Tài liệu Khảo sát sự biến đổi 4 allylpyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu hóc môn (piper betle l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  TRẦN NGUYỄN NGỌC CHÂU KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI 4-ALLYLPYROCATECHOL DIACETATE VÀ CHAVIBETOL ACETATE THÀNH CHAVIBETOL TRONG TINH DẦU LÁ TRẦU HÓC MÔN (PIPER BETE L.) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số : 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS CHU PHẠM NGỌC SƠN 2. TS. NGUYỄN TRUNG NHÂN Tp. Hồ Chí Minh, 2012 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, ủng hộ và sự giúp đỡ tận tình của người thân, thầy cô và bạn bè. Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến GS.TS.Chu Phạm Ngọc Sơn, GS Nguyễn Xích Liên, TS. Nguyễn Thị Ánh và TS.Nguyễn Trung Nhân những người thầy cô đã tận tụy, nhiệt tình hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn chú Huỳnh Kỳ Trân, chị Hà Mỹ Thuận, anh Nguyễn Khoa Nam, các anh chị Viện công nghệ đào tạo và phát triển, công ty mỹ phẩm Thorakao và công ty sắc ký Hải Đăng đã tạo điều kiện tốt, truyền đạt kinh nghiệm quý báu trong quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài. Em xin cảm ơn quý Thầy, Cô Khoa Hóa đặc biệt là Quý Thầy Cô bộ môn Hóa hữu cơ đã hết lòng giảng dạy và truyền đạt cho em nhiều kiến thức khoa học bổ ích cũng như phương pháp nghiên cứu khoa hoc. GS.Võ Văn Chi, đã giúp em xác định tên khoa học của cây Trầu Không. Cuối cùng, là sự biết ơn sâu sắt đối với gia đình là nguồn động viên to lớn, luôn sát cánh và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong từng chặng đường đi qua cho đến khi hoàn thành luận văn này. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT  Ký hiệu, chữ viết tắt Ý nghĩa APC (4-allylpyrocatechol) Là một thành phần phenolic có trong lá trầu CHV (chavibetol) Là một thành phần phenolic có mặt trong tinh dầu lá trầu HTCO% (hoạt tính chống oxi hóa) % khả năng chống oxi hóa của chất chống oxi hóa MIC (minimum inhibitory Nồng độ chất tối thiểu có khả năng tiêu diệt concentration) hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) Gốc tự do sử dụng trong phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự do TLC (thin layer chromatography) Phương pháp sắc ký bản mỏng MeOH (methanol) Dung môi, sử dụng trong thử hoạt tính thu gom gốc tự do và trong phân tích GC-MS (Gas Chromatography-Mass Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ Spectrometry) LC-MS/MS (Liquid Chromatography- Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần Tandem Mass Spectrometry) NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HSQC : tương quan H-C qua 1 nối (Heteronuclear Single Quantum Coherence) HMBC : tương quan H-C qua 2, 3 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) s : mũi đơn (singlet) d : mũi đôi (doublet) dd : mũi đôi - đôi (doublet-doublet) m : mũi đa (multiplet) J : hằng số ghép (coupling constant) STT : số thứ tự DANH MỤC CÁC BẢNG  Bảng 1.1: Thành phần hoá học của lá trầu ......................................................................... 5 Bảng 2.1: Quy trình test MDA .......................................................................................... 41 Bảng 3.1: Thành phần hoá học của lá trầu Hóc Môn ........................................................ 42 Bảng 3.2: Thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu già và non vùng Hóc Môn ............... 43 Bảng 3.3: Hiệu suất và phần trăm các hợp chất phenolic trong tinh dầu theo cách xử lý lá trầu trước khi chưng cất..................................................................... 44 Bảng 3.4: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất APC. .............................................................. 49 Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 ..................................................................... 53 Bảng 3.6: Dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR của C1 và chavibetol được ghi trong cùng dung môi chloroform ............................................................................. 54 Bảng 3.7: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 3 ..................................................................... 57 Bảng 3.8: Số liệu đường chuẩn của chavibetol ................................................................. 58 Bảng 3.9: Số liệu đường chuẩn của chavibetol acetate ..................................................... 58 Bảng 3.10: Số liệu đường chuẩn của 4-allypyrocatechol diacetate ................................... 58 Bảng 3.11: Số liệu đường chuẩn của APC ........................................................................ 59 Bảng 3.12: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá trầu tươi ............................................... 60 Bảng 3.13: Kết quả so sánh sự chuyển đổi ở lá tươi ......................................................... 62 Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá trầu khô ............................................... 63 Bảng 3.15: Kết quả so sánh của lá khô ............................................................................. 64 Bảng 3.16: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá trầu chưng cất bằng vi sóng ................ 65 Bảng 3.17: Kết quả so sánh của lá tươi chưng cất vi sóng ................................................ 66 Bảng 3.18: Thành phần tinh dầu trước và sau chưng cất lại của muối bão hòa ................ 68 Bảng 3.19: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá tươi có thêm MgCl2 ............................. 69 Bảng 3.20: Kết quả so sánh của lá tươi chưng cất không muối có thêm MgCl2 ............... 69 Bảng 3.21: Kết quả phân tích mẫu tinh dầu từ lá tươi chưng cất không muối tại pH=8 ............................................................................................................... 70 Bảng 3.22: Kết quả so sánh của lá tươi trong nước có pH=8 ............................................ 71 Bảng 3.23: So sánh khả năng bắt gốc tự do DPPH của 4 mẫu và acid ascorbic ............... 74 Bảng 3.24: So sánh ức chế peroxy hóa lipid của 4 mẫu và acid ascorbic ......................... 76 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ  Hình 1.1: Hình thái bên ngoài của cây trầu ....................................................................... 2 Hình 1.2: Lá trầu ............................................................................................................... 2 Hình 1.3: Hoa trầu ............................................................................................................ 2 Hình 1.4 Hình ảnh cây trầu và vườn trầu của nhà Ông Tư Kích, tại địa chỉ: 56/1A Nguyễn Thị Sóc, tổ 5, ấp Hưng Lân, xã Bà Điểm, Huyện Hóc Môn. .................................................................................................................. 4 Hình 1.5: Khối phổ của eugenol, isoeugenol và chavibetol trong thư viện NIST ........ 11 Hình 1.6: Tâm hoạt động của enzyme............................................................................. 20 Hình 1.7: Sơ đồ biểu diễn trung tâm hoạt động enzyme và vách kỵ thủy. ............................ 21 Hình 1.8: Metyl hóa tại vị trí meta đuôi R của L-DOPA tránh xa vách kỵ nước. ......... 23 Hình 1.9A: O-metyl hóa xảy ra tại nhóm –OH vị trí para ................................................ 24 Hình 1.9C: O-metyl hóa xảy ra tại nhóm –OH vị trí meta ................................................ 24 Hình 2.1: Hệ thống chưng cất tinh dầu dùng trong nghiên cứu ...................................... 27 Hình 2.2: Thiết bị phân tích sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS một tứ cực và sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS ba tứ cực ................................................ 28 Hình 2.3: Sơ đồ chưng cất tinh dầu lá trầu bằng phương pháp truyền thống lôi cuốn theo hơi nước ......................................................................................... 29 Hình 2.4: Sơ đồ cách xử lý mẫu lá tươi trước khi chưng cất để theo dõi sự biến đổi của các dẫn xuất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu ............................ 36 Hình 2.5: Sơ đồ cách xử lý mẫu lá khô trước khi chưng cất để theo dõi sự biến đổi của các dẫn xuất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu ............................ 37 Hình 2.6 : Phương trình phản ứng của DPPH......................................................................... 38 Hình 2.7 : Phương trình phản ứng của MDA ......................................................................... 40 Hình 3.1: Sắc đồ GC-MS của hợp chất APC do chúng tôi cô lập được ......................... 46 Hình 3.2: Sắc đồ và khối phổ MSMS của hợp chất 4-allylpyrocatechol 6 ..................... 47 Hình 3.3: Cơ chế phân mảnh của APC ........................................................................... 48 Hình 3.4: Các tương quan HMBC của hợp chất APC ...................................................... 49 Hình 3.5: Sắc đồ GC-MS của hợp chất Chavibetol do chúng tôi cô lập được.................. 51 Hình 3.6: Các tương quan HMBC của hợp chất 1 .......................................................... 52 Hình 3.7: Các tương quan HMBC của hợp chất 3 ............................................................ 56 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn khả năng bắt gốc tự do DPPH của 4 mẫu nghiên cứu ........... 75 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế peroxy hóa lipid của 4 mẫu nghiên cứu ...................................................................................................................................... 77 MỤC LỤC  Trang số Lời cám ơn ............................................................................................................................i Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt............................................................................... ii Danh mục các bảng ............................................................................................................ iii Danh mục các hình vẽ, đồ thị ..............................................................................................iv Mở đầu ................................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................. 2 1.1. Đặc điểm thực vật ....................................................................................................... 2 1.1.1. Mô tả thực vật ........................................................................................................ 2 1.1.2. Phân bố sinh thái .................................................................................................... 3 1.2. Thành phần hóa học của cây trầu ............................................................................. 5 1.2.1. Thành phần hoá học của cây trầu ........................................................................... 5 1.2.2. Thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu ................................................................ 8 1.2.2.1 Thành phần hợp chất phenolic trong lá trầu được nghiên cứu trên thế giới ............................................................................................................................ 8 1.2.2.2. Thành phần hợp chất phenolic trong lá trầu được nghiên cứu tại Việt Nam ................................................................................................................................ 9 1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng ............................................................................. 12 1.3.1. Hoạt tính sinh học của lá trầu ............................................................................... 12 1.3.2. Công dụng của lá trầu ............................................................................................ 16 1.3.2.1. Theo y học cổ truyền ....................................................................................... 16 1.3.2.2.Theo y học hiện đại .......................................................................................... 17 1.4 Tổng quan về Catechol O-methyltransferase ......................................................... 18 1.4.1. Cơ chế phản ứng.................................................................................................... 18 1.4.2. Cấu trúc tâm hoạt động ........................................................................................ 20 1.4.3. Độ chọn lọc của phản ứng .................................................................................... 20 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 26 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và các thiết bị đo đạc ........................................... 26 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................... 26 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................................ 26 2.1.3. Dụng cụ và các thiết bị đo đạc .............................................................................. 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 29 2.2.1. Trích ly tinh dầu lá trầu bằng phương pháp truyền thống lôi cuốn theo hơi nước .................................................................................................................................... 29 2.2.2. Các phương pháp xác định thông số nghiên cứu .................................................. 30 2.2.2.1.Xác định hàm lượng tinh dầu có trong lá trầu .................................................. 30 2.2.2.2.Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS ..................................................................................... 31 2.2.2.3.Cô lập 4-allylpyrocatechol (APC),chavibetol (CHV) bằng phương pháp sắc ký cột và điều chế dẫn xuất. ..................................................................... 31 2.2.2.4.Định lượng APC trong phần nước còn lại sau khi đã chưng cất lấy tinh dầu lá trầu bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS ............................ 33 2.2.2.5. Định lượng chavibetol, chavibetol acetate, 4-allylpyrocatechol diacetate trong tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS ................ 34 2.2.3. Theo dõi sự biến đổi của các thành phần phenolic chính trong tinh dầu lá trầu theo các cách xử lý lá trước khi chưng cất ................................................................. 35 2.2.4. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa ........................................................................ 38 2.2.4.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm DPPH. ................. 38 2.2.4.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd ...................................................................................................................... 39 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 42 3.1. Thành phần hóa học của lá trầu Hóc Môn ............................................................. 42 3.2. Khảo sát sự thay đổi của phần trăm chất 1,2 và 3 với cách xử lý lá trầu trƣớc khi chƣng cất ............................................................................................... 44 3.2.1. Khảo sát sơ bộ sự thay đổi .................................................................................. 44 3.2.2. Điều chế các chất chuẩn ...................................................................................... 45 3.2.2.1. Cô lập APC.................................................................................................... 45 3.2.2.2. Cô lập Chavibetol .......................................................................................... 50 3.2.2.3. Điều chế chavibetol acetate và 4-allylpyrocatechol diacetate ...................... 54 3.2.3. Xây dựng các đường chuẩn ................................................................................. 58 3.2.3.1. Đường chuẩn của chavibetol ......................................................................... 58 3.2.3.2. Đường chuẩn của chavibetol acetate ............................................................. 58 3.2.3.3. Đường chuẩn của 4-allylpyrocatechol diacetate ........................................... 58 3.2.3.4. Đường chuẩn 4-allylpyrocatechol (APC) ..................................................... 59 3.2.4. Định lượng sự chuyển đổi hợp chất 3 ra hợp chất 4 và 1 ................................... 59 3.2.4.1. Định lượng ở lá tươi ...................................................................................... 59 3.2.4.2. Định lượng ở lá khô ....................................................................................... 62 3.2.4.3. Định lượng với mẫu chưng cất dưới vi sóng ................................................. 64 3.2.5. Nhận định về sự chuyển đổi ................................................................................ 66 3.2.5.1. Chưng cất tinh dầu trong nước khử ion ........................................................ 68 3.2.5.2. Chưng cất tinh dầu trong nước không có muối NaCl, nhưng có thêm muối MgCl2.6H2O ......................................................................................... 68 3.2.5.3. Ảnh hưởng của pH ........................................................................................ 70 3.2.6. Lý giải độ chọn lọc của phản ứng metyl hóa ..................................................... 72 3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học ................................................................................ 73 3.3.1. Kết quả thử nghiệm khả năng bắt gốc tự do DPPH .......................................... 74 3.3.2. Khả năng ức chế peroxy hóa lipid của các mẫu nghiên cứu .............................. 75 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 78 4.1. Kết luận ...................................................................................................................... 78 4.1.1. Về mặt hóa học ........................................................................................................ 78 4.1.2. Về hoạt tính sinh học ............................................................................................... 79 4.2. Kiến nghị .................................................................................................................... 79 CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LUẬN ÁN ................ 80 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ PHỤ LỤC .............................................................................................................................. Khảo sát sự biến đổi 4-allypyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper betel L.) MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, gió mùa, rất thuận lợi cho thực vật phát triển, trong đó có cây trầu. Ở Thành phố Hồ Chí Minh, trầu trồng nhiều ở Hóc Môn, nổi tiếng là 18 thôn vườn trầu. Cây trầu có nguồn gốc ở miền Trung và Đông Malaysia, được trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới Châu Á, việc trồng trầu gắn liền với tập tục ăn trầu và làm thuốc chữa bệnh trong dân gian. Riêng ở Việt Nam, cây trầu đã đi vào truyền thuyết dân tộc, không thể thiếu trong nền văn hóa dân gian Việt Nam. Theo đông phương và y học cổ truyền, lá trầu có vị cay, nồng, tính ấm, mùi thơm hắc. Trong nước, chủ yếu người ta chỉ dựa vào truyền khẩu dân gian để nói lên tác dụng của lá trầu và cũng chỉ mới có vài nghiên cứu về tách chiết tinh dầu từ lá trầu. Cho đến nay, vẫn chưa có công trình nghiên cứu sâu nào về thành phần hóa học và sự chuyển đổi giữa các hợp chất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu. Do đó, đề tài này mong muốn góp phần nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc các dẫn xuất phenolic chính trong tinh dầu lá trầu đồng thời khảo sát sự biến đổi của các hợp chất phenolic tùy theo phương thức xử lý lá trước khi chưng cất lá trầu. Thử nghiệm tính kháng oxi hóa của các hợp chất phenolic chính này. HVCH: Trần Nguyễn Ngọc Châu 1 Khảo sát sự biến đổi 4-allypyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper betel L.) CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN  1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY TRẦU [1][3][6][7][8][23] 1.1.1. Mô tả thực vật: Cây trầu nằm trong hệ thống phân loại thực vật như sau: - Bộ : Piperales - Họ : Hồ tiêu (Piperaceae) - Chi : Piper - Loài : Piper betle Tên khoa học là: Piper betle L. (piper betle Linn) Cây trầu còn có những tên gọi khác nhau như betel pepper hoặc betel vine (nước Anh), Pan (Ấn Độ), Phlu (Thái Lan), sirih (Indonesia), trầu không hoặc trầu cay (Việt Nam). Hình 1.1: Hình thái bên ngoài của cây trầu Trầu không là một loài cây dây leo, thân là dây leo bám tạo thành từng đốt nối với nhau, cành hình trụ, nhẵn, có khía dọc, bén rễ ở những mấu nối. Lá có hình trái tim, mọc so le, đầu lá nhọn dài, mặt trên lá sẫm bóng, mặt dưới có gân lá nổi rất rõ, cuốn lá có bẹ kéo dài gần 1/3 đến đài của lá. Hoa mọc thành cụm hình đuôi sóc Hình 1.2: Lá trầu buông thòng ở kẻ lá trên thành cụm có hoa đực và hoa cái. Hoa đực dài có cuống có lông, nhị 2, chỉ nhị ngắn, hoa cái dài hơn, cuống phủ lông dày, bầu có lông ở đỉnh. Hình 1.3: Hoa trầu HVCH: Trần Nguyễn Ngọc Châu 2 Khảo sát sự biến đổi 4-allypyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper betel L.) Quả mọng tròn và cũng có lông ở đỉnh. Tinh dầu của nó có màu vàng nhạt, hương thơm nồng, khi nếm có vị nóng và cay. 1.1.2 Phân bố sinh thái: Cây trầu có nguồn gốc ở miền Trung và Đông Malaysia, được trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới Châu Á, việc trồng trầu gắn liền với tập tục ăn trầu và làm thuốc chữa bệnh trong dân gian. Riêng ở Việt Nam, cây trầu đã đi vào truyền thuyết dân tộc, không thể thiếu trong nền văn hóa dân gian Việt Nam. Từ thời Vua Hùng, cách đây nhiều ngàn năm đã có truyện cổ về sự tích “Trầu cau”, và trong văn hoá Việt Nam từ đó có tục lệ ăn trầu và dùng trầu cau làm lễ vật để xin cưới hỏi, nên hiện nay trầu được trồng khắp các địa phương ở Việt Nam. Trầu thuộc loại cây ưa ấm và ẩm, thích ánh sáng (nhưng cũng có thể mọc được trong bóng râm), dễ trồng, sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm. Với nhiệt độ trung bình từ 22oC đến 26oC, lượng mưa từ 2000 – 3000 mm/năm hoặc hơn thì trầu phát triển tốt hơn. Cây trầu thích hợp với các loại đất giàu hữu cơ, có thành phần sét cao, với độ pH từ 6 – 7. Vì trầu là một loại cây được trồng rất lâu đời nên quần thể giống trầu không đã được sưu tập để trồng nhiều loại giống khác nhau, tùy theo thổ nhưỡng và sở thích của người tiêu dùng mà người ta chọn giống để trồng. Hiện nay Ấn Độ là nước đã thu thập được nhiều giống trầu nhất, kế tiếp là Thái Lan (hằng năm Thái Lan xuất khẩu trên 4500 tấn lá trầu).  Cách trồng, chăm sóc và thu hoạch trầu  Cách trồng: Trầu được trồng bằng dây (cắt đoạn thân cây trầu dài từ 40 cm – 50 cm đoạn thân phải có rễ mọc ra từ đốt nối). Đoạn thân trầu được cắt ra và phần đốt có rễ được vùi sâu xuống 20 cm – 30 cm nơi đất màu mỡ có đủ độ ẩm. Nên đặt dây trầu dưới đất, ở cạnh một cây đang sống hay cận tường, có thể làm giàn để dây trầu leo bám và phát triển. HVCH: Trần Nguyễn Ngọc Châu 3 Khảo sát sự biến đổi 4-allypyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper betel L.)  Cách chăm sóc Cây trầu trồng từ 3 – 4 năm thì ra hoa, quả. Muốn cho cây trầu luôn tốt thì phải đủ độ ẩm và thỉnh thoảng bón thêm phân, vôi bột và bồi thêm một lớp mỏng đất bùn vào gốc.  Thu hoạch Nếu được trồng trên vùng đất tốt, có đủ ánh sáng và độ ẩm thì trong vòng 6 tháng người ta có thể thu hoạch được sản phẩm từ dây trầu. Bộ phận dùng là lá và rễ. Lá được hái quanh năm, còn rễ được thu hoạch khi người ta dỡ cây trầu lên trồng lại. Riêng ở vùng đất Hóc Môn (18 thôn vườn trầu) để năng suất thu hoạch lá cao, người ta lên liếp và trầu được trồng dọc theo liếp, trên liếp thì cắm mọc ở chính giữa để dây trầu leo bám, hai bên liếp có đào mương để chống úng ngập khi trời mưa và dưới mương luôn có nước chảy ra vào theo triều cường lên xuống để tạo nên độ ẩm. Hình 1.4: Hình ảnh cây trầu và vườn trầu của nhà Ông Tư Kích, tại địa chỉ: 56/1A Nguyễn Thị Sóc, tổ 5, ấp Hưng Lân, xã Bà Điểm, Huyện Hóc Môn. HVCH: Trần Nguyễn Ngọc Châu 4 Khảo sát sự biến đổi 4-allypyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper betel L.) 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY TRẦU: 1.2.1. Thành phần hóa học của trầu:  Thành phần hóa học của lá trầu: STT Thành phần [23] Đơn vị Hàm lượng 1 Độ ẩm % 85,4 2 Đường tổng % 2,4 – 5,6 3 Đường khử % 1,4 – 3,2 4 Tro tổng % 2,3 5 Béo tổng % 0,8 6 Protein % 3,1 7 Tinh bột % 1,0 – 1,2 8 Xơ % 2,3 9 Tanin % 1,0 – 1,3 10 Vitamin C mg/kg 50 11 Tinh dầu % 0,8 – 1,8 Bảng 1.1: Thành phần hóa học của lá trầu. Nước có hàm lượng thường từ 80% – 85% trong lá trầu. Tanin gọi chung là hợp chất polyphenol có mặt trong lá trầu từ 1,0% – 1,3%. Các hợp chất phenol như chavicol, chavibetol, -tocopherol, 4-allypyrocatechol[4]. Alkaloid và glycoside theo tài liệu thì không có trong lá trầu[23]. Các nguyên tố vô cơ trong lá trầu gồm Ca, P, sắt , Iod, Kali, Natri. Các vitamin trong lá trầu gồm có caroten (tiền vitamin A), vitamin C, nhiều vitamin nhóm B như thiamine, riboflavin và nicotinic acid. Chavibetol HVCH: Trần Nguyễn Ngọc Châu 4-Allypyrocatechol 5 Chavicol Khảo sát sự biến đổi 4-allypyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper betel L.) α-Tocopherol Ngoài ra lá trầu còn có chứa 2-(3,4-Dihidroxyphenyl)ethanal; 3,4-Bis[4hydroxy-5-oxo-6-peroxyclohexa-1,3-dienyl]hexa-1,5-diene[34] 2-(3,4-Dihidroxyphenyl)ethanal 3,4- Bis[4-hydroxy-5-oxo-6-peroxyclohexa-1,3-dienyl] hexa-1,5-diene Thân cây trầu có chứa các hợp chất như acid ursonic, acid 3- -acetylursonic, piperlongguminine, triterpen[4] Piperlonguminine Acid ursonic Rễ cây trầu có chứa: Stigmast-4-en-3,6-dione ; 4-allyl resorcinol; aristololactam[27] Aristololactam HVCH: Trần Nguyễn Ngọc Châu 4-Allyl resorcinol 6 Stigmast-4-en-3,6-dione Khảo sát sự biến đổi 4-allypyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper betel L.) Ngoài ra người ta cũng tìm thấy trong rễ cây trầu có β-sitosterol palmitate, diosgenin[4] Diosgenin β-Sitosterol palmitate  Hoa: Thành phần của hoa rất đa dạng nhưng chủ yếu gồm 7 hợp chất phenol: safrole, flavone, 2-hydroxychavicol tức 4-allylpyrocatechol, eugenol, methyleugenol, isoeugenol, quercetin. Trong đó safrole là thành phần chủ yếu. Safrol Flavone Ngoài ra còn có một số hợp chất béo trong thân và lá cây[24] 6,9-heptacosadiene Methyl hexacos-7-enoate Pentadecyl 8-hydroxytridecanoate HVCH: Trần Nguyễn Ngọc Châu 7 Khảo sát sự biến đổi 4-allypyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper betel L.) Pentatriacontanol CH3(CH2)34OH CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH-(CH2)16CH3 6,9-Heptacosadiene 1.2.2. Thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu 1.2.2.1.Thành phần hợp chất phenolic trong lá trầu được nghiên cứu trên thế giới Theo các tài liệu nghiên cứu thì thành phần tinh dầu lá trầu có chứa khoảng 15[16][40] đến 40 [11][32] hợp chất. Tùy từng loài, hoặc từng vùng địa lý trồng khác nhau mà thành phần tinh dầu trong lá trầu bao gồm 9 nhóm chất sau:[39] monoterpene (như terpinene, pinene, limonene, thujene, camphene), sesquiterpene (như cadinene, elemene, caryophyllene, cubebene), alcohol (linalol, terpineol, cadinol), aldehyde (như decanal), acid (hexadecanoic acid), oxide (như 1,8 cineole), phenol (như eugenol, chavibetol, chavicol), phenolic ether (như methyl eugenol) và ester (eugenol acetate, chavibetol acetate, chavicol acetate). Trong tinh dầu trầu các hợp chất phenolic (eugenol, chavibetol, isoeugenol, eugenol acetate, chavibetol acetate, 4- allylpyrocatechol diacetate, 4-allylpyrocatechol) chiếm tỷ lệ cao khoảng từ 25% – 70% và là thành phần chính của tinh dầu lá trầu. OH OMe OH OMe CH2CH=CH2 Eugenol  CH2CH=CH2 Chavibetol OAc OH Isoeugenol OMe OMe CH=CHCH3 OMe CH2CH=CH2 Eugenol acetate OAc OAc CH2CH=CH2 Chavibetol acetate OAc CH2CH=CH2 4-Allyl pyrocatechol diacetate Rawat A.K.S. và cộng sự,[39] nghiên cứu có 51 thành phần hóa học được nhận danh trong 5 loài trầu “Meetha”, “Bangla”, “Kapoori”, “Sanch”, “Khasi”. Dựa vào đặc điểm hình thái học để phân loại chúng. Eugenol có mặt trong cả 5 loài trên và là thành phần chính quan trọng nhất, thành phần này có mặt nhiều nhất ở loài “bangla” 63,31%. Cũng ở loài trầu “bangla”, tác giả Rathee J.S. và cộng sự[35] trích ly các thành phần lá HVCH: Trần Nguyễn Ngọc Châu 8 Khảo sát sự biến đổi 4-allypyrocatechol diacetate và chavibetol acetate thành chavibetol trong tinh dầu lá trầu Hóc Môn (Piper betel L.) khô của cây trầu bằng dung môi ethanol, thu được cao chiết có chứa 4allylpyrocatechol (APC), chavibetol (CHV), cùng với các glucoside tương ứng của chúng. Trong đó, APC là thành phần có hàm lượng nhiều nhất, và có tính kháng oxi hoá mạnh nhất, tương tự như -tocopherol.  Theo Rimando A.M. và cộng sự,[40] thành phần hoá học của lá trầu Philippine gồm 14 chất được nhận danh bởi GC/MS và sắc ký bản mỏng (TLC). Thành phần chính của tinh dầu lá trầu trích ly bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước là chavibetol (53,1%) và chavibetol acetate (15,5%). Trong khi đó, APC (2,38%) là thành phần chủ yếu được cô lập trong dịch chiết ethanol của phần bã còn lại trong bình cầu sau khi chưng cất tinh dầu bằng lôi cuốn hơi nước.  Theo Li-Chung M.R. và Jiau-Ching H,[32] tinh dầu trầu Đài Loan có eugenol (36,2%), chavibetol acetate (16,9%), 4-allylphenyl acetate (9,6%), 4-allylphenol (7,2%), 4-allylpyrocatechol diacetate (5,4%).  Theo Bajpai V. và cộng sự,[13] tinh dầu trầu Ấn Độ khi được phân tích bằng kỹ thuật khối phổ đo ở thời gian thật cho thấy các hợp chất 4-allylphenol, 4-allylphenyl acetate, chavibetol, chavibetol acetate, 4-allylpyrocatechol diacetate  Theo Bin Jantan E.I. và cộng sự,[16] tinh dầu trầu Malaysia Piper betle L. có 4-allylphenol (6%), chavibetol (69%), eugenol acetate (8,3%), 4-allylpyrocatechol diacetate (0,2%). 1.2.2.2. Thành phần hợp chất phenolic trong lá trầu được nghiên cứu tại Việt Nam  Các tác giả Bùi Ngọc Minh Phượng và các cộng sự đã trích ly tinh dầu từ lá trầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng để xem ảnh hưởng của vi sóng lên thành phần hóa học của tinh dầu lá trầu.[11] Từ lá trầu tươi, sử dụng dung môi là nước trích ly tinh dầu theo 2 phương pháp: - Phương pháp vi sóng: lá trầu tươi, cắt nhỏ, cho vào nước với tỉ lệ khối lượng (1 nguyên liệu : 4 nước), cho hỗn hợp nguyên liệu và nước vào lò vi sóng ở chế độ công suất 600 W, thời gian chưng cất là 10 phút, hiệu suất tinh dầu thu được là 0,45% HVCH: Trần Nguyễn Ngọc Châu 9