Tài liệu Khảo sát sự tạo thành hạt giống virus (virus like particle) bằng cách đồng chuyển gen ha, na, m1 vào tế bào cho k1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆCẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT SỰ TẠO THÀNH HẠT GIỐNG VIRUS (VIRUS LIKE PARTICLE) BẰNG CÁCH ĐỒNG CHUYỂN GEN HA, NA, M1 VÀO TẾ BÀO CHO-K1 Chủ nhiệm đề tài: ThS. Lao Đức Thuận Tp.HCM, tháng 10 năm 2013 IM U Vi c nghiên c u s bi u hi n các ti u ph n h t gi ng virus (VLPs, virus like particle) trên h th ng t bào ng v t ang c các nhà khoa h c trên th gi i quan tâm vì chúng mô ph ng l i c u trúc l p v c a virus nh ng không mang b gen c a virus. u này ã h a h n cho ra (vaccine VLPs) có i lo i vaccine ti u ph n h t gi ng virus an toàn cao, ti t ki m th i gian và chi phí s n xu t so v i các lo i vaccine truy n th ng. Hi n nay, các vaccine cúm nh vaccine gi m vaccine b t ho t… u c l c, c s n xu t theo công ngh truy n th ng là s n xu t trên tr ng gà có phôi hay nuôi c y virus trên t bào ng v t. Các vaccine này tuy ã và ang là công c c c k h u ích cho vi c ng n ng a và ch ng cúm mùa và cúm d ch nh ng v n còn t n t i nhi u khuy t i mùa d ch cúm nên d n m. Do các ch ng virus cúm l u hành trong u x y ra hi n t ng chuy n d i kháng nguyên (antigenic drift) n vi c s n xu t vaccine phòng ch ng d ch cúm còn g p nhi u khó kh n. s n xu t các lo i vaccine truy n th ng, các nhà s n xu t ph i phân l p và nuôi các ch ng virus s ng trên tr ng gà có phôi. toàn cho ng u này có th nh h ng i s n xu t b i vì chúng có kh n ng lây lan sang ng Ngoài ra, các vaccine cúm nh vaccine b t ho t hay vaccine gi m nguy c h i c, gây nh h ng n s c kh e c a ng n an i s n xu t. cl c u có i s d ng. Chính vì v y, vi c nghiên c u s bi u hi n VLPs ã tr thành m i quan tâm c a các nhà khoa h c trên th gi i v i mong mu n t o ra m t d ng vaccine th h m i có hi u qu và an toàn cao. M c dù trên th gi i ã có nh ng thành công nh t ng h th ng bi u hi n ti u ph n h t gi ng virus, nh ng t ít công trình nghiên c u liên quan nh i v i vi c xây i v i Vi t Nam v n còn n l nh v c này. i m c tiêu xây d ng mô hình bi u hi n ti u ph n h t gi ng virus trên t bào ng v t thông qua vi c chuy n gen HA, NA, M1 vào t bào và xa h n là tìm hi u c ch ho t tôi ti n hành ng v t h u nh ng cho m t mô hình VLP trong t tài nghiên c u “KH O SÁT S VIRUS (VIRUS LIKE PARTICLE) B NG CÁCH ng lai chúng T O THÀNH H T GI NG NG CHUY N GEN HA, NA, M1 VÀO T BÀO CHO-K1”. tài c th c hi n v i các n i dung chính sau: i. Xây d ng quy trình nuôi c y t bào CHO-K1 ii. Xây d ng quy trình bào ng chuy n ba vector mang gen HA, NA, M1 vào t ng v t h u nh . iii. Ch n l c dòng t bào mang gen n nh iv. Kh o sát s t o thành VLPs b ng ph n ng ng ng k t h ng c u và ph n ng c ch ng ng k t h ng c u, ch p hình kính hi n vi n t quét. CL C im u c l c .................................................................................................................... i Danh m c các ch ký hi u, các ch vi t t t ........................................................... iv Danh m c hình, b ng, s CH .................................................................................. vi NG 1. T NG QUAN TÀI LI U 1.1. Tình hình v d ch cúm H5N1 trên th gi i và Vi t Nam ................................... 1 1.2. Vaccine trong phòng ng a và u tr cúm ........................................................ 2 1.2.1. Vaccine truy n th ng.................................................................................. 2 1.2.2. Vaccine th h m i ..................................................................................... 2 1.3. Vaccine ti u ph n h t gi ng virus (vaccine VLP) ............................................. 4 1.3.1. u m c a vaccine ti u ph n h t gi ng virus ........................................... 4 1.3.2. Kh n ng áp ng mi n d ch c a vaccine VLP .......................................... 4 1.4. Tình hình nghiên c u vaccine VLP trên th gi i và trong n c ........................ 6 1.4.1. Trên th gi i ............................................................................................... 6 1.4.2. Trong n c ................................................................................................. 7 1.5. T ng quan ti u ph n h t gi ng virus (virus-like particle) .................................. 7 1.5.1. Hemagglutinin ............................................................................................ 9 1.5.2. Neuraminidase.......................................................................................... 11 1.5.3. Matrix protein........................................................................................... 14 1.6. H th ng bi u hi n c a VLP và m t s ph ng pháp ánh giá s bi u hi n VLP .............................................................................................................................. 16 1.6.1. H th ng bi u hi n VLP ........................................................................... 16 1.6.2. Ph ng pháp ánh giá s bi u hi n VLP d a trên ph n ng ng ng k t h ng u (Hemagglutination Assay) .......................................................................... 18 1.6.3. Ph ng pháp ánh giá d a trên ph n ng c ch ng ng k t h ng c u (Hemagglutination inhibition assay) ................................................................... 20 i 1.6.4. ánh giá hi u qu b o v c a vaccine thông qua mô hình ng v t thí nghi m (Challenge Tests) .................................................................................. 21 CH NG 2. V T LI U PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1. V t li u – hóa ch t .......................................................................................... 22 2.1.1. Hóa ch t ................................................................................................... 22 2.1.2. Dung d ch m, môi tr ng nuôi c y........................................................ 22 2.1.3. Hóa ch t tách plasmid t E. coli ã chuy n gene thành công .................... 23 2.1.4. Hóa ch t chuy n gene............................................................................... 23 n di........................................................................................ 23 2.1.5. Hóa ch t 2.1.6. Hóa ch t dùng c t n i gene m c tiêu .................................................... 24 2.1.7. Dòng t bào CHO-K1 ............................................................................... 24 2.1.9. H th ng vector s d ng trong tài ........................................................ 25 2.2. D ng c , thi t b ............................................................................................. 26 2.3. Ph ng pháp nghiên c u ................................................................................ 28 2.3.1. T o dòng vector pZIC mang các gene m c tiêu HA, NA, M1 ................... 28 2.3.2. Bi n n p vector mang gene m c tiêu pZIC HA, pZIC NA, pZIC M1 vào t bào E. coli TOP10F ............................................................................................ 29 2.3.3. Ph ng pháp duy trì dòng t bào CHO-K1 ............................................... 31 2.3.4. Ph ng pháp xây d ng 2.3.5. Xây d ng 2.3.6. Ph ng cong t ng tr ng CHO-K1 ....................... 31 ng cong gi t t bào b ng Zeocin ......................................... 32 ng pháp chuy n gene vào t bào CHO-K1 ........................................ 32 2.3.6.1. Ph ng pháp chuy n gene vào t bào CHO-K1 b ng LipofectamineTMReagent ................................................................................ 32 2.3.6.2. Ph ng pháp ch n l c dòng t bào mang gene chuy n thành công ..... 34 2.3.7. ánh giá s bi u hi n gen......................................................................... 34 2.3.7.1. ánh giá s bi u hi n gen thông qua ph ng pháp ng ng k t h ng c u ....................................................................................................................... 34 2.3.7.2. ánh giá s t o thành VLP thông qua ch p kính hi n vi CH NG 3. K T QU BI N LU N ii n t quét . 37 3.1. T o dòng vector pZIC HA, pZIC NA, pZIC M1 .............................................. 38 3.2. Kh o sát 3.2.1. c c m dòng t bào CHO-K1 ........................................................ 48 m nuôi c y dòng t bào CHO-K1 ................................................. 48 ng dòng t bào CHO-K1......................................... 50 3.2.2. ng cong t ng tr 3.2.3. ng cong gi t t bào b ng Zeocin ........................................................ 52 3.3. K t qu chuy n gen t m th i........................................................................... 54 3.4. Ch n l c dòng t bào n nh mang gene m c tiêu ......................................... 57 3.5. Ki m tra s hi n di n VLP b ng ph ng pháp ch p kính hi n vi n t quét (SEM) ................................................................................................................... 63 CH NG 4. K T LU N, KI N NGH TÀI LI U THAM KH O PH L C iii DANH M C CÁC CH KÝ HI U, CÁC CH µg microgram µl microlit AmpR Ampicillin Resistance BSA Bovine Serum Albumin CHO Chinese Hamster Ovary DHFR Dihydrofolate reductase DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EPO Erythropoietin EtBr EthidiumBromide PBS Phosphate Buffer Saline FBS Fetal Bovine Serum HA Hemagglutinin M1 Matrix protein 1 MDCK Madin Darby canine kidney NA Neuraminidase NP Nucleoprotein NST Nhi m s c th PCR Polymerase Chain Reaction Pen Penicillin RNPs Ribonucleprotein SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sias Sialic acid Strep Streptomycin VLP Virus-Like Particle ZeoR Zeocin Resistance iv VI T T T DANH M C HÌNH, B NG, S DANH M C HÌNH Hình 1.1. Mô hình gây áp ng mi n d ch VLPs. Hình 1.2. C u trúc hình thái c a virus cúm A và hình ch p d Hình 1.3. Hình thái VLPs quan sát d i kính hi n vi i kính hi n vi nt . nt . Hình 1.4. C u trúc c a phân t HA . Hình 1.5. Ho t tính phân c t c a NA t o kh i t bào v t ch . u ki n cho vi c phóng thích virus ra Hình 1.6. (A) C u trúc chu i polypeptide NA, (B) C u trúc trung tâm ho t vùng b o t n NA c a virus cúm N2. ng c a Hình 1.7. C u trúc tinh th hóa c a NA. Hình 1.8. Th th phân t HA (A), m i liên k t NeuAc 2,3Gal trên th th phân t HA (B) trên màng t bào v t ch , và s t ng tác gi a phân t HA c a virus v i th th phân t HA trên màng t bào v t ch thông qua m i liên k t NeuAc 2,3Gal. Hình 1.9. Quá trình xâm nh p vào t bào v t ch thông qua s hình thành liên k t gi a HA c a virus và th th phân t HA trên màng t bào v t ch . Hình 1.10. S mô t c u trúc vector mang gene HA, NA và M1 c a H9N1 VLP c bi u hi n trên Baculovirus. Hình 1.11. Ph n ng ng ng k t h ng c u. Hình 1.12. Dãy ph n ng d point c a ph n ng. ng tính, âm tính ng ng k t h ng c u và Hình 1.13. Ph n ng c ch ng ng k t h ng c u. Hình 2.1. C u trúc vector pZIC Hình 2.2. V trí c t gi i h n c a enzyme NotI (a) và NheI (b) Hình 2.3. M t s hóa ch t s d ng trong nghiên c u Hình 2.4. Quy trình chuy n gene b ng LipofectamineTMReagent Hình 2.5. Ph ng pháp l y h ng c u gà thông qua t nh m ch cánh v m end- Hình 2.6. S th c hi n ph n ng ng ng k t h ng c u Hình 3.1. K t qu sàng l c ban u t bào E. coli TOP10F sau khi bi n n p v i vector tái t h p pUC57-HA (hay pUC57-NA và pUC57-M1) trên môi tr ng ch n c 100 g/ml Ampicillin Hình 3.2. K t qu n di HA, NA, M1 c tách ra kh i plasmid pUC-HA, pUCNA, pUC-M1 sau khi x lý v i NotI và NheI. Hình 3.3. K t qu NA, pZic-M1 n di sàng l c gen HA, NA, M1 tách ra kh i pZic-HA, pZic- Hình 3.4. C u trúc vector tái t h p pZIC HA Hình 3.5. C u trúc vector tái t h p pZIC NA Hình 3.6. C u trúc vector tái t h p pZIC M1 Hình 3.7. T bào CHO-K1 có hình d ng nguyên bào s i, t ng sinh trong môi tr ng DMEM F12, b sung 10% FBS, 1% Kháng sinh Penicillin-Streptomycin (x100) Hình 3.8. T bào s ng (i) và t bào ch t (ii) nhu m Trypan Blue. Hình 3.9. Hình thái t bào CHO-K1 trong môi tr Hình 3.10. T bào CHO-K1 tr c ánh giá b ng ph ng pháp ng ch n l c kháng sinh Zeocin. c khi chuy n gen (x10) Hình 3.11. Hình nh t bào CHO-K1 sau 6 ti ng chuy n gen (x10) Hình 3.12. Ph n ng ng ng k t h ng c u d ch nuôi c y t bào CHO-K1 chuy n gen t m th i giai n Hình 3.13. T bào không ch a vector sát nh p vào b gen t bào CHO-K1 ch t sau 14 ngày ch n l c Hình 3.14. T bào CHO-K1 có vector sát nh p vào b gen s ng sót sau 14 ngày ch n l c. Hình 3.15. T bào mang gen m c tiêu t ng sinh thành t ng c m t bào sau ch n l c. Hình 3.16. Các t bào (x100). n sau 3 ngày nuôi c y trong môi tr vi ng không huy t thanh Hình 3.17. T bào CHO-K1 sau 5 ngày nuôi c y trong môi tr thanh (x10). ng không huy t Hình 3.18. Ph n ng ng ng k t h ng c u c a d ch t bào sau khi ch n l c b ng Zeocin 100 g/ml. Hình 3.19. K t qu ph n ng c ch ng ng k t h ng c u Hình 3.20. Hình ch p kính hi n vi mang gen m c tiêu n t quét m u d ch nuôi c y t bào CHO-K1 Hình 3.21. Hình ch p kính hi n vi không mang gen m c tiêu n t quét m u d ch nuôi c y t bào CHO-K1 DANH M C B NG ng 3.1. K t qu tách plasmid pUC57-HA, pUC57-NA, pUC57-M1 ng 3.2. M t t bào trung bình trong 3 l n thí nghi m ng 3.3. K t qu kh o sát Zeocin ng cong gi t t bào CHO-K1 b ng kháng sinh DANH M C BI U Bi u 3.1. ng cong t ng tr ng t bào CHO-K1 Bi u 3.2. ng cong gi ng t bào CHO-K1 b ng kháng sinh Zeocin vii 1.1. Tình hình v d ch cúm H5N1 trên th gi i và Vi t Nam Cúm gia c m (Avian Influenza) là b nh viêm nhi m do virus cúm gia c m (Avian Inflenza Virus, AIV) gây nên. Virus cúm này th loài chim nh ng nh k chúng có th bi n ng v t và con ng ng ch lây nhi m cho các i thành các th lây nhi m cho các loài i [12]. Trong ó, d ch cúm gia c m H5N1 tr thành m i quan tâm l n c a t ch c trên th gi i ch ng h n nh T ch c Y t th gi i (WHO), T ch c l ng th c th gi i (FAO) k t t bùng phát d ch cúm H5N1 vào n m 2003. Nguyên nhân là do s lây lan và bi n A/H5N1 i c u trúc hình thái, b gene c a virus cúm c bi t là ch ng virus cúm A/H5N1 có c l c cao (HPAI, Highly pathogeneic avian influenza) [23, 32]. Theo th ng kê c a t ch c FAO, k t n m 2003, H5N1 ã lây lan và gi t ch t h n 400 tri u con gia c m và t ng kinh phí thi t h i lên t i h n 20 t USD gây n th t kinh t n ng n . n n m 2006, trên th gi i ã có h n 63 qu c gia b nhi m cúm A/H5N1 (Hình 1.1) [12]. Ngoài ra, theo thông báo c a t ch c WHO, t m 2003 cho Trong ó, s tr n nay, trên th gi i ã có h n 601 ng ng h p t vong lên ca m c d ch cúm A/H5N1 t ca m c b nh và t vong ng n 354 ca, chi m 58,9%. Các qu c gia có s i cao là Ai C p, Indonesia và Vi t Nam. C th , các n c Ai C p, Indonesia, Vi t Nam l n l 59, 188/ 156, 123/ 61 [31]. Ch riêng n m 2012, nh là d i m c b nh cúm A/H5N1. Vi t Nam ã có 4 ca t là 166/ c xác ng tính v i cúm A/H5N1, trong ó 2 ca t vong (Theo th ng kê c c thú y, phát tri n nông thôn, 2012). Virus cúm A/H5N1 có kh n ng gây nên th lây nhi m trên ng ng mi n d ch t t. Tr i d ch cúm toàn c u do chúng có i, kh n ng gây t vong cao ng i ch a có kh n ng áp c tình hình lây lan và có nguy c tr thành trên th gi i ph i có nh ng công trình nghiên c u liên quan trúc, hình thái, s bi n phòng ch ng và i di truy n, u tr cúm H5N1. i d ch cúm, n vi c xác nh c u c bi t là nghiên c u vaccine trong vi c Vi t Nam, trong giai n n m 2006-2008, Vi n công ngh sinh h c ph i h p v i Vi n Thú y, Xí nghi p Thu c Thú Y Trung 1 ng (VETVACO), Công ty Thu c Thú Y Trung tâm Ki m nghi m thu c thú y trung giá ch t l ng II (NAVETCO), Trung ng cùng th c hi n nghiên c u ng vaccine cúm A/H5N1 cho gia c m tài “ ánh c s n xu t t i Vi t Nam b ng ch ng NIBRG-14” [2]. K t qu là nghiên c u và s n xu t thành công vaccine NAVET-VIFLUVAC phòng ch ng H5N1 trên gia c m. 1.2. Vaccine trong phòng ng a và u tr cúm 1.2.1. Vaccine truy n th ng Vaccine truy n th ng bao g m vaccine b t ho t (inactivated vaccine) và vaccine s ng gi m ã c l c. Vaccine b t ho t là vacccine ch a vi sinh v t hay virus c b t ho t b ng nhi t ho t hay hóa ch t. Vaccine b t ho t bao g m vaccine b t ng ch ng (homologous vaccine), ó là các lo i vaccine c s n xu t ch a cùng nh ng ch ng virus cúm gi ng nh ch ng gây b nh trên th c a. Vaccine b t ho t d ch ng (heterologous vaccine) là vaccine s d ng các ch ng virus có kháng nguyên HA gi ng ch ng virus trên th c Vaccine s ng gi m ng nh ng tr ng c l c là các lo i vaccine ch a các lo i vi sinh v t, virus còn c tính c làm gi m i. Các loài virus s ng c làm vô hi u i tính quan h gene t a, nh ng có kháng nguyên NA d ch ng. c c a chúng hay s d ng lo i virus khác có m i ng t nh ng không nguy hi m ng. Tuy nhiên, h u h t chúng c nuôi c y trong môi t o ra m t áp ng mi n d ch u là virus s ng ngoài t nhiên, th ng mi n d ch b n h n và ch thích h p cho ng ng gây ph n i kh e m nh. 1.2.2. Vaccine th h m i Vaccine th h m i là lo i vaccine c s n xu t d a trên các k thu t công ngh gene bao g m vaccine tái t h p, vaccine DNA, vaccine ti u ph n h t gi ng virus, Vaccine nh c c cúm nhân t o, Vaccine th h m i ch ng NIBRG-14… Vaccine DNA là lo i vaccine c phát tri n và thi t k d a trên DNA c a tác nhân gây b nh. DNA mã hóa cho protein c a vi khu n hay virus plasmid, chuy n plasmid vào t bào c chèn vào bi u hi n protein ó trong t bào ng ng v t, kích ho t s nh n di n c a h th ng mi n d ch. 2 i hay i v i d ch cúm H5N1, vaccine DNA c thi t k b i Kodihalli và cs vào n m 1999 b ng cách thi t k DNA plasmid tái t h p ch a các gene HA, NA,NP, M2 n l ho c a gene [17]. Vaccine ti u ph n h t gi ng virus (Virus like partical) là vaccine ch a h n p các protein chính trên v c a virus hay c l p v c a virus, thông th ti u ng là các n v Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) c a virus cúm. Vaccine ti u ph n h t gi ng virus H5N1 c thi t k ch a các ti u ph n H5 và N1. Hi n nay, vaccine ti u ph n h t gi ng virus v n ang c nghiên c u và phát tri n, ch u hi n nay s d ng trong vi c phòng ng a b nh d ch. Vaccine nh ng c c virus cúm nhân t o c s n xu t b ng k thu t di truy n c [59]. Hi n nay, T ch c Y t th gi i công nh n 3 lo i vaccine có cao và c khuy n cáo a vào ch an toàn ng trình s n xu t vaccine trên th gi i là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC). Hai ch ng cúm A/H5N1 cung c p ngu n gene H5 và N1 là A/VietNam/1194/2004 (H5N1) ho c A/VietNam/1203/2004 (H5N1). Các lo i vaccine này ã vào s d ng t i Vi t Nam t n m 2006 cho c nh p n nay [28]. Vaccine th h m i ch ng NIBRG-14: Ch ng NIBRG-14 là gi ng virus c dùng làm vaccine nh c c th h m i, thu c lo i hình vaccine gene b ng công ngh gene (genee-deletion vaccines) và thu t di truy n ng c l p ráp nhân t o b ng c (reverse geneetics-based technology) và kích thích nhân lên khi nuôi c y trên phôi gà. Ph ch ng virus nhân t o nh NIBRG-14 này c lo i b c c tái t ng pháp di truy n ng c c s d ng t o ra c làm vaccine, c th h gene c a ch ng nhân t o h p gene trên c s s d ng ch ng g c PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)) cung c p 6 gene khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làm n n, còn các gene kháng nguyên H5 và N1 ng c l y t ch ng cúm c gây b nh phân l p n m 2004 t i Vi t Nam (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)) [28]. V m t mi n d ch h c, m c dù virus nh nh ng v n gi nguyên b n ch t c x lý làm m t c tính gây c tính kháng nguyên b m t gi ng h t nh 3 virus cúm A/H5N1 ã l y m u ban u. Do v y, vaccine có kh n ng t o kháng th kháng l i kháng nguyên b m t lo i virus H5N1 gây b nh trong t nhiên [28]. 1.3. Vaccine ti u ph n h t gi ng virus (vaccine VLP) 1.3.1. u m c a vaccine ti u ph n h t gi ng virus [9, 24, 26, 27] Vaccine ti u ph n h t gi ng virus ã c nghiên c u ng d ng trong vi c n xu t vaccine trong 20 n m tr l i ây mang l i có nhi u l i th trong vi c áp ng mi n d ch. Hi n nay, trên th gi i có h n m a trên h t gi ng virus và ã i lo i vaccine ã c s n xu t c ki m nghi m lâm sàng nh vaccine kháng hepatitis B và human papilloma virus c ng d ng th c t trong vi c phòng ch ng b nh HBV và HPV. Giá tr c a vaccine d a trên h t gi ng virus là mô ph ng i hình thái c u t o c a virus mang l i nhi u u m bao g m: an toàn vaccine: do vaccine h t gi ng virus mô ph ng l i hình thái c u trúc c a virus và không ch a các v t ch t di truy n DNA hay RNA nên tính an toàn cho ng mb o i s d ng vaccine. Tính áp ng mi n d ch m nh: VLP có c u trúc không gian 3 chi u (3D structure) nên vaccine VLP có tính kháng nguyên m nh, có kh n ng kích thích h mi n d ch r t chuyên bi t. d ng tá d ng th i, vi c s n xu t vaccine VLP h u nh không c n c. Do ó giúp có th tránh m khi s d ng tá d c các ph n ng viêm và m t s nh c c có th gây ra. n xu t vaccine VLP theo ph ng pháp t o dòng (Cloning) có giá thành s n xu t th p h n so v i s n xu t vaccine theo ph ng pháp truy n th ng. 1.3.2. Kh n ng áp ng mi n d ch c a vaccine VLP VLPs có kh n ng gây áp ng mi n d ch d ch th và qua trung gian t bào (cellular and humoral responses) m nh nh m t kháng nguyên tr c ti p [9]. Do kích th c VLPs t ng i l n (120 nm) nên t o u ki n thu n l i cho các t bào tua (Dendritic cells, DCs) nh n di n và x lý trình di n kháng nguyên thông qua con ng m bào (macropinocytosis) hay nh p bào. Quá trình này có vai trò quan 4 tr ng trong vi c gây áp ng mi n d ch b m sinh hay áp ng mi n d ch chuyên bi t. VLPs ch a nhi u epitope có tính l p l i nên VLPs vaccine có kh n ng làm ng c ng hi u qu áp ng mi n d ch d ch th , áp ng qua trung gian t bào thông qua l p MHC-I và MCH-II [9], t ó c m ng ho t hóa các t bào CTL và các bào TH trong quá trình áp ng mi n d ch. Mô hình ho t hóa DCs b i các VLPs: VLPs c ti p nh n b i các t bào DCs thông qua c ch nh p bào. Sau khi các VLPs xâm nh p vào bên trong các t bào DCs s c x lý b i các endosome và trình di n kháng nguyên thông qua l p MHC-II hay thông qua th th c trình phân c t kháng nguyên trong t u hòa b i gp64 k t qu là kích ho t quá ng bào b i các proteosome và sau ó trình di n kháng nguyên b i l p MHC-I. Ti p theo, các t bào tua c c ho t hóa i s trình di n kháng nguyên l p MHC-I và MHC-II v i t bào T CD4+ và CD8+. Các cytokine, IL-12, TNF … kích thích các t bào T CD4+ và CD8+ bi t hóa thành bào T gây c (CTLs) và t bào T h tr t bào B bi t hóa t kháng th . Tuy nhiên, c ch t riêng v n ch a ng bào s n xu t ng tác gi a VLPs nói chung và H5N1 VLPs nói c nghiên c u m t cách rõ ràng. 5 Hình 1.1. Mô hình gây áp ng mi n d ch VLPs. (A) T bào DCs th c bào VLPs, lý trình di n kháng nguyên qua l p MHC-I và MHC-II. (B) Quá trình ho t hóa t bào DCs tr ng thành, trình di n kháng nguyên v i t bào T CD4+ và CD8+, bi t hóa thành t bào T hi u qu [9]. 1.4. Tình hình nghiên c u vaccine VLP trên th gi i và trong n c 1.4.1. Trên th gi i Các công trình chuy n gene mã hóa các kháng nguyên b m t HA (Hemagglutinin), NA (neuraminidase) và M1 (Matrix protein 1) c a virus cúm H5N1 nh m bi u hi n h t gi ng virus (Virus-Like Particle, VLP) trên mô hình t bào ng v t ã c th c hi n r ng rãi trên th gi i. Wei và c ng s t i Vi n y t qu c gia (NIH) và Trung tâm phòng ch ng b nh d ch Hoa K ng mi n d ch chéo trên chu t, ch n, linh tr ã t o thành công áp ng b ng cách tiêm plasmid mang gene mã hóa cho HA c a ch ng virus H1N1. Kháng th sinh ra có kh n ng trung hòa tr c ti p HA, qua ó m ra m t tri n v ng t o vacxin kháng a ch ng virus cúm trong t ng lai. Vào n m 2005, Galazar và c ng s ã thành công trong vi c n xu t h t gi ng virus b ng cách chuy n gene HA, NA, M1 trên t bào Sf9 [1]. Ti p n vào n m 2007, Quan và c ng s th nghi m thành công trong vi c gây áp ng mi n d ch i v i virus cúm thông qua vi c c m ng mi n d ch b ng VLP [2]. Nh ng công trình này t giai ng v t c xem nh là nh ng ti n u tiên m u cho n s n xu t vaccine th h m i. Ngoài ra, theo công b c a t p chí “The new England Journal of Medicine” vào n m 2010, h t gi ng virus H5N1 ã bi u hi n thành công b ng vi c chuy n gene mã hóa kháng nguyên HA, NA, M1 vào t bào th ng vector bi u hi n Baculovirus. vaccine VLP và ng v t Sf9, MDCK… b ng ng th i, công b ã s n xu t thành công a vào th nghi m lâm sàng mang hi u qu Nh ng thành công này kh ng nh vi c s n xu t VLP b ng t bào áp ng t t [3]. ng v t có tri n ng s n xu t vaccine th h m i: vaccine VLP mang tính an toàn, nhanh và gây áp ng mi n d ch cao. 6 1.4.2. Trong n c Vi t Nam, hi n nay ch a có m t công trình nghiên c u c th liên quan vi c chuy n gene mã hóa HA, NA, và M1 c a H5N1 vào t bào ng v t nh m s n xu t vaccine h t gi ng virus. Tuy nhiên, m t s các công trình nghiên c u liên quan n vi c chuy n gene HA bi u hi n kháng nguyên b m t HA hay kh o sát m t m phân t các gene HA, NA, M1 c a H5N1 ã n hình, Nguy n Huy Hoàng và cs c th c hi n, nghiên c u. i h c Tây Nguyên và vi n Công ngh sinh h c (VAST) ã nghiên c u th c hi n thi t k thành công vector mang c u trúc gene HA1 bi u hi n kháng nguyên b m t virus cúm A/H5N1 th c v t. Ngoài ra, trình t gene c a virus cúm gia c m H5N1 t i t nh Sóc Tr ng, Cà Mau và khu v c mi n B c c kh o sát thành công. Bên c nh ó, r t nhi u công trình nghiên c u liên quan n vi c nghiên c u s n xu t protein thông qua vi c chuy n gene mã hóa protein t protein ã ng ng vào ng v t ã c th c hi n thành công. Ch ng h n nh c s n xu t thành công b ng ph ng pháp chuy n gene vào t bào CHO-K1 là EPO (Erythropoietin) [4, 6], m t nhân t quan tr ng trong vi c kích s n sinh h ng c u và protein tPA (tissue Plasminogene Activator), nhân t ho t hóa ch ng ông máu. Các protein EPO c ng nh tPA ã ty sinh d c th ng m i hóa b i công c ph m Nanogene [7]. Cùng v i nhu c u c p thi t trong vi c s n xu t vaccine phòng ch ng d ch cúm gia c m, nh ng thành công này là ti n khoa h c cho vi c nghiên c u chuy n gene HA, NA, M1 vào t bào n xu t vaccine h t gi ng virus có , n n t ng ng v t nh m an toàn cao, s n xu t nhanh và áp ng mi n ch t t. 1.5. T ng quan ti u ph n h t gi ng virus (virus-like particle) [10, 11, 18, 24, 32] Virus cúm (Influenza virus) là tác nhân gây b nh hô h p trên ng t vong cao trên th gi i. Virus cúm là virus có v Orthomyxoviridae, h th ng di truy n c a virus cúm là các (segmented negative sense RNA geneome) [19]. 7 i có m c b c thu c h n RNA s i âm hình thái, virus cúm có nhi u hình d ng khác nhau nh (spherical) có hình c u ng kính kho ng 50-100 nm hay d ng hình s i (filamentous) v i ng kính 20 nm, chi u dài t 200-300 nm. C u trúc l p v c a virus bao ph b i các glycoprotein HA (Hemagglutinin), NA (Neuraminidase) và protein M2 (Matrix protein). HA và NA còn c g i là kháng nguyên c a virus (viral antigeneicity). Cho c 16 nhóm HA, 9 nhóm NA và n nay ã xác n H16, N1 nh n N9. M i lo i virus c ánh d u t H1 c ánh d u ký hi u b ng s k t h p gi a hai nhóm H và N, ch ng h n nh là H1N1, H1N2, H5N1… Ba nhóm H1-H3 và N1N2 ã c phát hi n trên ng (n u v t ch là ng i. Danh pháp c a virus bao g m type virus, v t ch i thì không c n ký hi u), n i phát hi n, s th t phân l p, n m phân l p và cu i cùng là ghi ký hi u bi n th H và N. Ví d virus cúm A phân l p ng i, n i phân l p HongKong, s th t phân l p là 3, và phân l p vào n m 1968 c ký hi u A/HongKong/03/1968 (H3N2) [20]. Bên trong lõi c a virus cúm là ph c h p ribonucleoprotein (RNPs) hình thành t các n phân t RNA v i các protein PB1, PB2 (polymerase protein) và NP (nucleoprotein). Ngoài ra, nhân virus còn ch a protein v n chuy n t nhân ra t bào ch t (Nuclear export protein, NEP) và protein phi c u trúc (nonstructural protein, NS1). Hình 1.2. C u trúc hình thái c a virus cúm A và hình ch p d [12]. 8 i kính hi n vi nt Vi c s d ng vaccine truy n th ng tuy mang l i hi u qu cao trong vi c phòng ch ng l i s lây lan c a virus cúm thông qua quá trình áp ng mi n d ch a c th i v i virus cúm. Tuy nhiên, ph n t i nhi u gi i h n và khuy t ng pháp vaccine truy n th ng v n còn mv m c an toàn, hi u qu th p và chi phí cao trong s n xu t… Vaccine truy n th ng không mang l i hi u qu cao trong m i mùa d ch cúm do ch ng virus cúm l u hành trong m i mùa u x y ra hi n t ng chuy n d i kháng nguyên (antigeneic drift of circulating). Do ó các nhà s n xu t vaccine òi h i ph i s n xu t ch ng vaccine m i n n a vi c xác n áp ng v i hi n t nh ch ng virus cúm m i t n nhi u th i gian t 6 n vi c phòng ch ng ch ng virus m i không ng này. n 9 tháng t hi u qu cao. Vi c khám phá ra các ti u ph n h t gi ng virus (VLP) m ra m t h ng nghiên c u m i trong vi c n xu t vaccine ti u ph n h t gi ng virus (VLP vaccine) có hi u qu cao trong vi c phòng ch ng d ch cúm [9]. VLP có kích th i hình thái l p v ch a m t l c trung bình t 20-150 nm mô ph ng ng l n các protein kháng nguyên v c a virus nh HA, NA, M1 và không ch a v t li u di truy n nên chúng không có kh n ng lây nhi m gây nên d ch b nh nh ng mang l i áp ng mi n d ch cao [11]. Các glycoprotein HA, NA, M1 có vai trò quan tr ng trong quá trình áp ng mi n d ch i virus cúm. Hình 1.3. Hình thái VLPs quan sát d i kính hi n vi nt . 1.5.1. Hemagglutinin [10, 12, 30] Hemagglutinin (HA) là glycoprotein hi n di n trên b m t c a virus cúm có vai trò quan tr ng trong quá trình u hòa s xâm nhi m c a virus vào t bào ch 9 thông qua hình thành liên k t gi a HA v i các th th trên b m t t bào v t ch . Phân t HA có d ng hình que (rod-shape) bám trên l p v c a virus và có c u trúc tam phân g m 566 amino acid và có tr ng l Phân t HA g m hai vùng: vùng ng phân t vào kho ng 76000 KD. u có d ng hình c u (globular domain) và ph n thân (stem domain). C u trúc tam phân c a phân t HA phân HA1, HA2 và HA3. M i m t c hình thành t ba n n phân này bao g m hai ti u ph n (subdomain), ph n thân c a phân t HA g m hai chu i xo n peptide A và B g n k t i nhau t i v trí Phe-88 v i Phe-63, t i v trí liên k t này có s khác nhau gi a các dòng virus khác nhau. Ch ng h n i v i virus H5N1, v trí liên k t này hình thành t vòng Phenylalanine lõm vào bên trong, trong khi ó dòng virus H1- l i hình thành m t vòng l i ra bên ngoài. T i vùng u c a phân t HA bao g m hai c u trúc chu i protein là chu i xo n alpha và t m beta. T m beta có ch c n ng hình thành vùng g n k t v i chu i sialic acid trên t bào v t ch , chu i xo n alpha hình thành vùng thân c a phân t HA [12]. Ngoài ra, vùng u c a phân t HA có ch a 5 v trí kháng nguyên là Ca1, Ca2, Cb, Sa và Sb [18]. Hình 1.4. C u trúc c a phân t HA [18]. xâm nh p c a virus cúm òi h i ph i hình thành s liên k t gi a phân t HA v i th th phân t HA trên b m t t bào v t ch . Th th trên b m t t bào 10