Tài liệu Khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn trên một số giống lúa bằng chỉ thị phân tử

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THỊ THƯỞNG KHẢO SÁT NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thiên Thành TS. Nguyễn Văn Giang NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nghiên cứu trong luận văn là kết quả lao động của chính tác giả. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Dương Thị Thưởng i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân. Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thiên Thành và thầy giáo TS. Nguyễn Văn Giang người đã định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin được cám ơn chân thành các Anh, Chị trong bộ môn Công nghệ sinh học Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam những người đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt khoảng thời gian tôi học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới ông, bà, bố, mẹ, anh chị em và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Dương Thị Thưởng ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... v Danh mục bảng ................................................................................................................ vi Danh mục hình ................................................................................................................ vii Trích yếu luận văn ......................................................................................................... viii Thesis abstract................................................................................................................... x Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu ........................................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................... 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3 2.1. Cây lúa và bệnh đạo ôn trên lúa ......................................................................... 3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại ...................................................................................... 3 2.1.2. Bệnh đạo ôn trên lúa ........................................................................................... 5 2.1.3. Cơ sở di truyền tính kháng đạo ôn trên lúa......................................................... 9 2.2. Chỉ thị ADN sử dụng trong chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn ......................... 11 2.2.1. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) .................................................. 11 2.2.2. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites)............................................................... 12 2.2.3. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeates) ........................................................ 12 2.2.4. Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphism) .............................................. 13 2.2.5. Chỉ thị CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) .......................... 14 2.3. Các gen kháng đạo ôn và chỉ thị phân tử liên kết ............................................. 14 2.4. Nghiên cứu lúa kháng đạo ôn trên thế giới ....................................................... 24 2.4.1. Đa dạng di truyền nguồn gen kháng bệnh đạo ôn ............................................ 24 2.4.2. Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn ................... 25 2.4.3. Chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn bằng QTL ................................................. 27 2.5. Nghiên cứu lúa kháng đạo ôn ở Việt Nam ....................................................... 27 iii 2.5.1. Đa dạng di truyền quần thể nấm đạo ôn ........................................................... 28 2.5.2. Xác định gen kháng hiệu quả và quy tụ gen kháng vào các giống lúa ............. 29 2.5.3. Nghiên cứu lai tạo trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn ..................... 30 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 32 3.1. Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 32 3.2. Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 32 3.3. Đối tượng/vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 32 3.4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 35 3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 35 Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 41 4.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học ..................................................................... 41 4.1.1. Thời gian sinh trưởng ....................................................................................... 41 4.1.2. Khả năng đẻ nhánh, chiều cao cây ................................................................... 44 4.1.3. Đặc điểm hình thái của các dòng/giống lúa thí nghiệm ................................... 46 4.1.4. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất ................................................... 49 4.2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo .............................................................................. 52 4.3. Kết quả khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn của các dong/giống lúa nghiên cứu ........................................................................................................ 53 4.4. So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo ...................................... 56 Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 61 5.1. Kết luận............................................................................................................. 61 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 61 Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 62 Phụ lục .......................................................................................................................... 71 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BC Lai hồi giao bp basepair BVTV Bảo vệ Thực vật CLT-CTP Cây lương thực - Cây thực phẩm cs Cộng sự ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long ĐBSH Đồng bằng sông Hồng MAS Chọn giống bằng ứng dụng chỉ thị phân tử NN Nông nghiệp v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Phân loại chi Oryza ........................................................................................ 4 Bảng 2.2. Gen kháng bệnh đạo ôn................................................................................ 15 Bảng 2.3. Chỉ thị ADN liên kết với gen kháng đạo ôn ................................................ 20 Bảng 3.1. Danh sách các dòng, giống lúa thí nghiệm .................................................. 33 Bảng 3.2. Trình tự mồi liên kết gen kháng bệnh đạo ôn .............................................. 35 Bảng 4.1. Thời gian sinh trưởng của các dòng/giống lúa nghiên cứu .......................... 42 Bảng 4.2. Khả năng đẻ nhánh, chiều cao cây các dòng/giống lúa thí nghiệm ............. 44 Bảng 4.3. Một số đặc điểm hình thái của các dòng/giống lúa thí nghiệm ................... 47 Bảng 4.4. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất ............................................... 49 Bảng 4.5. So sánh kết quả xác định gen kháng bằng PCR và lây nhiễm nhân tạo ......... 56 Bảng 4.6. Các giống lúa có triển vọng ......................................................................... 60 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Đạo ôn gây hại trên lá, cổ lá, cỏ bông ........................................................... 6 Hình 2.2. Ruộng lúa bị bệnh đạo ôn hại nặng ............................................................... 6 Hình 2.3. Nấm sinh sản vô tính tạo cành bào tử ........................................................... 6 Hình 2.4. Bào tử nấm ..................................................................................................... 6 Hình 2.5. Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của bào tử nấm đạo ôn................................. 7 Hình 4.2. Kết quả khảo sát chỉ thị RM527 liên kết gen kháng Piz5 trên 50 dòng/giống lúa nghiên cứu........................................................................... 53 Hình 4.3. Kết quả khảo sát chỉ thị RM7102 liên kết gen kháng Pita trên 50 dòng/giống lúa nghiên cứu........................................................................... 54 Hình 4.4. Kết quả khảo sát chỉ thị RM1233 liên kết gen kháng Pik-p trên 50 dòng/giống lúa nghiên cứu........................................................................... 55 Hình 4.5. Hình ảnh thể hiện tính kháng, nhiễm của một số giống lúa trong thí nghiệm.......................................................................................................... 59 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dương Thị Thưởng Tên Luận văn: “Khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn trên một số giống lúa bằng chỉ thị phân tử”. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới, là nguồn cung cấp lương thực cho hơn 50% dân số thế giới. Ở Việt Nam, lúa là cây trồng truyền thống gắn bó lâu đời với người nông dân Việt Nam, vừa cung cấp nguồn lương thực chính, vừa là nông sản xuất khẩu có kim ngạch lớn ở nước ta. Tuy nhiên, bệnh đạo ôn đã gây tác hại nghiêm trọng ở một số nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Philippin và Việt Nam. Mỗi năm bệnh đạo ôn làm thế giới mất một lượng lúa đủ để nuôi sống hơn 60 triệu người. Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn xuất hiện ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam. Năm 1992, trong tổng số 5 triệu ha diện tích trồng lúa có tới 600.000 ha nhiễm bệnh đạo ôn, 1/4 trong số diện tích này đã bị nhiễm bệnh trầm trọng. Năng suất lúa trên diện tích bị nhiễm đã giảm từ 15-30%. Trong chiến lược phòng chống bệnh đạo ôn, việc tìm ra các gen kháng nhằm tạo ra các giống lúa kháng bệnh đạo ôn vẫn được coi là biện pháp hiệu quả và bền vững. Tuy nhiên chủng nấm đạo ôn rất đa dạng tại các vùng sinh thái khác nhau và dễ phát sinh chủng mới, trong khi đó, mỗi gen kháng chỉ có khả năng chống được một số chủng nhất định. Bởi vậy, luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới hoặc gen kháng trên nguồn vật liệu mới để chống lại các chủng mới phát sinh. Mục đích nghiên cứu Dùng chỉ thị phân tử liên kết gen kháng đạo ôn để khảo sát sự có mặt của gen kháng ở một số giống lúa vật liệu. Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này, thí nghiệm 1 được bố trí theo phương pháp quan sát vườn dòng không nhắc lại của IRRI, diện tích ô 5m2. Đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học. Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng kháng nhiễm của các mẫu dòng/giống với nguồn nấm đạo ôn. Thí nghiệm 3: tiến hành lấy mẫu, tách chiết ADN, chạy PCR với ba cặp mồi: RM527, RM1233, RM7102 và điện di trên gel polyacrylamide để kiểm tra sự có mặt của gen kháng trong các mẫu giống. viii Kết quả chính và kết luận Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học cho thấy: các mẫu giống có đặc điểm nông sinh học rất đa dạng, một số mẫu giống có kiểu hình đẹp, năng suất khá, chất lượng cao có thể sử dụng để làm vật liệu trong chọn tạo giống lúa chất lượng. Trong 50 mẫu giống lúa lây nhiễm nhân tạo đạo ôn có 26 mẫu giống thể hiện tính kháng tốt, 20 mẫu giống nhiễm nhẹ, 4 mẫu giống nhiễm nặng. Kết quả kiểm tra gen kháng nhận thấy có 12 mẫu giống mang 2 gen kháng, 31 giống mang 1 gen kháng, 7 giống không có gen kháng nào. Trong 13 mẫu giống có chứa 2 gen kháng có 5 mẫu giống thể hiện tính kháng mạnh với chủng vi khuẩn nấm đạo ôn, 6 mẫu giống thể hiện tính kháng vừa (nhiễm nhẹ), 2 mẫu giống nhiễm nặng. Trong những mẫu giống thể hiện tính kháng tốt có những giống chứa 2 gen kháng, có giống chứa 1 gen kháng hoặc không có gen kháng nào. Như vậy, có thể những giống đó chứa gen kháng nào khác, cần xác định thêm những gen kháng khác để có kết luận chính xác hơn về tính kháng. Trong 13 mẫu giống có chứa 2 gen kháng có 11 mẫu giống thể hiện tính kháng mạnh hoặc kháng vừa với chủng vi khuẩn nấm đạo ôn sử dụng lây nhiễm nhân tạo. Đây là nguồn vật liệu tốt trong chọn tạo lúa kháng đạo ôn. ix THESIS ABSTRACT Master candidate: Duong Thi Thuong Thesis title: "Using molecular marker to screen blast resistance gene in rice germplasm". Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA). Rice (Oryza sativa L.) is an important food crop in the world. It is also a source of food for more than 50% of the world population. In Vietnam, the rice crop is a long tradition of sticking with the farmers. Not only has it provided the main source of food for Vietnamese, but it also can be exported with a large turnover for the country. However, blast disease threats rice production. It caused serious damage in some countries such as Japan, India, Philippines and Vietnam. Each year the yield loss by blast in the world counted enough to feed more than 60 million people. In Vietnam, the blast occurred in the whole country. In 1992, we planted a total of 5 million hectares of rice. In which, 600,000 hectares had been infected by blast disease and 1/4 of this area was severely infected. Rice yield in the infected area has decreased by 15-30%. One of strategies to prevent effects of rice blast is finding resistance genes to create new rice varieties. This is still considered to be effective method and sustainable. However, rice blast fungus strains varied in different ecological zones and easy to generate new strains. Moreover, a resistance gene has effective with only certain strain. Therefore, breeders struggle to find new resistance genes or resistance genes from the new resources to combat new arising strains. Research Objectives: Using molecular markers linked to blast resistance genes to survey the presence of resistance genes in rice germplasm. Methods In this research, the first experiment was arranged in line based on IRRI without replication with the area of 5 m2 for each line. Agronomic characteristics (growth duration, plant high, number of tiller…) were evaluated. The second experiment: rice varieties were inoculated with blast fungus and evaluated for resistance or susceptible. The third experiment: three SSR markers RM527, RM1233 and RM7102 linked to resistance genes Piz5, Pik-p, Pita, respectively, were applied to check the presence of resistance genes by using DNA genome of rice varieties. x Main findings and conclusions The results of assessment of agricultural characteristics showed that their characteristics are very diverse. Some of them have good plant type, quite productive and high quality. These can be used as material for breeding high quality rice. In fifty varieties were inoculated with blast, twenty six varieties shown high resistance, twenty varieties shown medium resistance and four varieties were susceptible. The results of screening marker shown that there are twelve varieties bringing two resistance genes, thirty one varieties carrying one resistance gene and seven varieties do not have the resistance gene. In thirteen varieties carrying two resistance genes, five varieties shown high resistance with rice blast fungus strains, six varieties have medium resistance and two varieties is infection. The rice varieties gave highly resistance. In which, some varieties possess two resistance genes, some varieties carry a single resistance gene and some do not have any of checked genes. Thus, it is possible that these varieties may contain another resistant gene. It is necessary to identify other resistance genes in order to have more accurate conclusions for these varieties. In thirteen varieties carrying two resistance genes, eleven varieties showed high or medium resistance to rice blast fungus strain using in inoculation. This is a good resource for breeding rice blast resistance variety. xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế giới, được trồng phổ biến ở 112 nước trên thế giới. Lúa là nguồn cung cấp lương thực cho hơn 50% dân số thế giới và là lương thực chính cho phần lớn các quốc gia ở Châu Á, một số nước ở Châu Phi và Mỹ Latinh (Chang, 2000). Ở Việt Nam, lúa là cây trồng truyền thống gắn bó lâu đời với người nông dân Việt Nam, vừa cung cấp nguồn lương thực chính, vừa là nông sản xuất khẩu có kim ngạch lớn ở nước ta (Trần Văn Đạt, 2008). Năng suất và sản lượng lúa của nước ta không ngừng tăng lên, năm 1990 năng suất lúa của nước ta đạt 31,8 tạ/ha; năm 2000: 42,4 tạ/ha; năm 2010: 53 tạ/ha, năm 2014: 57,6 tạ/ha. Sản lượng lúa năm 1990 là 19,2 triệu tấn; năm 2000: 32,5 triệu tấn; năm 2010: 39,9 triệu tấn và năm 2014: 44,9 triệu tấn (Bui Ba Bong, 2010; Tổng cục Thống kê). Tuy nhiên nhiều bệnh hại thường xuyên xuất hiện, gây tổn thất lớn về sản lượng lúa như: bệnh đạo ôn (do nấm Pyricularia oryzae), bạc lá (do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae), khô vằn (do nấm Zhizoctonia sonani). Trong đó bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra làm thiệt hại lớn về sản lượng lúa gạo toàn cầu và là bệnh có ý nghĩa quan trọng nhất đối với nghề trồng lúa trên toàn thế giới. Hiện nay, bệnh đạo ôn đã gây tác hại nghiêm trọng ở một số nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Philippines và Việt Nam (Valent and Chumley, 1991; Gheysen, 2004). Mỗi năm bệnh đạo ôn làm thế giới mất một lượng lúa đủ để nuôi sống hơn 60 triệu người (Roxanne Khamsi, 2005). Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn xuất hiện ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam. Tuy nhiên mức độ bệnh xảy ra ở miền Bắc và miền Trung thường trầm trọng. Dịch bệnh xảy ra có thể gây thiệt hại cho lúa vào khoảng 10-25%. Năm 1992, trong tổng số 5 triệu ha diện tích trồng lúa có tới 600.000 ha nhiễm bệnh đạo ôn, 1/4 trong số diện tích này đã bị nhiễm bệnh trầm trọng. Năng suất lúa trên diện tích bị nhiễm đã giảm từ 15-30% . Trong chiến lược phòng chống bệnh đạo ôn, việc tìm ra các gen kháng nhằm tạo ra các giống lúa kháng bệnh đạo ôn vẫn được coi là biện pháp hiệu quả và bền vững. Khoảng hơn 100 Pi loci và 350 QTL liên quan đến tính kháng bệnh đạo ôn ở cây lúa đã được phát hiện (Tanweer et al., 2015), tạo cơ sở cho việc chọn tạo giống mang gen kháng bệnh. Tuy nhiên chủng nấm đạo ôn rất đa dạng 1 tại các vùng sinh thái khác nhau và dễ phát sinh chủng mới, trong khi đó, mỗi gen kháng chỉ có khả năng chống được một số chủng nhất định. Bởi vậy, các nhà khoa học luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới hoặc gen kháng trên nguồn vật liệu mới để chống lại các chủng mới phát sinh. Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát nguồn gen kháng bệnh đạo ôn trên một số giống lúa bằng chỉ thị phân tử”. 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Khảo sát nguồn gen kháng trên một số giống lúa vật liệu nhằm phục vụ công tác chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn. 1.2.2. Yêu cầu - Đánh giá khả năng kháng đạo ôn của các dòng/giống lúa bằng lây nhiễm nhân tạo. - Xác định sự có mặt của các gen kháng đạo ôn bằng kỹ thuật nhân gen (Polymerase Chain Reaction - PCR). 1.3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1. Ý nghĩa khoa học  Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn của các dòng/giống lúa bằng lây nhiễm nhân tạo cho phép xác định được các dòng/giống lúa có khả năng kháng tốt dùng làm nguồn vật liệu khởi đầu cho chương trình chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn trong nước.  Kết hợp chỉ thị phân tử trong đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn ở lúa giúp xác định chính xác hơn nguồn vật liệu khởi đầu trong chọn tạo lúa chất lượng, năng suất cao có khả năng kháng đạo ôn. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn  Kết quả của đề tài đã góp phần bổ sung nguồn vật liệu khởi đầu là các dòng/giống lúa có khả năng kháng đạo ôn, năng suất khá, chất lượng gạo tốt sử dụng để lai cải tạo các giống lúa thuần đang trồng phổ biến ở Đồng bằng sông Hồng, nhằm mục đích cải tạo chất lượng lúa gạo ở khu vực miền Bắc.  Việc sử dụng chọn giống bằng chỉ thị phân tử (MAS) giúp tiết kiệm thời gian, giảm chi phí chọn giống và đáng tin cậy hơn do không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. CÂY LÚA VÀ BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi. Năm 1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza. Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài (Trần Văn Đạt, 2005). Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định danh các loài lúa dại. Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp phân tích các loài lúa được chính xác hơn (Trần Văn Đạt, 2005). Hội nghị di truyền lúa Quốc tế tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế, Philippines năm 1967 đã khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng (Chang and Vaughan, 1991). Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn nhóm genome. Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài được ghi ở Bảng 2.1 (Vaughan, 1994). Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài, trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA. Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ là Indica và Japonica. Trong quá trình tiến hoá của cây lúa, ngoài hai loài phụ Indica và Japonica còn có nhiều loại hình trung gian như Javanica v.v... (Nguyễn Văn Hoan, 2006; Trần Văn Minh, 2004). Tác giả Tang et al. (2004) so sánh bộ gen lục lạp của giống lúa 93 - 11 (đại diện loài phụ Indica) và giống lúa Peiai'64S (giống lúa lai thuộc loài phụ Indica, nhưng nguồn gốc mẹ thuộc loài phụ Japonica) cho thấy sự phân chia bộ gen lục lạp của hai loài phụ Indica và Japonica xảy ra cách đây khoảng 86.000 - 200.000 năm trước. 3 Bảng 2.1. Phân loại chi Oryza Nhóm/loài Tên khác Số nhiễm sắc thể Bộ gen 24 AA 24 AA 24 AA 24 AA I. Nhóm O. sativa 1. O. sativa L 2. O. nivara Shama et Shastry 3. O. rufipogon Griff. O. rufipogon O. perennis, O. rufipogon 4. O. glaberrima Steud. 5. O. barthii A. Chev. O. breviligulata 24 AA 6. O. longistaminata Chev. et Roehr O. barthii 24 AA 24 AA 7. O. meridionalis Ng II. Nhóm O. officinalis O. latifolia 8. O. officinanis Wall ex Watt O. minuta 24 CC 9. O. minuta Presl et Presl O. officinanis 48 BBCC 10. O. rhizomatis Vaughan 24 CC 11. O. eichingeri Peter 24 CC 24, BB, 48 BBCC 13. O. latifolia Desv 48 CCDD 14. O. alta Swallen 48 CCDD 15. O. grandiglumis (Doell) Prod 48 CCDD 16. O. australiensis Domin 24 EE 17. O. brachyantha Chev. et Roehr. 24 FF 18. O. schlechteri Pilger 48 Chưa rõ 19. O. ridleyi Hook. f. 48 Chưa rõ 20. O. longiglumis Jansen 48 Chưa rõ 24 Chưa rõ 24 Chưa rõ 12. O. punctata Kotschy ex. Steud. O. schweinfurthia III. Nhóm O. ridleyi IV. Nhóm O. meyeriana 21. O. meyeriana (Zoll. et Mor. ex Steud) Baill 22. O. granulata Nees et Am. ex Watt. Nguồn: Vaughan (1994) 4 Tác giả Vitte et al. (2004) cũng cho rằng hai loài phụ Indica và Japonica được phân hoá độc lập với nhau, cách đây khoảng 200.000 năm. Trong khi đó, tác giả Jianxin phân tích ADN nhân tế bào và cho rằng lúa Indica và Japonica được tách ra từ một tổ tiên chung, cách đây khoảng 440.000 năm (Jianxin and Bennetzen, 2004). Jason et al. (2006) nghiên cứu biến đổi trình tự ADN của ba vùng gen bằng phương pháp địa lý - thực vật để khảo sát quá trình thuần hoá lúa trồng. Kết quả cho thấy, cây lúa trồng đã được thuần hóa ít nhất là hai lần từ các quần thể khác nhau của loài Oryza rufipogon và sản phẩm của hai lần biến đổi này đã tạo ra hai loài phụ là Indica và Japonica. Tác giả Zhu et al. (2007) trên cơ sở giải mã trình tự ADN của 10 gen ở nhân tế bào của lúa cho rằng, quá trình thuần hoá liên quan chặt chẽ với quá trình giảm đa dạng di truyền của các giống lúa dại. Đa dạng di truyền của lúa Japonica thấp hơn 2 lần so với đa dạng di truyền của lúa Indica. 2.1.2. Bệnh đạo ôn trên lúa Nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở giai đoạn vô tính được đặt tên là P. oryzae (syn. Pyricularia oryzae), ở giai đoạn hữu tính được đặt tên là Magnaporthe grisea và gần đây dựa vào các nghiên cứu phân tử, được đặt tên là M. oryzae (Hà Viết Cường, 2008). Ở luận văn này, chúng tôi sử dụng tên gọi Pyricularia oryzae. Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, là một trong những bệnh gây hại quan trọng nhất trên cây lúa. Bệnh đạo ôn được phát hiện tại Italia năm 1560, sau đó là ở Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Mỹ năm 1906 và Ấn Độ năm 1913, … Ở nước ta, Vincens (người Pháp) đã phát hiện nguồn bệnh ở Nam Bộ vào năm 1921. Năm 1951, Roger (người Pháp) cũng đã xác định sự xuất hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc Bộ (Vũ Triệu Mân và cs., 2007). Bệnh đạo ôn đã được tìm thấy ở ít nhất 85 quốc gia và chưa có nơi nào báo cáo là tiêu diệt được hoàn toàn mầm bệnh. Thiệt hại về năng suất do bệnh đạo ôn gây ra có thể lên tới 75% hoặc cao hơn nữa nếu gặp điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển. Triệu chứng: Nấm có thể xâm nhiễm gây bệnh ở tất cả các bộ phận trên mặt đất gồm: lá, đốt thân, cổ lá, cổ bông, cổ gié. Các nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ mẫn cảm của lá tỷ lệ thuận với mức độ mẫn cảm trên cổ bông (Hà Viết Cường, 2008). 5 Tính mẫn cảm của cây đối với nấm phụ thuộc nhiều vào yếu tố môi trường cũng như các yếu tố liên quan đến phát triển của cây. Tính mẫn cảm thường giảm theo tuổi cây và tuổi lá; tính mẫn cảm tăng mạnh khi bón thừa đạm. Trái lại bón Si làm giảm tính mẫn cảm. Ngoài ra, đặc điểm vết bệnh thay đổi đáng kể theo mức độ mẫn cảm. Hình 2.1. Đạo ôn gây hại trên lá, Hình 2.2. Ruộng lúa bị bệnh cổ lá, cỏ bông đạo ôn hại nặng Tác nhân gây bệnh: Nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes), tuy nhiên ngoài tự nhiên nấm chỉ sinh sản vô tính tạo cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh không màu, 2 vách ngăn, hình quả lê (hoặc nụ sen) (Hà Viết Cường, 2008). Hình 2.4. Bào tử nấm Hình 2.3. Nấm sinh sản vô tính tạo cành bào tử Xâm nhiễm gây bệnh: Nấm đạo ôn là nấm bán sinh dưỡng (hemibiotroph) với pha sinh dưỡng biotroph ở giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm. 6 Hình 2.5. Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của bào tử nấm đạo ôn Giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm bao gồm pha tiền xâm nhập (prepenneration): bào tử nấm tiếp xúc trên bề mặt lá, đỉnh bào tử nứt vỡ và tiết ra một giọt chất nhầy gắn kết chặt bảo tử và bề mặt lá. Lớp chất nhày này chứa các hợp chất cacbohydrat và glycoprotein (Hà Viết Cường, 2008). Tiếp theo bào tử nấm nảy mầm tạo ống mầm, hình thành một tế bào ở đỉnh ống mầm và phát triển thành vòi áp (appressorium). Vòi áp của nấm là một cấu trúc dạng vòm, có vách dày, màu đậm do bị melanin hóa. Sự melanin hóa làm vách vòi áp trở nên chắc chắn hơn. Bên trong vòi áp, nấm tích lũy nhiều glycerol và do vậy áp lực trương của vòi áp nấm đạo ôn rất lớn, có thể tới 80 at (Hà Viết Cường, 2008). Tiếp theo quá trình tiền xâm nhập là xâm nhập của bào tử: Từ vòi áp sẽ hình thành một sợi nấm nhỏ gọi là đế xâm nhập (infection peg) để xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin và vào bên trong tế bào biểu bì. Bên trong tế bào biểu bì, đỉnh đế xâm nhập sẽ phình to tạo thành vòi hút. Nấm sẽ tiết các enzyme và các effector qua màng vòi hút vào tế bào ký chủ để hấp thu dinh dưỡng, dần dần vách tế bào ký chủ sụp đổ và nấm tiếp tục phát triển sang tế bào bên cạnh (Hà Viết Cường, 2008). Bệnh đạo ôn là một trong số các loại bệnh phổ biến và nguy hại nhất đối với lúa, có hơn 85 quốc gia trồng lúa trên thế giới phát hiện dịch bệnh. Bệnh có khả năng thích nghi cao với các điều kiện của môi trường, nơi có khí hậu ôn hòa, độ ẩm cao, hay ở những vùng đất thấp và những vùng núi cao nhiệt đới. Bệnh có 7 thể làm cho cây lúa cháy rụi hoàn toàn nếu bị nhiễm bệnh sớm ở giai đoạn mạ. Nếu nhiễm muộn ở giai đoạn trổ, bệnh làm thối đốt thân, thối cổ gié làm cây đổ gãy, hạt lép hay làm giảm trọng lượng hạt. Theo báo cáo, năng suất lúa bị giảm do đạo ôn gây ra có thể lên tới 80% ở vùng dịch (Awoderu and Esuruoso, 1974) và ước tính, cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỷ lệ hạt kém phẩm chất (gạo xay ra thường bị nát, tỷ lệ tấm cao, không đủ tiêu chuẩn xuất khẩu) tăng 5% (Phạm Văn Kim, 2002). Với những tác hại gây ra, bệnh đạo ôn là một trong những bệnh có sức tàn phá mạnh nhất trong các bệnh hại lúa, nó đe dọa nghiêm trọng tới nguồn an ninh lương thực của thế giới (hàng năm mất khoảng 157 triệu tấn). Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện ở vùng Nam Bộ rất sớm, từ thời Pháp thuộc năm 1921 do Vincens (người Pháp). Hiện nay, bệnh đạo ôn đã gây tác hại nghiêm trọng ở một số nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Philippin và Việt Nam (Gheysen, 2004). Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, vụ đông Xuân 2003 - 2004 tổng diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn ở miền Bắc là 202.998 ha, trong đó diện tích bị nhiễm đạo ôn lá là 178.147 ha (diện tích bị nặng là 4.348 ha), diện tích bị nhiễm đạo ôn cổ bông là 24.752 ha. Hầu hết các giống phổ biến trong sản xuất đều bị nhiễm đạo ôn với mức độ khác nhau: Khang dân 18, Q5, Bắc thơm, VN10, DT10, DT11. v.v. Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng trồng lúa lớn nhất Việt Nam, khi bị nhiễm bệnh đạo ôn thiệt hại cho năng suất lúa ước tính giảm tới 20%. Một vài năm trở lại đây, trước những biến đổi bất lợi của điều kiện ngoại cảnh bệnh đạo ôn có nguy cơ bùng phát triên diện rộng và có thể phát triển thành dịch nếu không được phát hiện kịp thời, hầu hết các giống chất lượng đang trồng phổ biến (OM149, OMCS2000) đều bị nhiễm đạo ôn với các mức độ khác nhau. Trong vụ đông Xuân 2005 - 2006 bệnh gây thiệt hại lớn ở hầu hết các địa phương (An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ) trên giống lúa OM1490, thiệt hại cho năng suất ước tính giảm từ 20 - 80%. Để phòng trừ bệnh đạo ôn, nông dân thường sử dụng thuốc hóa học như một phương thức hữu hiệu, ở một số nơi khác nông dân thường tiến hành phun nhiều lần và trộn nhiều loại thuốc với nhau, điều này đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe của chính người nông dân đồng thời môi trường xung quanh cũng bị ảnh hưởng. Đến nay, bộ gen của nấm đạo ôn đã được giải trình tự đầy đủ do nhóm nghiên cứu của Ralph (Đại học Bắc Carolina, Mỹ) tiến hành. Kết quả giải trình tự gen đã xác định Pyricularia oryzae có hơn 11000 gen và tiết ra gần 800 protein để 8