định lần đầu tiên trên các chủng Cp. psittaci phân lập từ vịt và ngỗng. Tuy nhiên, các chủng thuộc serovar C cũng đã được phân lập từ gà tây và gà gô. Các chủng Cp. psittaci phân lập từ gà tây chủ yếu thuộc serovar D. Ngoài ra serovar D cũng được phân lập từ diệc và mòng biển. Bác sĩ thú y và người tiếp xúc với gia cầm có nguy cơ cao nhiễm các chủng thuộc serovar D. Serovar E được phân lập đầu tiên vào thời điểm bùng phát bệnh viêm phổi suốt những năm đầu 1930. 8 Các chủng Cp. psittaci thuộc serovar E có thể gây bệnh cho rất nhiều loài động vật như bồ câu, vịt, gà tây, các loài chim chạy (ratile). Serovar F là các chủng phân lập được từ chim và gà tây. Serovar M56 phân lập được trên chuột xạ, chuột hương và thỏ rừng (Spalatin và cs., 1966). Serovar WC phân lập lần đầu tiên từ ổ dịch bò bị tiêu chảy (Page, 1967). Tất cả các serovar này đều có thể lây nhiễm cho con người (Woldehiwet, 2008). Bảng 1.1. Các serovar của Chlamydophila psittaci Serovar Chủng đại diện Vật chủ A VS1 Chim họ vẹt B CP3 Bồ câu C GR9 Vịt, ngỗng D NJ1 Gà tây E MN Bồ câu, gà tây F VS225 Chim họ vẹt M56 M56 Chuột xạ, thỏ rừng trắng Bắc Mỹ WC WC Gia súc 1.2.5. Độc lực của vi khuẩn Cp. psittaci Các chủng Cp. psittaci gây bệnh trên gia cầm thường có độc lực rất cao, gây bệnh ở thể cấp tính, có mức lây lan nhanh trong đàn gia cầm và ở cả người. Tỷ lệ gia cầm chết do mắc bệnh thể độc lực cao dao động khoảng 5-30%. Một số chủng có độc lực thấp thì gây bệnh ở thể mãn tính và tỷ lệ chết dưới 5%. Tuy nhiên, độc lực của các chủng Cp. psittaci còn phụ thuộc vào vật chủ, một số chủng thể hiện độc lực yếu trên gia cầm nhưng lại có độc lực rất mạnh trên một số loài vật khác. Hơn nữa, độc lực của Cp. psittaci có thể thay đổi giữa các loài chim hoang dã và gia cầm, thậm chí giữa loài chim và người (Woldehiwet, 2008; Vanrompay, 2008). Bệnh Chlamydophilosis trên gia cầm thường kết hợp với một số bệnh kế phát khác 9 như Salmonellosis. Trong trường hợp có kế phát, tỷ lệ gia cầm mắc bệnh, chết thường rất cao và mức độ lây nhiễm rất nhanh (Andersen và Vanrompay, 2008). Số loài gia cầm nhiễm Cp. psittaci ngày càng tăng. Theo Ito và cs. (2002), có khoảng 465 loài chim (kể cả gia cầm) được xác định là đã nhiễm Cp. psittaci. Tỷ lệ nhiễm Cp. psittaci cao nhất được phát hiện là ở trên loài vẹt và bồ câu. Khảo sát huyết thanh cho thấy có khoảng 16-81% loài vẹt nhiễm Cp. psittaci và tỷ lệ chết khoảng 50% (Raso và cs., 2002; Vanrompay, 2008). Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm Cp. Psittaci trên bồ câu là 35,9-60%, tỷ lệ này trên bồ câu hoang giao động khoảng từ 12,5-95,6% (Haag-Wackernagel, 2005; Laroucau và cs., 2005; Tanaka và cs., 2005; Geigenfeind và cs., 2011). Đây là nguồn gây nhiễm nguy hiểm cho gia cầm cũng như người tiếp xúc trực tiếp với loài vật nhiễm bệnh. 1.2.6. Con đường lây nhiễm Cp. psittaci Đường lây nhiễm Cp. psittaci chủ yếu là qua đường hô hấp do gia cầm tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bệnh hoặc tiếp xúc với phân, nước mũi mang mầm bệnh. Vi khuẩn Cp. psittaci xâm nhập vào cơ thể gia cầm qua đường hô hấp, sau đó nhân lên và sản sinh các thể EB, RB trong phổi, túi khí, màng ngoài tim và theo hệ thống mao mạch đến các cơ quan như gan, thận, lách. Sau 48 giờ lây nhiễm, vi khuẩn Cp. psittaci có thể được thải ra ngoài qua phân và nước mũi - đây là nguồn lây nhễm chủ yếu trong đàn và trong quá trình vận chuyển (Woldehiwet, 2008). Thời gian thải mầm bệnh có thể kéo dài đến 60 ngày sau khi nhiễm bệnh (Tappe và cs., 1989). Số lượng mầm bệnh thải qua dịch mũi thường cao hơn rất nhiều so với qua phân, đặc biệt trong giai đoạn đầu của quá trình lây nhiễm (Andersen, 1996). Vi khuẩn Cp. psittaci có thể lan truyền nhờ chuột, ve và ruồi (Longbottom và Coulter, 2003). Chim được xem là những vector lây truyền bệnh tốt nhất do chúng thường tiếp xúc với phân và xác động vật bị nhiễm bệnh và có tính động cao (Everett và cs., 1999b). 10 Quá trình lây truyền dọc qua trứng cũng có thể xảy ra nhưng với tỷ lệ thấp. Tuy nhiên, đây là nguồn lây nhiễm nguy hiểm trong những đàn gia cầm mang trùng (Wittenbrink và cs., 1993; Lublin và cs., 1996). 1.3. Triệu chứng bệnh Chlamydophilosis Thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độc lực của chủng vi khuẩn gây bệnh, số lượng vi khuẩn lây nhiễm, loài và độ tuổi của động vật mẫn cảm. Đối với gia cầm non nhiễm chủng độc lực cao thì thời gian ủ bệnh khoảng 5-10 ngày. Trong khi đó, ở gia cầm trưởng thành nhiễm chủng độc lực yếu thì thời gian ủ bệnh có thể kéo dài đến 60 ngày (Andersen và Vanrompay, 2008). Triệu chứng bệnh thường không rõ ràng trên gia cầm. Ở những đàn nhiễm chủng độc lực cao thường thể hiện triệu chứng là chết đột ngột trong vòng 5-14 ngày khi có sự thay đổi về điều kiện môi trường hay nhiễm khuẩn kế phát (Woldehiwet, 2008). Gia cầm mắc bệnh thể cấp tính thường biểu hiện mệt mỏi, xù lông, bỏ ăn, chảy nước mũi và viêm màng kết; có triệu chứng đường hô hấp như thở khò khè; có thể tiêu chảy phân xanh có màng nhầy và máu. Một số gia cầm mắc bệnh có thể có triệu chứng thần kinh như đi đứng mất thăng bằng, co giật (Andersen và Vanrompay, 2008; Vanrompay, 2008). Gà mắc bệnh thường chậm phát triển, giảm trọng lượng, bỏ ăn, tiêu chảy phân có chất nhầy màu vàng xanh, giảm đẻ hoặc ngừng hẳn ở gà sinh sản, gà có các triệu chứng đường hô hấp như chảy nước mũi, thở bằng miệng, viêm túi khí. Một số gà nhiễm bệnh có các triệu chứng ở mắt như chảy nước mắt, viêm kết mạc mắt (Woldehiwet, 2008). Gan thường chịu tác động đáng kể do bệnh gây ra và hiện tượng màu sắc lông không bình thường do biến đổi quá trình trao đổi chất cũng xảy ra ở chim bị nhiễm bệnh mãn tính (Billington, 2005). Các chủng thuộc serovar D gây bệnh nghiêm trọng nhất trên gà tây với các triệu chứng như viêm màng kết, viêm mũi, viêm xoang, viêm khí quản, viêm phổi, viêm màng ngoài tim, viêm đường ruột và giảm khả năng đẻ trứng. Tỷ lệ tử vong có 11 thể cao nếu không được xử lý kháng sinh sớm. Ngoài ra, chủng vi khuẩn thuộc serovar D đặc biệt nguy hiểm đối với người làm việc tiếp xúc với gia cầm, nhất là ở địa điểm chế biến gia cầm. Các dấu hiệu lâm sàng đối với gà tây bị nhiễm các serovar có độc tính thấp thường nhẹ hơn, bao gồm bệnh chán ăn và tiêu chảy (Vanrompay và cs., 1995b). Ngược lại, bồ câu hoang dã bị nhiễm bệnh là những vật mang vi khuẩn Cp. psittaci tiềm ẩn do giải phóng vi khuẩn qua phân, đường hô hấp và dịch tiết màng kết (Magnino và cs., 2009). Tuy nhiên, những dấu hiệu lâm sàng gồm bệnh chán ăn, tiêu chảy và các dấu hiệu ở đường hô hấp có thể xảy ra đồng thời với các bệnh khác như bệnh salmonela, bệnh tricomonas, và bệnh do virus gây ra (virus gây bệnh Herpes và virus gây bệnh quai bị) (Longbottom và Coulter, 2003). Vịt bị nhiễm bệnh cũng thường không biểu hiện triệu chứng nhưng nếu người tiếp xúc với chúng có thể mắc bệnh viêm phổi nghiêm trọng (Laroucau và cs., 2009). Trong một số trường hợp, các chủng Cp. psittaci có thể gây nhiễm ở các loài động vật có vú khác, như chó (Sprague và cs., 2009), ngựa (Theegarten và cs., 2008), và lợn (Kauffold và cs., 2006), đồng thời gây ra hiện tượng chết yểu và viêm phổi. 1.4. Bệnh tích bệnh Chlamydophilosis Bệnh tích bệnh Chlamydophilosis phụ thuộc vào loài cảm nhiễm và thời gian mắc bệnh. Gia cầm nhiễm chủng Cp. psittaci độc lực thấp thường ít thể hiện bệnh tích hơn so với gia cầm nhiễm chủng độc lực cao. Một trong những bệnh tích thường gặp ở gia cầm mắc bệnh là viêm màng thanh dịch; viêm màng ngoài bao tim; phổi xung huyết; màng túi khí mờ đục; gan, lách sưng to, dễ vỡ và có thể có những điểm hoại tử trên bề mặt. Một số ca bệnh có thể hiện viêm cơ tim, viêm phổi (Woldehiwet, 2008). Khi gia cầm mắc bệnh thể mạn tính, lách sưng to, gan có những khối u. Bệnh tích vi thể thường gặp là sự tăng sinh tế bào và xuất hiện các khối u kèm theo các biểu hiện viêm tại phế quản, phổi (Woldehiwet, 2008; Vanrompay, 2008). 12 1.5. Chẩn đoán bệnh Chlamydophilosis Phương pháp được sử dụng để chẩn đoán sự nhiễm Cp. psittaci gồm có bốn bước căn bản:  Bước một: Quan sát trực tiếp vi khuẩn trong mẫu lâm sàng bằng kĩ thuật nhuộm.  Bước hai: Phân lập vi khuẩn từ mẫu lâm sàng kèm theo định danh vi khuẩn được phân lập.  Bước ba: Phát hiện các kháng nguyên hoặc các gen đặc hiệu giống.  Bước bốn: Xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của đối tượng mắc bệnh cấp tính và đối tượng đang trong thời gian hồi phục sau khi mắc bệnh. 1.5.1. Thu thập và xử lý mẫu Mẫu thu thập, nhất là mẫu dùng cho phân lập vi khuẩn cần phải vô trùng nhằm tránh tạp khuẩn ảnh hưởng đến kết quả kiểm tra. Đối với chim đã chết thì ưu tiên lựa chọn các mẫu mô túi phổi, lá lách, màng bao ngoài tim, tim, gan, và thận. Đối với chim còn sống nên lấy mẫu dịch vòm họng và dịch lỗ huyệt (Andersen, 1996; Arizmendi và Grimes, 1995). Nếu mẫu được sử dụng cho phân lập, thao tác cần phải có độ chính xác nhằm ngăn chặn hiện tượng chết vi khuẩn do vận chuyển hay thao tác. Môi trường vận chuyển Rickettsia chứa sucrose-phosphate-glutamate (SPG) cũng có thể dùng làm môi trường vận chuyển Chlamydiae. Môi trường khuyến cáo sử dụng cho vận chuyển Chlamydiae gồm đệm SPG (đường sucrose, 74,6 g/lít; KH2PO4, 0,512 g/ lít; K2HPO4 1,237 g/lít; và L-glutamic acid 0,721 g/ lít) và có thể được hấp thanh trùng hoặc lọc (Spencer và Johnson, 1983). 13 1.5.2. Quan sát trực tiếp bằng phương pháp nhuộm Sử dụng các phương pháp nhuộm như Gimenez, Gimenez cải tiến (nhuộm PVK), và kỹ thuật nhuộm Giemsa (Andersen, 1998; Andersen, 2000). Các thể EB trong thử nghiệm Gimenez sẽ xuất hiện màu đỏ trên nền xanh lục. Phương pháp tế bào học và mô học để phát hiện Chlamydia là phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Kỹ thuật này nhạy hơn so với kỹ thuật nhuộm mô nhưng để giải thích được kết quả đòi hỏi phải có kinh nghiệm. 1.5.3. Phân lập vi khuẩn Cp. psittaci Quá trình phân lập có thể được thực hiện bằng việc gây nhiễm các mẫu vào lớp mỏng tế bào nuôi cấy, vào lòng đỏ trứng gà đã có phôi, hoặc chuột. 1.5.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là phương pháp thuận tiện nhất để phân lập các chủng Cp. psittaci gây bệnh trên gia cầm. Các dòng tế bào thường được sử dụng nhất để nuôi cấy vi khuẩn Cp. psittaci là McCoy, Hela, Vero, L929, và BGM. Phương pháp và môi trường nuôi cấy mô tiêu chuẩn đã cải tiến thường được sử dụng. Việc ngăn chặn sự phân chia của tế bào nuôi cấy là điều cần thiết nhằm đảm bảo dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn và cho phép quan sát lâu hơn các tế bào bị nhiễm trong quá trình nuôi cấy. Các tế bào chủ có thể bị ức chế bằng chiếu sóng bức xạ hoặc bằng các hóa chất gây độc tế bào (như cycloheximide) làm cho tế bào không thể phân chia (Herring và cs., 1986). Ly tâm vi khuẩn vào tế bào lớp đơn thường được sử dụng nhằm làm tăng tỷ lệ nhiễm. Sau khi gây nhiễm vi khuẩn, các tế bào nuôi cấy lớp đơn sẽ được xử lý (với methanol, acetone, hay hỗn hợp methanol và acetone và sau đó đem đi nhuộm để xác định các thể vùi.
- Xem thêm -