Tài liệu Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù cây drosera burmanni vahl trong thu nhận hợp chất anthraquinone

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DICH HUYỀN PHÙ CÂY ̣ Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ THU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DICH HUYỀN PHÙ CÂY ̣ Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ HOÀNG THỊ THU TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ThS. QUÁCH NGÔ DIỄM PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này đƣợc hoàn thành với s ự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầ y cô, các anh chị và các bạn. Em xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành đế n : PGS.TS Bùi Văn Lê ̣ , ngƣời đã tâ ̣n tình hƣớng dẫn và ta ̣o mo ̣i điề u kiê ̣n để em thƣ̣c hiê ̣n khóa luâ ̣n này . Thạc sĩ Quách Ngô Diễm Phƣơng, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ dạy và luôn động viên em trong những hoàn cảnh khó khăn nhất. Đề tài này đƣợc hoàn thành với rất nhiều nhiệt tình và tâm huyết của chị. Cảm ơn chị vì tất cả. Em cảm ơn Tiến sĩ Phan Phƣớc Hiền, những chỉ dạy và giúp đỡ của thầy đã giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Thạc sĩ Kiều Phƣơng Nam , ngƣời luôn gợi ý và cho em những lời khuyên bổ ích. Em cảm ơn anh Điề n , anh Hoàng, anh Cƣờng và các anh chi ̣phòng sắ c ký , Viê ̣n Công nghê ̣ Sin h ho ̣c và Công nghê ̣ Môi trƣờng , ĐH Nông Lâm TP . HCM. Cảm ơn vì những giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong suốt thời gian chúng em thƣ̣c tâ ̣p. Cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tƣ trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đô ̣ng viên tôi nhƣ̃ng lúc gă ̣p khó khăn trong đề tài . Cảm ơn lớp CNSH 29 thân yêu và các ba ̣n thân đã cùng tôi chia sẻ tấ t cả nhƣ̃ng nỗi buồ n vui suố t bố n năm đa ̣i ho ̣c. Và trên hết , con cảm ơn bố m ẹ, chị gái và em trai yêu quý đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin tƣởng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chỗ dựa vững chắc nhất trong cuô ̣c số ng. Tháng 9/2007 Hoàng Thị Thu iii TÓM TẮT Đề tài nghiên cƣ́u “Khảo sát khả năng ƣ́ng du ̣ng kỹ thuâ ̣t nuôi cấ y mô sẹo, tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhâ ̣n hơ ̣p chấ t anthraquinone” đƣơ ̣c tiế n hành ta ̣i trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đa ̣i ho ̣c Quố c gia thành phố Hồ Chí Minh và phòng sắ c ký , Viê ̣n Công nghê ̣ Sinh ho ̣c và Công nghê ̣ Môi trƣờng , Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh tƣ̀ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007. Kế t quả thu đƣơ ̣c: - Mô se ̣o tƣ̀ mẫu lớp mỏng tế bào cây D. burmanni Vahl đƣơ ̣c hin ̀ h thành trên môi trƣờng khoáng cơ bản Gamborg’s B5 bổ sung: NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l), đƣờng 20 g/l, PVP (1,25 mg/l) ở pH 5,8, trong điề u kiê ̣n ủ tố i . - Các kỹ thuật sắc ký cột , sắ c ký bản mỏng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng nhằ m cô lâ ̣p và ly trích hợp chất anthraquinone trong cây D. burmanni in vitro. Hơ ̣p chấ t này đ ƣợc sử dụng nhƣ chất tham chiếu để định lƣợng anthraquinone trong các thành phần khác nhau của cây Drosera burmanni Vahl. - Kế t quả đinh ̣ lƣơ ̣ng anthraquinone bằ ng kỹ thuâ ̣t HPLC cho thấ y : hàm lƣơ ̣ng anthraquinone trong rễ là 3,03% so với tro ̣ng lƣơ ̣ng khô, nhiề u hơn trong thân lá (2,78%); ở cây không có sắc tố đỏ là 2,8% trong khi ở cây có sắ c tố đỏ là 0,78%; trong sinh khố i huyề n phù tế bào là 0,02% ( so với tro ̣ng lƣơ ̣ng tƣơi ), trong khi không thấ y có sƣ̣ hiê ̣n diê ̣n của anthraquinone trong dich ̣ môi trƣờng. iv SUMMARY The thesis “Study on application of callus and suspension cultures in Drosera burmanni Vahl to produce anthraquinone compound” was carried out at Plant Biotechnology lab, University of Natural Sciences; and Chromatography room, Research Institute for Biotechnology and Enviromental Technology, University of Agriculture and Forestry, HCM city from March to August, 2007. Results: - Callus of D. burmanni Vahl was cultured successfully by using Gamborg’s B5 medium (modified) supplemented with NAA (0,2 mg/l), 2,4-D (0,2 mg/l), succrose (20g/l), PVP (1,25 mg/l), pH was adjusted to 5,8 before autoclaving. - Column Chromatography and Thin Layer Chromatography were used to purify anthraquinone compound in D. burmanni. This compound was used as authentic sample for HPLC technique. - Roots of D. burmanni contained 3,01% dry weight (DW) of anthraquinone, larger than 2,78% in leaves. - Anthraquinone content of red-leaf D. burmanni Vahl took 0,78% of DW, compared with 2,78% DW in green-leaf trees. - Biomass of D. burmanni’s suspension contained 0,02% of fresh weight of anthraquinone, while no quantifiable amounts of anthraquinone has been found in spent medium. Ho Chi Minh city, September, 2007. Hoang Thi Thu v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tƣ̣a ..................................................................................................................... .i Lời cảm ơn ................................................................................................................. iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Summary ..................................................................................................................... v Mục lu ̣c ..................................................................................................................... vi Danh sách các chƣ̃ viế t tắ t .......................................................................................... ix Danh sách các hiǹ h ..................................................................................................... x Danh sách các sơ đồ và biểu đồ ................................................................................ xii Danh sách các bảng .................................................................................................. xiii Chƣơng1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ............................................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa đề tài .................................................................................................. 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl .......................................................... 3 2.1.1. Vị trí phân loại................................................................................................ 3 2.1.2. Phân bố ........................................................................................................... 3 2.1.3. Mô tả hình thái ............................................................................................... 4 2.1.4. Đặc tính sinh học ............................................................................................ 6 2.1.5. Đặc điểm sinh thái .......................................................................................... 7 2.1.6. Thành phần hóa học ....................................................................................... 8 2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống .............................................................................. 11 2.1.8. Tầm quan trọng ............................................................................................ 12 2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái ...................................................................................... 12 2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật ................................................. 12 2.1.8.3. Gía trị dƣợc tính ........................................................................................... 12 2.1.8.4. Ứng dụng trong công nghiệp........................................................................ 14 2.1.8.5. Gía trị kinh tế................................................................................................ 15 2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc............................................................ 16 2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp ........................................................................................................ 17 2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp ......................................................................... 17 2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo ........................................................................................... 18 2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo ......................................................................................... 18 2.2.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo .................................................................... 19 2.2.3. Nuôi cấy dịch huyền phù.............................................................................. 19 2.2.3.1. Khái niệm huyền phù tế bào......................................................................... 19 2.2.3.2. Nguyên tắc tạo huyền phù ............................................................................ 19 vi 2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo huyền phù tế bào ............................... 20 2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay ......................................... 20 2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp .................................................................................................. 22 2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù ........................................................................................................... 22 2.2.4.1. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy ..................................................................... 22 2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao ......................................... 22 2.2.4.3. Bổ sung tiền chất ......................................................................................... 22 2.2.4.4. Cố định tế bào ............................................................................................. 23 2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hóa mô ............................................................................ 23 2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) .......................................................................... 23 2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn .................................................... 24 2.3.1. Phƣơng pháp ly trích – thu nhận hợp chất .................................................. 24 2.3.1.1. Sắc ký cột .................................................................................................... 24 2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) ..................... 26 2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế ........................................................................... 27 2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp ..... 28 Chƣơng 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 31 Thời gian và địa điểm thực hiện................................................................................ 31 3.1. Nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù ......................................................... 31 3.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 31 3.1.2. Phƣơng pháp................................................................................................ 33 3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 33 3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 34 3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 35 3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 36 3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 37 3.2. Ly trić h và cô lâ ̣p hơ ̣p chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 38 3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 38 3.2.2. Phƣơng pháp................................................................................................ 39 3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC .............. 40 3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 40 3.3.2. Phƣơng pháp ............................................................................................... 40 3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp......................................... 40 3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 41 vii 3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣợng hợp chất anthraquinone........................................................................... 41 3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 43 3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ............................................... 44 3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................ 45 3.4. Xử lý thống kê ............................................................................................. 45 Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................. 46 4.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù ........................................................... 46 4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 46 4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 48 4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 49 4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 54 4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 56 4.2. Ly trić h và cô lâ ̣p hơ ̣p chấ t anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 58 4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC ............................. 59 4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 59 4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơ ̣ng hợp chất anthraquinone ................................................................................... 61 4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 62 4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ...................................................... 64 4.3.5. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................. 66 Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................... 68 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 68 5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù .......................................................... 68 5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC ......... 68 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-benzylaminopurine CRD : Completely Randomized Design (Hoàn toàn ngẫu nhiên) ctv : cộng tác viên HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắ c ký lỏng ao áp ) IAA : 3-indolyl-acetic acid IBA : 3-indolebutyric acid MS : Murashige & Skoog, 1962 NAA : naphthalene acetic acid PVP : poly vinyl pyrrolidone TCL : Thin Cell Layer (Lớp mỏng tế bào ) TLC : Thin Layer Chromatography (Sắ c ký bản mỏng) ix DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1. Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới .................. 4 Hình 2.2. Hình thái của Drosera burmanni Vahl .................................................... 4 Hình 2.3. Lá D. burmanni ........................................................................................ 5 Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên. ........................................................... 7 Hình 2.5. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside ............ 10 Hình 2.6. Mô ̣t số loa ̣i Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới ......................... 15 Hình 2.7. Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc ................... 21 Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................... 21 Hình 2.9. Sắ c ký cô ̣t ............................................................................................... 24 Hình 2.10. Mô hiǹ h sắ c ký nhanh cô ̣t khô ............................................................. 26 Hình 2.11. Sắc ký lớp mỏng ................................................................................... 27 Hình 2.12. Sơ đồ hoa ̣t đô ̣ng các bô ̣ phâ ̣n của máy HPLC ...................................... 29 Hình 3.1. Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro ................................................ 31 Hình 4.1. Mô se ̣o đƣơ ̣c hình thành tƣ̀ mẫu lớp mỏng cây D.burmanni trên môi trƣờng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D với nồ ng đô ̣ thay đổ i ..................................................................................................... 52 Hình 4.2. Mô se ̣o đƣơ ̣c hiǹ h thành tƣ̀ mẫu lớp mỏng lóng thân cây D. burmanni trên môi trƣờng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D với nồ ng đô ̣ thay đổ i ............................................................................................... 53 Hình 4.3.A. Mô sẹo nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc.............................................. 55 Hình 4.3.B. Cụm tế bào quan dƣới kính hiển vi 40X. ........................................... 55 Hình 4.3.C. Tế bào đơn quan dƣới kính hiển vi 40X ..............................................55 Hình 4.4. Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô se ̣o cây D. burmanni ........................................................................................ 57 Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm ................... 60 Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm ................... 60 x Hình 4.7. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm ................... 60 Hình 4.8. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm ................... 60 Hình 4.9. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở ở 70 ppm ................ 60 Hình 4.10. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình A. ............................................................................................................ 61 Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình B.............................................................................................................. 61 Hình 4.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu rễ cây D. burmanni Vahl ........................... 63 Hình 4.13. Sắc ký đồ HPLC của mẫu thân lá cây D. burmanni Vahl.................... 63 Hình 4.14. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl có sắc tố đỏ. .......... 65 Hình 4.15. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl không có sắc tố đỏ. ............................................................................................................ 65 Hình 4.16. Sắc ký đồ HPLC của mẫu dịch môi trƣờng sau khi lọc sinh khối tế bào ...................................................................................................... 66 Hình 4.17. Sắc ký đồ HPLC của sinh khối tế bào từ dịch huyền phù. ................... 66 xi DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ TRANG SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Con đƣờng tổ ng hơ ̣p các hơ ̣p chấ t thƣ́ cấ p ở thƣ̣c vâ ̣t ........................ 18 Sơ đồ 3.1. Quy trình ly trích và cô lập hợp chất anthraquinone .......................... 39 Sơ đồ 3.2. Quy trình xƣ̉ lý mẫu ............................................................................ 42 Sơ đồ 3.3. Quy triǹ h xƣ̉ lý dich ̣ huyề n phù .......................................................... 45 Sơ đồ 3.4. Quy trình ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chấ t anthraquinone (kế t quả) ........... 58 BIỂU ĐỒ Biể u đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy ................................................................................... 46 Biể u đồ 4.2. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy .... 54 ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone tham chiếu và giá trị diện tích peak ..................................................................... 59 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone ..................................................................................................... 8 Bảng 2.2. Các Naphthoquinone vi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera ................... 9 Bảng 2.3. Dƣợc tính và một số hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera ............................................................................................... .13 Bảng 3.1. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển mẫu cấy lớp mỏng ....................................... 33 Bảng 3.2. Bố trí nghiệm thức khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ............................................................... 34 Bảng 3.3. Bố trí nghiệm thức khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ..................................... 35 Bảng 3.4. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo ................................................................................ 36 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo ................................................................... 37 Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro ............................................................... 43 Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu cây có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ ................................................................ 44 Bảng 4.1. Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy ................... 46 Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của thành phần khoáng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng ................................................................................................ 47 Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng ............................................................................................................. 48 Bảng 4.4. Tỷ lệ tạo mô sẹo trên các môi trƣờng sử dụng kết hợp 2 loại hormone khác nhau ....................................................................................... 48 xiii Bảng 4.5. Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trƣờng khác nhau sau 21 ngày nuôi cấy ....................................................................................................... 49 Bảng 4.6. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg mô sẹo ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy trên các kiểu nuôi cấy khác nhau ......................................................... 54 Bảng 4.7. Kết quả ảnh hƣởng ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo .... 56 Bảng 4.8. Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak ............. 59 Bảng 4.9. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro ............................................................................................ 62 Bảng 4.10. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các mẫu có và không có sắ c tố đỏ ................................................................................................ 64 Bảng 4.11. Kế t quả đinh ̣ lƣơ ̣ng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù ....... 66 xiv 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngay từ buổi sơ khai, con ngƣời đã biết sử dụng thực vật không chỉ làm nguồn thực phẩm mà còn cho nhiều mục đích khác, đặc biệt là trong y học. Ngƣời ta sử dụng một số loại thực vật tƣơi để đắp lên vết thƣơng hoặc thực vật khô để sắc thuốc trị bệnh. Cách đây hơn một thế kỷ, dựa vào y học cổ truyền các nhà khoa học đã phát triển các quy trình cho phép tạo ra nhiều loại thuốc từ các hợp chất thứ cấp chiết xuất từ cây trồng. Với tiến bộ khoa học, các phân tử hoá học trong cây đã đƣợc tổng hợp nhân tạo để sản xuất dƣợc phẩm. Tuy nhiên việc tổng hợp nhân tạo còn gặp nhiều khó khăn do con đƣờng tổng hợp các chất này vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ. Từ những năm đầu thập niên 70 của thế kỷ XX đến nay, các nhà khoa học đã công bố hàng loạt các công trình nghiên cứu về nuôi cấy tế bào đơn của nhiều loài thực vật nhằm thu nhận sản phẩm thứ cấp. Nhƣ vậy việc áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học dựa trên các phƣơng pháp nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào in vitro không những góp phần vào việc sản xuất và thu nhận mà còn giúp ta đảm bảo đƣợc một cách chủ động số lƣợng các hợp chất có giá trị trị liệu. Ở Việt Nam, ngƣời ta đã thu thập đƣợc 3 loài Drosera trong đó Drosera burmanni Vahl gần đây đã đƣợc nghiên cứu về việc thu nhận hợp chất quinone từ nuôi cấy in vitro, khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất này cũng nhƣ nhân giống thành công bằng tạo chồi trực tiếp. 2 Do đó để hƣớng tới tự động hóa việc thu nhận và chủ động tăng sinh lƣợng chất quinone đã đƣợc nghiên cứu thành công, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE ” đã ra đời. 1.2. Mục tiêu  Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ cây Drosera burmanni Vahl.  Khảo sát khả năng tạo dịch huyền phù tế bào cây Drosera burmanni Vahl.  Khảo sát hàm lƣợng hợp chất quinone thu đƣợc từ nuôi cấy dịch huyền phù. 1.3. Yêu cầu  Tạo đƣợc mô sẹo và khởi đầu tạo dịch huyền phù cây D. burmanni Vahl.  Phân tích định tính và định lƣợng đƣợc hàm lƣợng anthraquinone trong từng thành phần khác nhau và trong dịch huyền phù cây D. burmanni bằng máy HPLC. 1.4. Ý nghĩa của đề tài:  Ý nghĩa khoa học: đây là một bƣớc tiến quan trọng và cần thiết trong qui trình ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào D. burmanni Vahl để thu nhận hợp chất quinone. Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp quy trình tạo mô sẹo, dịch huyền phù D. burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 2. 2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl 2.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan [14]: Giới: Plantae (Thực vật). Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan). Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan). Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng). Bộ: Nepenthales. Họ: Droseraceae. Giống: Drosera. Loài: Drosera burmanni Vahl. Tên tiếng Anh: burmese sundew. Tên thông thƣờng: cây bắt ruồi, cỏ trói gà, bèo đất, trƣờng lệ burman. 2.1.2. Phân bố Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở đông bắc nƣớc Úc, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật, Sri Lanka và Đông Nam Á nhƣ Malaysia, Myanmar, Thái Lan,Việt Nam . . .(Hình 2.1) [33], [34]. Ở Việt Nam, Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣớc Bửu tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu [1] và ở khu du lịch sinh thái Bắc Bình, Bình Thuận. 4 h Ghi chú Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl Khu vực không có sự hiện diện của Drosera burmanni Vahl Hình 2.1: Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới [30]. 2.1.3. Mô tả hình thái Drosera burmanni Vahl là loài cây cỏ, cao 5 - 30 cm, có nhiều màu sắc khác nhau: xanh lá, xanh đậm, xanh có ánh vàng với lông tuyến màu đỏ hay toàn cây màu đỏ [6], [15], [33], [35]. A B C D E F Hình 2.2: Hình thái của Drosera burmanni Vahl [33], [35].  Thân (Hình 2.2 A, B, C) Thân không phân nhánh, rất ngắn, có khi chỉ cao 1 cm khi tăng trƣởng trong bóng râm, không hình thành thân củ dƣới đất. Thân mang nhiều phát hoa [31]. 5  Lá (Hình 2.3) Lá hình muỗng, xếp thành hình hoa thị quanh thân, phiến lá dài khoảng 1,2 cm, rộng khoảng 0,4 cm, mặt lá phủ đầy lông tuyến. Lá có tua cuốn với những giọt keo ở đầu gọi là dịch nhầy, côn trùng dính vào và bị bẫy trong dịch này. Sau đó chất này sẽ tiêu hóa côn trùng mắc bẫy. Tua cuốn trên lá uốn cong về phía con mồi bằng tính hƣớng tiếp xúc của nó. Drosera burmanii Vahl là một trong những loài có chuyển động tua cuốn nhanh nhất [37]. A B D C Hình 2.3: Lá D. burmanni [42]. A: Lá; B: Các tua cuốn. C, D: Cấu trúc một tua cuốn. Tua cuốn là lông tiết đƣợc tạo bởi một cuống dài, nhỏ, có cấu trúc đa bào và đầu mút tua cuốn đƣợc tạo bởi 2 lớp tế bào tuyến. Chất keo dính đƣợc tiết ra từ các tuyến xuyên qua lớp biểu bì gián đoạn.  Rễ Hệ thống rễ tƣơng đối đơn giản: rễ chùm nhƣng chỉ có một vài nhánh. Chúng đƣợc gọi là rễ giả vì chỉ có cơ quan hút nƣớc, cung cấp nƣớc cho cây.  Hoa (Hình 2.2 D, E) Cây ra hoa tháng 3 - 4. Hoa đều, lƣỡng tính, nhỏ, có nhiều màu sắc từ tím nhạt tới vàng nhạt, màu đỏ, hồng và trắng. Hoa nằm trên một cuống chung dài, mọc 6 thẳng góc từ chồi nách hay chồi đỉnh gọi là phát hoa. Phát hoa cao 5 - 6 cm, mỗi phát hoa có từ 5 đến 25 hoa, họp thành chùm hình bò cạp. Hoa đối xứng tròn, lá đài 5, cánh hoa 5, tiểu nhụy 5, noãn sào một buồng, đính phôi trắc mô, bầu 5 lá noãn hàn liền nhau bởi mép bên [9], [14]. Hoa nở nhiều thời điểm khác nhau, tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển của cây. Hoa thƣờng nở vào buổi sáng. Mỗi ngày nở một bông bắt đầu từ nụ thấp nhất (nụ đƣợc hình thành sớm nhất). Hầu hết hoa tự thụ phấn nhờ côn trùng. Nếu sự thụ phấn không diễn ra, hạt phấn và nhụy sẽ tự thụ phấn khi hoa khép cánh.  Hạt (Hình 2.2 F) Hạt thu đƣợc sau một tuần từ khi hoa nở. Hạt nằm trong nang hạt. Nang hạt tròn, gồm 5 mảnh, chứa nhiều hạt. Nang hạt còn non có màu xanh, nang hạt chín có màu đen. Hạt màu đen, đƣờng kính 0,1 mm. 2.1.4. Đặc tính sinh học  Hình thức sinh sản Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi con từ chồi bên hay từ đỉnh sinh trƣởng. Sinh sản hữu tính bằng hạt.  Phƣơng thức bắt mồi Hình thức: Sử dụng dịch nhầy để bắt dính con mồi (flypaper traps). Cơ chế: Các lông tuyến bao phủ khắp bề mặt lá có vai trò nhƣ một cái bẫy nhỏ. Các keo dính tiết ra từ lông tuyến nhìn nhƣ những giọt sƣơng và không bị khô đi trong ánh mặt trời (vì vậy mà loài cây này còn đƣợc gọi là “sundew”). Giọt keo dính này tác động nhƣ những giấy bắt mồi (flypaper). Các giọt keo thƣờng không độc và có hƣơng thơm, nhờ vậy nó thu hút con mồi đậu xuống bề mặt lá và bắt dính chúng. Khi đó những lông tuyến nhạy cảm với protein sẽ uốn cong, từ từ cuộn con mồi lại và đẩy nó vào giữa lá. Tuyến tiết trên bề mặt lá lúc này sẽ ngừng tiết keo dính mà tiết nhiều enzyme thủy phân tiêu hóa con mồi. Lá sẽ hấp thu chất dinh dƣỡng mà cây không thể lấy từ môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng [25], [34], [35].