Tài liệu Khảo sát rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở phôi 5 ngày tuổi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Phùng Thị Mùi KHẢO SÁT RỐI LOẠN SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ Ở PHÔI 5 NGÀY TUỔI THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Phùng Thị Mùi KHẢO SÁT RỐI LOẠN SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ Ở PHÔI 5 NGÀY TUỔI THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 842010121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân TS. Nguyễn Thanh Tùng Hà Nội – Năm 2018 LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi đã may mắn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả về vật chất, tinh thần của các thầy cô, bạn bè. Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân (ĐHKHTN - ĐHQGHN) và TS. Nguyễn Thanh Tùng (Học Viện Quân Y), người đã trực tiếp hướng dẫn và nhiệt tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Đồng thời tôi cũng gửi lời cám ơn chân thành tới các cán bộ thuộc Trung tâm Hỗ trợ sinh sản của Bệnh viện Tâm Anh, Bệnh viện Nam Học và Hiếm muộn Hà Nội và Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội – Học viện Quân Y đã giúp tôi sinh thiết và phân loại các mẫu phôi bào sử dụng trong nghiên cứu này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới BS. Đặng Tiến Trường (Học viện Quân Y) người luôn tận tình hướng dẫn tôi về kinh nghiệm làm việc và tạo điều kiện thuận lợi cũng như động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian học tập, và nghiên cứu tại phòng ADN – Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y. Tôi muốn gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo của bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong quá trình học tập tại Bộ môn. Qua đây, tôi cũng xin cám ơn Bộ môn Giải Phẫu Học viện Quân Y đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng thí nghiệm ADN. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè và các em sinh viên, những đã luôn ở bên cổ vũ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, tháng 11 năm 2018 Học viên Phùng Thị Mùi i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt a-CGH Nghĩa tiếng Anh Array Comparative Genomic Hybridization Lai so sánh hệ gen ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic ARN Ribonucleic acid Axit ribonucleic Bp Base pair Cặp bazơ nitơ Bất thường số lượng nhiễm sắc BT SLNST dNTP FISH thể Deoxyribonucleotide triphosphate Fluorescence in Situ Hybridization GTT Deoxyribonucleotit triphosphat Lai huỳnh quang tại chỗ Giải trình tự IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm Mbp Megabase pair Triệu cặp bazơ nitơ NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự gen thế hệ thứ hai NST PCR PGS Nhiễm sắc thể Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Preimplantation Genetic Sàng lọc di truyền trước chuyển Screening phôi TTTON WGA Nghĩa tiếng Việt Thụ tinh trong ống nghiệm Whole Genome Amplification Khuếch đại toàn bộ hệ gen MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 3 1.1. Thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) .................................................... 3 1.2. Sự phát triển của phôi trước khi làm tổ .................................................. 3 1.2.1. Phôi giai đoạn tiền nhân ......................................................................... 3 1.2.2. Phôi ở giai đoạn phân chia (2-3 ngày sau thụ tinh) ................................ 4 1.2.3. Phôi dâu .................................................................................................. 4 1.2.4. Phôi nang ................................................................................................ 5 1.3. Bất thường số lượng NST và cơ chế hình thành .................................... 6 1.3.1. Cơ chế phát sinh bất thường số lượng NST ........................................... 6 1.3.2. Phân loại các dạng bất thường số lượng NST ...................................... 10 1.3.3. Các bất thường số lượng NST trong giai đoạn phôi............................. 10 1.3.4. Tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi và noãn ........................................ 13 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới bất thường NST trong TTTON ................... 15 1.5. Các phương pháp phân tích NST của phôi........................................... 18 1.5.1. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ - FISH ...................................... 18 1.5.2. Phương pháp lai so sánh hệ gen (a-CGH) ............................................ 20 1.5.3. Phương pháp sàng lọc di truyền truyền trước chuyển phôi sử dụng giải trình tự gen thế hệ thứ hai NGS. .......................................................... 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 27 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu .............................................................................. 27 2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu .............................................................................. 27 2.2.3. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu...................................................... 28 2.2.4. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ....................................................... 29 2.2.5. Sinh thiết phôi bào và rửa phôi bào...................................................... 30 iii 2.2.6. Khuếch đại toàn bộ hệ gen ................................................................... 31 2.2.7. Kiểm tra nồng độ ADN sau quá trình khuếch đại toàn bộ hệ gen........ 33 2.2.8. Chuẩn bị thư viện ................................................................................. 33 2.2.9. Giải trình tự .......................................................................................... 35 2.2.10. Phương pháp phân tích số liệu ............................................................. 35 2.3. Các chỉ tiêu nghiên cứu ........................................................................ 39 2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................ 40 2.5. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu. ....................................................... 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 41 3.1. Kết quả phân tích sự rối loạn nhiễm sắc thể ở phôi 5 ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ thứ hai – Next generation sequencing (NGS) ..............................................41 3.2. Đánh giá mối tương quan giữa rối loạn số lượng nhiễm sắc thể của phôi 5 ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm và yếu tố tuổi người mẹ ...........52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 61 Kết luận ............................................................................................................. 61 Kiến nghị ........................................................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Sự phát triển của hợp tử từ giai đoạn 2 phôi bào đến giai đoạn phôi nang ... 6 Hình 2 Cơ chế của sự không phân ly hình thành các dạng lệch bội ........................ 8 Hình 3 Cơ chế hình thành thể khảm theo Delhanty ................................................. 9 Hình 4 Sơ đồ giải thích nguyên lý cơ bản của kỹ thuật FISH ................................ 19 Hình 5 Sơ đồ minh họa các bước cơ bản trong kỹ thuật array CGH ..................... 22 Hình 6 Giới thiệu về công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của hãng Illumina ........ 24 Hình 7 Kết quả khuếch đại toàn bộ hệ gen của 603 mẫu nghiên cứu .................... 41 Hình 8 Chất lượng dữ liệu giải trình tự trên máy Miseq ........................................ 42 Hình 9 Kết quả kiểm định Binomial test về tỷ lệ bất thường NST ở phôi 5 ngày tuổi TTTON ..................................................................................................... 43 Hình 10 Mức độ lệch bội NST của phôi TTTON 5 ngày tuổi ............................... 48 Hình 11 Phôi TTTON 5 ngày tuổi không phát hiện bất thường NST .................... 49 Hình 12 Phôi TTTON 5 ngày tuổi phát hiện lệch bội ở 1 NST ............................. 49 Hình 13 Phôi TTTON 5 ngày tuổi phát hiện lệch bội ở 2 NST ............................. 50 Hình 14 Phôi TTTON 5 ngày tuổi phát hiện lệch bội ở 3 NST ............................. 50 Hình 15 Phôi TTTON 5 ngày tuổi phát hiện lệch bội ở nhiều NST ...................... 50 Hình 16 Phôi TTTON 5 ngày tuổi phát hiện bất thường cấu trúc NST ................. 51 Hình 17 Tần suất bất thường cấu trúc NST của 578 mẫu phôi TTTON ................ 52 Hình 18 Mối tương quan giữa tuổi mẹ và tỷ lệ bất thường số lượng NST ............ 56 Hình 19 Đường hồi quy tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa tuổi mẹ và tỷ lệ bất thường số lượng NST ............................................................................... 57 Hình 20 Đặc điểm rối loạn số lượng NST phân bố theo độ tuổi của người mẹ ..... 59 v DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1 Kết quả sàng lọc phôi sử dụng kỹ thuật CGH của E. Fragouli và D. Wells 11 Bảng 2 Tần suất bất thường NST phát hiện ở phôi 5 ngày tuổi sử dụng kỹ thuật CGH theo nghiên cứu của E. Fragouli D. Wells ................................................ 12 Bảng 3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............................................................ 29 Bảng 4 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .............................................................. 30 Bảng 5 Thành phần phản ứng ly giải tế bào ............................................................ 32 Bảng 6 Thành phần phản ứng tiền khuếch đại toàn bộ hệ gen ................................ 32 Bảng 7 Thành phần phản ứng khuếch đại toàn bộ hệ gen ....................................... 32 Bảng 8 Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể của 578 mẫu nghiên cứu ........................... 43 Bảng 9 Đặc điểm bất thường của phôi 5 ngày tuổi TTTON ................................... 44 Bảng 10 Tỷ lệ rối loạn số lượng nhiễm sắc thể của phôi 5 ngày tuổi TTTON ....... 45 Bảng 11 Đặc điểm rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể ở phôi TTTON 5 ngày tuổi ..... 51 Bảng 12 Sự phân bố số lượng phôi ngày 5 trong TTTON theo độ tuổi của người mẹ .................................................................................................................. 53 Bảng 13 Kết quả phân tích 578 phôi phân chia theo độ tuổi của người mẹ ............ 54 Bảng 14 Đặc điểm bất thường NST phân chia theo độ tuổi của người mẹ ............. 58 ĐẶT VẤN ĐỀ PGS (Preimplantation genetic screening) - sàng lọc di truyền trước chuyển phôi, là một kỹ thuật di truyền được thực hiện trên phôi trong các quy trình thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON – In Vitro Fertilization). Kỹ thuật này giúp phát hiện và sàng lọc để lựa chọn các phôi bình thường về mặt di truyền giúp làm tăng cơ hội thụ thai và sinh ra các trẻ bình thường. Tất cả phụ nữ đều có nguy cơ tạo ra phôi bất thường nhiễm sắc thể (NST). Đặc biệt khi phụ nữ trì hoãn việc sinh con cho tới khi ngoài 30 tuổi, xác suất cho phôi bất thường nhiễm sắc thể tăng lên đáng kể, bất kể số lượng phôi được tạo ra, dẫn tới làm tăng tỷ lệ thất bại trong TTTON sau khi chuyển phôi [7]. Trước những thách thức và cơ hội mang lại, có rất nhiều kỹ thuật PGS ra đời. Đầu tiên phải kể đến kỹ thuật FISH - fluorescence in situ hybridization, đây là kỹ thuật rất phổ biến với việc sử dụng các đầu dò (probe) có gắn huỳnh quang gắn với một số vị trí trên một vài nhiễm sắc thể. Do số lượng màu huỳnh quang hạn chế, FISH chỉ sàng lọc được một vài nhiễm sắc thể trong một lần thực hiện. Tuy nhiên, tình trạng lệch bội (aneuploidy) có thể xảy ra ở bất kỳ nhiễm sắc thể nào với tỷ lệ xấp xỉ nhau [16, 20, 72]. Do đó, FISH không phải là một kỹ thuật toàn diện để lựa chọn các phôi tốt nhất cho việc chuyển. Trong số các công nghệ PGS tiên tiến khác, việc kỹ thuật lai so sánh hệ gen (array CGH - Comparative Genomic Hybridization) là công nghệ đầu tiên có thể kiểm tra toàn bộ 24 nhiễm sắc thể người (nhiễm sắc thể bình thường, X và Y) [18, 20]. Cách đây vài năm, a-CGH đã phổ biến và trở thành tiêu chuẩn vàng cho PGS trên toàn thế giới. Ngày nay, sự phát triển của công nghệ giải trình tự (GTT) gen thế hệ thứ hai (NGS- Next Generation Sequencing) và ứng dụng của chúng có thể mang lại những giải pháp hữu hiệu. Thừa hưởng những tính năng của a-CGH, NGS có các tính năng vượt trội hơn trong việc sàng lọc bất thường số lượng NST của phôi với độ phân giải 1 và độ chính xác cao cũng như cung cấp thêm thông tin cho các phân tích sâu hơn về gene liên quan tới các hội chứng hoặc bệnh. Bên cạnh đó, có thể phân tích cùng lúc nhiều mẫu trong một lần chạy giúp giảm chi phí cho người bệnh. Đáng chú ý là theo hai nghiên cứu của Yang và cộng sự năm 2012 và 2015, cho thấy nếu sử dụng phương pháp đánh giá hình thái kết hợp với kỹ thuật giải trình tự gen để đánh giá và lựa chọn phôi sẽ làm tăng tỷ lệ thành công của TTTON lên 74,7% và cao hơn nhiều so với các phương pháp khác [73, 74]. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Khảo sát rối loạn số lượng nhiễm sắc thể ở phôi 5 ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm” với mục tiêu: • Xác định tỷ lệ rối loạn số lượng nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệm 5 ngày tuổi bằng kỹ thuật PGS-NGS. • Đánh giá mối tương quan giữa rối loạn số lượng nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệm 5 ngày tuổi và yếu tố tuổi người mẹ. Nghiên cứu này nằm trong đề tài “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng” mã số KC.10.09/16-20 được thực hiện tại Phòng phân tích ADN – Bộ môn Giải phẫu – Học viện Quân Y. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) Công nghệ hỗ trợ sinh sản (ART - assisted reproductive technology) theo Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ - CDC(Centers for Disease Control and Prevention) được định nghĩa là tổ hợp các công cụ giúp điều trị sinh sản bằng cách can thiệp vào noãn và tinh trùng của người. Các thủ thuật hỗ trợ sinh sản nói chung liên quan đến phẫu thuật lấy noãn từ buồng trứng của phụ nữ, kết hợp chúng với tinh trùng trong phòng thí nghiệm và đưa chúng trở lại cơ thể của người phụ nữ hoặc tặng chúng cho người phụ nữ khác. Một trong những công cụ hỗ trợ sinh sản được biết đến và áp dụng rộng rãi ngày nay đó là công nghệ In – vitro fertilization (IVF – Thụ tinh trong ống nghiệm). Theo đó, noãn và tinh trùng sẽ gặp nhau bên ngoài cơ thể người, quy trình này bao gồm hàng loạt các bước phức tạp để điều trị trong sinh sản hoặc các vấn đề di truyền và hỗ trợ sinh ra một em bé khỏe mạnh. Ban đầu, noãn trưởng thành được lấy ra từ buồng trứng của người phụ nữ; tinh trùng có thể được lấy từ người chồng hoặc một người hiến tặng. Hợp tử được tạo thành sau quá trình thụ tinh giữa noãn và tinh trùng ở một môi trường đặc biệt giống trong cơ thể dưới sự hỗ trợ của các thiết bị trong phòng thí nghiệm. Hợp tử này sau đó được cấy ngược lại tử cung của người phụ nữ để tiếp tục các quá trình phát triển của phôi, thai và các giai đoạn biệt hóa khác sau đó. 1.2. Sự phát triển của phôi trước khi làm tổ 1.2.1. Phôi giai đoạn tiền nhân Tiền nhân là giai đoạn đầu tiên của hợp tử ngay sau khi noãn được thụ tinh bởi tinh trùng. Tiền nhân đực và tiền nhân cái mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội, bằng một nửa số nhiễm sắc thể của tế bào thân. Tiền nhân đực được hình thành gần vị trí tinh trùng thâm nhập vào noãn tiền nhân cái được hình thành ở cực bào tương có thoi phân bào [7]. Sự hình thành tiền nhân đực thường xảy ra chậm hơn do tinh trùng phải trải qua một số 3 thay đổi trong cấu trúc ở phần đầu, dưới tác dụng của một số chất có trong bào tương noãn. Hai tiền nhân từ từ tiến lại gần nhau ở giữa hợp tử và hợp nhất thành hợp tử. Sự tiếp xúc của cả hai tiền nhân được thực hiện qua trung gian các ống vi thể được thành lập từ các trung thể của tinh trùng. Khi sự biệt hóa tiền nhân hoàn tất, màng nhân rã ra và vật liệu di truyền của hai tiền nhân hợp lại với nhau. Trong thụ tinh nhân tạo, sự xuất hiện của hai hạt nhân là dấu hiệu đầu tiên của sự thụ tinh thành công [56] được quan sát trong quá trình thụ tinh trong ống nghiệm, và thường được đánh giá trong khoảng thời gian từ 12 - 20 giờ sau khi thụ tinh hoặc tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI - Intra-cytoplasmic Sperm Injection) [66]. Việc quan sát sự thay đổi của tế bào chất từ giai đoạn hình thành tiền nhân tới giai đoạn phân chia đầu tiên luôn được chú ý và quan sát bởi yếu tố này có thể ảnh hưởng tới tỷ lệ thành công nếu chuyển phôi ngày 1 hoặc chọn phôi trữ đông [45]. 1.2.2. Phôi ở giai đoạn phân chia (2-3 ngày sau thụ tinh) Ngay sau khi tiền nhân đực và tiền nhân cái hợp nhất, thoi phân bào xuất hiện, thể nhiễm sắc được sắp xếp trên thoi phân bào. Mỗi thể nhiễm sắc con tiến về một cực tế bào, đồng thời rãnh phân chia xuất hiện và ngày càng sâu trên mặt noãn. Kết quả, noãn thụ tinh đã phân làm 2 phôi bào, ở người, hai phôi bào này to nhỏ không đều nhau [1]. Trong suốt quá trình phân chia tế bào chất trong giai đoạn này được kiểm soát chủ yếu bởi trung thể của tinh trùng [12]. Quá trình phân chia này hợp tử gần như không có sự thay đổi về kích thước do không có sự lớn lên về tế bào chất. Điều này có nghĩa sau mỗi lần phân chia thì tỷ lệ hạt nhân với tế bào chất ngày càng tăng lên. Quá trình phân chia lần đầu để từ 1 tế bào hợp tử thành 2 tế bào con (phôi bào) sau 30 giờ thụ tinh; và thành 4 tế bào sau 40 giờ sau thụ tinh [44]. 1.2.3. Phôi dâu Sau một vài lần phân chia, phôi chứa từ 16 - 32 phôi bào có hình dáng như trái dâu nên gọi là phôi dâu. Sau lần phân chia thứ ba, trong phôi diễn ra quá trình kết dính tế bào. Hiện tượng kết đặc tế bào xảy ra vào khoảng ngày thứ 3 – 4 làm cho các tế bào áp sát vào nhau và ranh giới giữa các tế bào lúc này trở nên khó phân biệt. Quá trình kết đặc tế bào rất quan trọng trong sự biệt hoá khối tế bào trong và tế bào lá nuôi, quyết định đến sự hình thành phôi thai. Màng trong suốt ở giai đoạn phôi dâu vẫn nguyên vẹn tạo điều kiện cho sự kết đặc tế bào và ngăn hai phôi (nếu có) nhập vào nhau. Nếu lớp tế bào trong phân chia ở giai đoạn sớm này, có thể phát triển thành song thai cùng hợp tử. Cấu tạo của phôi dâu gồm: một nhóm tế bào nằm ở vị trí trung tâm có kích thước lớn hơn gọi là đại phôi bào, còn những tế bào tạo thành một lớp bao quanh phía ngoài có kích thước nhỏ hơn gọi là tiểu phôi bào. Những đại phôi bào sau này sẽ tạo phôi và một số bộ phận phụ của phôi như màng ối, túi noãn hoàng, niệu nang. Tiểu phôi bào sẽ tạo lá nuôi, sau này sẽ phát triển thành rau thai và màng bọc thai [44]. Sự phân chia noãn thụ tinh xảy ra trong quá trình noãn di chuyển từ vòi trứng đến tử cung. Các tế bào nang vây quanh noãn bị thoái hóa dần dần, màng trong suốt vẫn tồn tại trong thời gian phân chia noãn và giai đoạn phôi dâu rồi cuối cùng biến mất. 1.2.4. Phôi nang Ở người, vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh, hợp tử (ở giai đoạn phôi dâu) đã lọt vào khoang tử cung và bị vùi trong chất dịch do nội mạc tử cung tiết ra. Chất dịch thấm qua màng trong suốt vào các khoảng gian bào của đại phôi bào để nuôi trứng. Dần dần các khoảng gian bào hợp lại và cuối cùng tạo thành một khoang xen giữa lớp tiểu phôi bào và khối đại phôi bào, khoang này dần dần lớn lên và gọi là khoang phôi nang hay khoang dưới mầm vì mầm phôi được tạo ra nằm phía trên nó. Màng trong suốt hoàn toàn biến mất. Khối tế bào trung tâm của phôi dâu, các đại phôi bào bị khoang phôi nang đẩy dần về một cực của trứng và lồi vào khoang dưới mầm được gọi là cúc phôi. Cúc phôi chính là mầm của phôi và cực đó gọi là cực phôi vì ở đó phôi sẽ phát triển. Còn cực đối lập gọi là cực đối phôi. Tiểu phôi bào của lớp ngoại vi của phôi dâu dẹt lại tạo nên thành của khoang phôi nang, trứng thụ tinh ở giai đoạn này giống như một cái túi nên gọi là phôi nang và giai đoạn phát triển này của noãn gọi là giai đoạn phôi nang [44]. 5 Thông thường tổng số phôi bào của phôi nang là trên 60 phôi bào. Ở người, phôi nang ngày 5 có khoảng 60 phôi bào, tăng đến 160 vào ngày 6 và trên 200 sau khi thoát màng vào ngày 7; 40% số phôi bào tạo mầm phôi [27]. Hình 1 Sự phát triển của hợp tử từ giai đoạn 2 phôi bào đến giai đoạn phôi nang [78] 1.3. Bất thường số lượng NST và cơ chế hình thành 1.3.1. Cơ chế phát sinh bất thường số lượng NST Cơ chế gây ra bất thường số lượng NST được bàn đến nhiều nhất là hiện tượng không phân ly (non-disjunction) của một vài NST hay toàn bộ NST trong phân bào làm thay đổi số lượng nhiễm sắc thể. Các nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự bất thường số lượng nhiễm sắc thể của phôi tạo ra trong ống nghiệm và phôi hình thành trong tự nhiên bao gồm: • Bất thường số lượng nhiễm sắc thể sai sót bên trong tế bào sinh dục gốc: Những sai lệch trong quá trình tế bào sinh dục gốc phân chia dẫn đến tình trạng lệch bội nhiễm sắc thể ở tế bào gốc dẫn đến hình thành lệch bội nhiễm sắc thể ở giao tử. Trong tất cả các trường hợp, kết quả là tạo ra giao tử có nhiều hoặc ít hơn về số lượng nhiễm sắc thể. • Bất thường số lượng nhiễm sắc thể sinh ra trong quá trình phân bào: Các nhà khoa học cho rằng có hai cơ chế chính về sự không phân ly NST dẫn tới lệch bội NST, Zenzes và Casper cho rằng sự không phân ly dẫn đến lệch bội nhiễm sắc thể là do bất thường trong phân tách các nhiễm sắc thể tương đồng ở giảm phân I, dẫn đến thế hệ của các tế bào con không đồng đều, thừa hoặc thiếu vật chất di truyền. Angel và cộng sự năm 1993 cũng cho rằng sự hình thành nhiễm sắc thể đơn ở giảm phân II phát sinh bởi sự phân ly sớm của các nhiễm sắc tử ở kỳ sau của giảm phân I và đây có thể là cơ chế chính cho sự hình thành bất thường số lượng nhiễm sắc thể dạng tam nhiễm ở người [6]. Trong trường hợp này tế bào gốc bình thường nhưng nhiễm sắc thể bị thay đổi xảy ra trong quá trình phân bào. Trong phân bào giảm nhiễm, những sai lệch trong việc phân ly nhiễm sắc thể trong giai đoạn này sẽ tạo ra giao tử bị lệch bội nhiễm sắc thể và sự hợp nhất giao tử bị lệch bội nhiễm sắc thể sẽ tạo ra phôi bị lệch bội nhiễm sắc thể (hình 2). Có ba giả thiết về cơ chế gây nên lệch bội nhiễm sắc thể trong phân bào nguyên nhiễm: (1) thiếu nhiễm sắc thể do sự chậm trễ của kỳ sau (anaphase); (2) sự nhân lên của một nhiễm sắc thể (cơ chế vẫn chưa được hiểu rõ); (3) mất hoặc thêm nhiễm sắc thể tương ứng do nhiễm sắc thể không phân ly hoặc giai đoạn kỳ sau bị ngừng trệ tạo nên một phôi bào thiếu nhiễm sắc thể và một phôi bào thừa nhiễm sắc thể tương ứng. 7 Hình 2 Cơ chế của sự không phân ly hình thành các dạng lệch bội [9] Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của Magli và cộng sự năm 2009 cho thấy sự bất thường trong phân chia trong hình thành giao tử ở người cha không có tinh trùng không do tắc nghẽn (non-obstructive azoospermia) có thể dẫn tới 95% hiện tượng thể khảm ở phôi, và tần xuất xuất hiện cao hơn hẳn so với các phôi khác [38]. Ở người, những sai lệch trong quá trình phân bào nguyên nhiễm cũng thường xảy ra khi phôi ở giai đoạn phân chia sớm, các phôi bào còn có xu hướng phân chia sai lệch. Hầu hết sự sai lệch trong phân bào nguyên nhiễm ở phôi giai đoạn đầu (hình 3) sẽ dẫn đến tạo ra phôi thể khảm nghĩa là phôi có ≥ 2 dòng phôi bào có thành phần nhiễm sắc thể khác nhau. Hình 3 Cơ chế hình thành thể khảm theo Delhanty [38] • Bất thường nhiễm sắc thể trong và sau thụ tinh: Khoảng 1% thai có bộ nhiễm sắc thể lớn hơn 2n do bộ nhiễm sắc thể được tăng một số chẵn hoặc lẻ lần và được gọi là đa bội. Có 3 cơ chế dẫn đến hiện tượng đa bội (1) tinh trùng hoặc noãn lưỡng bội tham gia vào quá trình thụ tinh; (2) hai hay nhiều tinh trùng tham gia vào quá trình thụ tinh; (3) sự tồn lại của thể cực thứ 2. 60% các trường hợp đa bội là do thụ tinh với nhiều tinh trùng [16]. Một số nghiên cứu cho rằng gần một nửa noãn người là bị lệch bội nhiễm sắc thể, tỷ lệ này tăng lên đáng kể khi người phụ nữ trên 35 tuổi [42, 59]. Ngược lại, tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể ở tinh trùng của nam giới có khả năng sinh sản bình thường là tương đối thấp 4 - 7% [40, 61]. Tuy nhiên, tỷ lệ này có thể tăng đáng kể trong một số trường hợp vô sinh nam nặng. 9 1.3.2. Phân loại các dạng bất thường số lượng NST Bất thường số lượng NST bao gồm hai dạng: lệch bội và đa bội. v Lệch bội nhiễm sắc thể là hiện tượng số lượng nhiễm sắc thể của tế bào tăng lên hoặc giảm đi một hoặc vài nhiễm sắc thể so với bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội. Lệch bội NST ở NST thường: Do sự không phân ly ở giảm phân I kết quả tạo ra 4 giao tử mất cân bằng về số lượng NST và sự không phân ly ở giảm phân II kết quả tạo ra 2 giao tử bình thường và 2 giao tử bất thường về bộ NST [28]. Lệch bội NST giới tính: thường ít gây nguy hiểm hơn và có nhiều dạng thể ba khác nhau có thể xảy ra [28]. Thể khảm (Mosaisicm) là hiện tượng cá thể được tạo thành từ 2 hoặc nhiều hơn 2 loại tế bào khác nhau trong bộ NST. Tuy nhiên các tế bào này chỉ được tạo ra từ cùng một và chỉ một hợp tử [28]. Các dạng lệch bội NST thường gặp: Thể không (2n-2); thể một (2n-1), thể một kép (2n-1-1), thể ba (2n+1), thể bốn (2n+2), thể bốn kép (2n+2+2). Ở người dạng lệch bội hay gặp nhất là dạng thể ba (2n+1) có 3 nhiễm sắc thể số 21dẫn tới hội chứng Down. Ngoài ra còn phát hiện các trường hợp khác như: ba nhiễm sắc thể số 18; ba nhiễm sắc thể số 13; 45,X (Hội chứng Turner); 47,XXY (Hội chứng Klinefelter); 47,XYY và 47,XXX [23]. v Đa bội nhiễm sắc thể là hiện tượng số lượng nhiễm sắc thể của tế bào tăng lên 3 hoặc nhiều hơn 3 lần so với bộ nhiễm sắc thể đơn bội. Thể đa bội có hai dạng là thể tự đa bội và dị đa bội. Tự đa bội là hiện tượng tăng số NST đơn bội của cùng một loài lên nhiều hơn 2 lần bao gồm tự đa bội lẻ (3n, 5n,…) và tự đa bội chẵn (4n, 6n,…). Dị đa bội do bộ NST 2n của hai hay nhiều loài khác nhau cùng tồn tại trong một tế bào. Tuy nhiên, dạng thể đa bội ít gặp ở động vật bậc cao. 1.3.3. Các bất thường số lượng NST trong giai đoạn phôi Đối với những người mẹ ở độ tuổi từ 35 trở lên, nguy cơ có bất thường trong quá trình phân chia càng cao dẫn tới tỷ lệ bất thường số lượng xảy ra ở NST càng lớn. Theo nghiên cứu của E. Fragouli và D. Wells thử nghiệm trên 1.290 phôi trong giai đoạn phôi nang. Kết quả cho thấy sự bất thường NST xảy ra ở tất cả nhiễm sắc thể trong giai đoạn phát triển của phôi sau 3 - 5 ngày thụ tinh. Tỷ lệ bất thường số lượng NST chiếm 56% tổng số phôi nghiên cứu. Bất thường số lượng NST có thể xảy ra ở 1 NST hoặc một vài NST trong cùng một phôi. Và sự bất thường ở các NST 22, 16, 15, 21 và X là thường xuyên xảy ra nhất trên tổng số cặp 23 NST ở người. Những kết quả này được tóm tắt trong các bảng 1 và bảng 2 [20, 21]. Bảng 1 Kết quả sàng lọc phôi sử dụng kỹ thuật CGH của E. Fragouli và D. Wells [21] Tổng số bệnh nhân 191 Tuổi trung bình 38,1 (từ 29 đến 50 tuổi) Số phôi sinh thiết 1.290 Các mẫu phôi lưỡng bội 519 Các mẫu phôi lệch bội 660 Các mẫu phôi không phân tích được 111 Mẫu phôi có 1 NST bất thường 398 Mẫu phôi có 2 NST bất thường 162 Mẫu phôi có 3 NST bất thường 100 Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng lệch bội nhiễm sắc thể có thể xảy ra ở bất kỳ nhiễm sắc thể nào trong hệ gen người với tỷ lệ khác nhau [16, 20, 21, 72]. 11 Bảng 2 Tần suất bất thường NST phát hiện ở phôi 5 ngày tuổi sử dụng kỹ thuật CGH theo nghiên cứu của E. Fragouli D. Wells [21] NST Thêm NST Thêm 1 phần NST Mất NST Mất 1 phần NST Tổng số 1 12 8 6 2 28 2 8 3 15 4 30 3 7 3 8 6 24 4 10 2 25 4 41 5 10 2 8 3 23 6 9 2 10 0 21 7 15 0 14 4 33 8 13 1 13 2 29 9 9 3 13 2 27 10 10 1 9 2 22 11 13 1 20 6 40 12 12 0 9 1 22 13 12 0 48 0 60 14 13 0 14 0 27 15 53 0 41 0 94 16 56 2 46 1 105 17 23 0 11 0 34 18 14 0 33 1 48 19 32 0 14 0 46 20 14 1 22 1 38 21 21 0 46 0 67 22 95 0 42 0 137 X 21 1 46 2 70 Y 12 0 1 0 13 Tổng số 494 30 514 41 1079