Tài liệu Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá propionibacterium acnes của cao chiết từ cây trứng cá (muntingia calabura l.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC-ĐIỀU DƯỠNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC MÃ SỐ: 52120401 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRỨNG CÁ Probionibacterium acnes CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY TRỨNG CÁ (Muntingia calabura L.) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. DƯƠNG THỊ BÍCH SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ PHƯỢNG HIỆP MSSV: 12D720401113 LỚP: ĐH DƯỢC 7B Cần Thơ, năm 2017 LỜI CẢM ƠN Qua quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, em đã học hỏi được rất nhiều kiến thức, kỹ năng và kinh nghiệm quý báu từ quý Thầy, Cô và Bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Cô Ths. Dương Thị Bích - người hướng dẫn đề tài đã tận tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Quý Thầy Cô Bộ môn Vi Sinh-Ký Sinh đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập và làm việc tại trường. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Ths. Đỗ Văn Mãi, Thầy Nguyễn Văn Hiền, Cô Quách Thị Thu Hằng, Cô Nghị Ngô Lan Vi đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và truyền đạt những kinh nghiệm quý giá để em thực hiện tốt bài khóa luận. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp gồm Thầy PGS. TS Trần Công Luận, Thầy PGS. TS Nguyễn Văn Bá, Thầy Ths. Đỗ Văn Mãi đã nhận xét và đưa ra ý kiến giúp em hoàn thiện bài khóa luận. Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cha mẹ và những người thân yêu đã động viên, tiếp sức em trong suốt quá trình học tập. Cảm ơn các bạn trong tập thể lớp ĐH Dược 7B và tất cả mọi người đã giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho mình trong suốt quá trình học tập. Cuối lời, xin kính chúc quý Thầy, Cô, Cha, Mẹ, Anh, Chị và các bạn luôn khoẻ mạnh và thành công trong cuộc sống. Chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 7 tháng 7 năm 2017 Lê Phượng Hiệp i LỜI CAM KẾT Em xin cam đoan đây là nghiên cứu của bản thân tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong bài khóa luận này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ khóa luận nào trước đây. Ngày 14 tháng 6 năm 2017 Sinh viên thực hiện Lê Phượng Hiệp ii TÓM TẮT NỘI DUNG Kháng sinh tổng hợp được sử dụng trong điều trị bệnh trứng cá hiện nay thường dẫn đến khả năng đề kháng thuốc. Trong những năm gần đây, cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hoá cao. Vì vậy với mục tiêu đề tài là đánh giá và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes từ các bộ phận cây Trứng cá rất cần thiết. Lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) được chiết xuất bằng hệ thống đun hồi lưu với dung môi ethanol 96 % thu được bốn loại cao chiết. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Trứng cá được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch trên dòng vi khuẩn P. acnes 134N lưu trũ tại phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Tây Đô. Kết quả thí nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cho thấy tất cả các loại cao chiết từ bộ phận cây Trứng cá đều có hoạt tính ức chế dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes 134N. Qua so sánh kích thước khoảng vô khuẩn, cao chiết từ lá Trứng cá có khả năng ức chế dòng vi khuẩn P. acnes 134N cao nhất trong bốn loại cao khảo sát, ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000 mm; 16,33 ± 2,082 mm. Giá trị MIC của cao chiết từ lá Trứng cá đối với dòng vi khuẩn P. acnes 134N là 10 mg/ml. Đồng thời tiến hành định tính các hợp chất sinh học trong cao chiết từ lá Trứng cá, kết quả thu được cao chiết ethanol từ lá Trứng cá có chứa hợp chất sinh học như flavonoid, saponin, tanin. Từ kết quả đề tài cho thấy, cao chiết ethanol từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non Trứng cá là một nguồn nguyên liệu tự nhiên, tiềm năng cho những nghiên cứu sâu hơn trong điều trị bệnh trứng cá, đặc biệt là nguyên nguyên liệu từ lá Trứng cá. Từ khóa: cây Trứng cá, Propionibacterium acnes, tính kháng khuẩn iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i LỜI CAM KẾT ............................................................................................................... ii TÓM TẮT NỘI DUNG ................................................................................................. iii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................... vii DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................... viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................ ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU...................................................................................................1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 2.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ ...................................................................3 2.1.1. Phân loại bệnh trứng cá .........................................................................................3 2.1.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá ......................................................................................4 2.1.3. Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay ............................................5 2.2. VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES .......................................................9 2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes.................................................9 2.2.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes ...........................10 2.3. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ ...................................................................12 2.3.1 Nguồn gốc cây Trứng cá ......................................................................................12 2.3.2. Phân loại cây trứng cá .........................................................................................13 2.3.3. Thành phần hoá học và các hợp chất tiêu biểu của cây Trứng cá .......................13 2.3.4. Tác dụng dược lý cây Trứng cá ...........................................................................15 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CAO CHIẾT TỪ CÂY TRỨNG CÁ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC..................................................................................18 2.4.1. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá trên thế giới........18 2.4.2. Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá ở Việt Nam ........19 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................20 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .................................................................................20 iv 3.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ...........................................................................20 3.2.1. Nguyên vật liệu ....................................................................................................20 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ............................................................................20 3.2.3. Hóa chất và môi trường .......................................................................................20 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................21 3.3.1. Thiết kế nghiên cứu .............................................................................................21 3.3.2. Cỡ mẫu.................................................................................................................21 3.3.3. Phương pháp chọn mẫu .......................................................................................21 3.3.4. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................22 3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................31 3.5. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ..........................................................................................31 3.6. VẤN ĐỀ Y ĐỨC ....................................................Error! Bookmark not defined. 3.7. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ ......................................................................31 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................32 4.1. KẾT QUẢ ...............................................................................................................32 4.1.1. Chiết cao ..............................................................................................................32 4.1.2. Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Propionibacterium acnes ................................32 4.1.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây Trứng cá. ........................................................................................................................36 4.1.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây Trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes...............................................................................................38 4.1.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết từ lá Trứng cá ................40 4.2. THẢO LUẬN .........................................................................................................41 4.2.1. Chiết cao ..............................................................................................................41 4.2.2. Phân lập và định danh vi khuẩn ...........................................................................41 4.2.3. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây trứng cá ..........................................................................................................................42 4.2.4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes...............................................................................................43 4.2.5. Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết ethanol lá Trứng cá ....44 v CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................46 5.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................46 5.2. ĐỀ NGHỊ ................................................................................................................46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................47 PHỤ LỤC ......................................................................................................................56 Phụ lục 1: Tổng hợp số liệu thí nghiệm.........................................................................56 Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê ...........................................................................57 vi DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1. Tác dụng các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá ..................................9 Bảng 2.2. Sản phẩm ngoại bào P. acnes........................................................................11 Bảng 2.3. Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất có chứa trong quả Trứng cá ..........14 Bảng 3.1: Công thức môi trường TYEG agar ...............................................................21 Bảng 3.2. Định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol cao chiết trứng cá ........30 Bảng 4.1. Kết quả độ ẩm cao cây Trứng cá...................................................................32 Bảng 4.2. Kết quả hiệu suất chiết cao từ cây Trứng cá .................................................32 Bảng 4.3. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của các loại cao ethanol cây trứng cá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. ...........................................................36 Bảng 4.4. Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trứng cá đối với vi khuẩn P. acnes. .............................................................................................39 Bảng 4.5. Kết quả định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol của lá Trứng cá .......................................................................................................................................40 vii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn ........................................................................................5 Hình 2.2. Vi khuẩn P. acnes ..........................................................................................10 Hình 2.3. Cây trứng cá...................................................................................................12 Hình 2.4. Quả non và quả chín cây Trứng cá ................................................................13 Hình 3.1. Sơ đồ bố trí chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá ......................................23 Hình 3.2. Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Proionibacterium acnes từ mẫu lưu trữ .......................................................................................................................................26 Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết .................29 Hình 3.4. Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm ..................................................................31 Hình 4.1. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple..........................................................................................33 Hình 4.2. Hình thái tế bào vi khuẩn P. acnes dưới kính hiển vi ...................................33 Hình 4.3. Thử nghiệm catalase trên dòng vi khuẩn 134N .............................................34 Hình 4.4. Kiểm tra khả năng sinh indol trên dòng vi khuẩn 134N ...............................34 Hình 4.5. Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa trên dòng vi khuẩn 134N .......................35 Hình 4.6. Kiểm tra khả năng làm dịch hóa gelatin trên dòng vi khuẩn 134N ...............35 Hình 4.7. Khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes của cao chiết ethanol các bộ phân cây Trứng cá ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; và 50 mg/ml. ..........................................37 Hình 4.8. Vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml ...............................................................38 Hình 4.9. Giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P. acnes ..................39 viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BHI Brain Heart Infusion Broth DMSO Dimethyl Sulfoxide DNA Deoxyribo Nucleic Acid DPPH 2,2-diphenylpicrylhydrazyl ED50 Effective dose 50 IC50 Inhibitory concentration M. calabura Muntingia calabura L. MIC Minimum inhibitory concentration MBC Minimum bactericidal concentration P. acnes Proipionibacterium acnes TYEG Tryticase-Yeast extract-Heart extract-Glycerol v/v Volume per volume w/v Weight per volume ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Bệnh trứng cá là bệnh lý về da thường gặp ở lứa tuổi thanh thiếu niên, đặc biệt là giai đoạn dậy thì, có khoảng 80 % thanh niên Việt Nam bị bệnh trứng cá với mức độ nặng nhẹ khác nhau (Phạm Văn Hiển, 1997). Bệnh trứng cá thường xuất hiện vùng da mặt, lưng và ngực. Tuy ít ảnh hưởng sức khoẻ nhưng ảnh hưởng khá lớn đến tâm lý, thẩm mỹ và giao tiếp xã hội của bệnh nhân. Nghiên cứu ở thanh thiếu niên bị bệnh trứng cá cho thấy mức độ lo lắng, ngại giao tiếp cao hơn so với người bệnh động kinh hay hen suyễn (Mallon et al., 1999). Có nhiều nguyên nhân gây bệnh trứng cá như mất cân bằng nội tiết tố, nhiễm khuẩn, do căng thẳng, chế độ dinh dưỡng hay mỹ phẩm (Park et al., 2004). Vi khuẩn P. acnes được xem là một trong các nguyên nhân chính gây bệnh trứng cá (Jappe, 2002). Tại bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh khảo sát 87 trường hợp bệnh nhân trứng cá có 42 trường hợp (chiếm 48,3 %) phân lập được vi khuẩn P. acnes (Nguyễn Thanh Hùng, 2013) Kháng sinh, retinoid và một số chất khác như benzoyl peroxid, acid salicylic, acid azelaic và anpha-hydroxy cho tác dụng điều trị bệnh trứng cá thông thường (Leyden, 2003). Tuy nhiên các thuốc này kèm theo các tác dụng phụ như kích ứng da, lột da, sạm da (Kennedy et al., 1995) và thời gian điều trị kéo dài dẫn đến hiện tượng kháng thuốc kháng sinh và thuốc trị mụn (Leyden, 2003). Vì vậy việc tiếp cận các liệu pháp điều trị có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là những dược liệu sử dụng phổ biến trong dân gian điều trị bệnh trứng cá đang được nhiều nước trên Thế giới và Việt Nam quan tâm. Mục đích nhằm tìm những thuốc mới có hiệu quả, không gây tác dụng phụ so với các thuốc có nguồn gốc hóa dược và góp phần tận dụng nguồn dược liệu có sẵn là rất cần thiết. Cây Trứng cá hay còn gọi là Mật sâm trong những năm gần đây được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa cao. Lá, vỏ thân, quả và rễ sử dụng như một phương thuốc dân gian điều trị sốt, cảm lạnh, bệnh tiêu hoá, thuốc kháng khuẩn ở khu vực Đông Nam Á. Các nghiên cứu đã chứng minh những hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu có khả năng kháng vi sinh vật, kháng oxy hoá bao gồm tanin, flavonoid, phenolic (Chenwitheesuk et al., 2005). Theo các nghiên cứu một số hợp chất phân lập từ cây Trứng cá như flavonoid, tanin, phenolic (Keneda (1991), Su (2003), Chen (2005)) có khả năng chống các tế bào ung thư và kháng khuẩn. Mặt khác cây Trứng cá là loại cây ven đường được trồng khá phổ biến tại các nước Nam Mỹ và khu vực Đông Nam Á (Chin, 1989), dễ thu hái và rẻ tiền là nguồn nguyên liệu sẵn có dễ tìm. 1 Với những lí do trên đề tài “Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)” đã được thực hiện với mục đích cụ thể sau: 1) Xác định và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) 2) Định tính một số hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết từ Cây Trứng cá cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất. 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ Bệnh trứng cá được mô tả sớm nhất trong các bài viết Hy Lạp cổ đại của bác sĩ Byzantine Aetius Amidenus. Từ “acne” xuất phát từ acme trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là “điểm” hoặc “tại chỗ”, acme viết sai thành acne và được sử dụng đến ngày nay (Humgara et al., 2013). Bệnh trứng cá là bệnh về da phổ biến nhất đặc biệt ở lứa tuổi thanh thiếu niên. Bệnh trứng cá không thể định nghĩa là bệnh truyền nhiễm vì vi khuẩn gây mụn không chỉ hiện diện trên da người bệnh mà còn trên da người khoẻ mạnh. Bệnh trứng cá được hình thành do sự tăng tiết chất nhờn, tế bào phễu bị sừng hoá làm tắc nghẽn cổ nang lông, sự gia tăng mật độ vi khuẩn bên trong nang lông và sử dụng tế bào chết cùng với chất nhờn phát triển tạo thành nhân mụn nhỏ (microcomedone) không thể phát hiện bằng mắt thường (Plewig và Kligman, 2000) 2.1.1. Phân loại bệnh trứng cá Theo Phạm Hoàng Khâm (2011) bệnh trứng cá được chia thành 2 dạng là tổn thương không viêm như mụn đầu trắng (whitehead) và mụn đầu đen (blackhead) và dạng viêm bao gồm sẩn, mụn mủ, mụn bọc, mụn nang. - Mụn đầu đen hình thành do chất bã bài tiết và tế bào chết làm tắc lỗ nang lông nhưng bề mặt da hở nên nhân mụn bị không khí oxy hoá tạo màu đen. Nhìn vào nang lông thấy màu đen nên gọi là mụn đầu đen hay mụn có cấu trúc mở. - Mụn đầu trắng hình thành khi có quá nhiều chất dầu và tế bào chết gây bít tắc lỗ nang lông và không hở ra da, nên gọi là “nhân đóng”. Theo Hayashi et al., 2008 sử dụng hình thái và số lượng tổn thương phân chia bệnh thành 3 mức độ: nhẹ, trung bình và nặng - Bệnh trứng cá nhẹ: từ 0 - 5 nốt viêm, thương tổn là một vài mụn đầu trắng, mụn đầu đen. - Bệnh trứng cá trung bình: từ 6 - 20 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn đầu trắng, mụn đầu đen đồng thời có thêm sẩn, mụn mủ. - Bệnh trứng cá nặng: từ 21 - 50 nốt viêm, thương tổn gồm nhiều mụn mủ, nang, nốt sẹo. Theo Tutakne (2003) phân loại bệnh theo bốn cấp độ: - Cấp 1: mụn trứng cá (comedones, mụn đầu trắng, mụn đầu đen), sẩn (Papules) - Cấp 2: mụn trứng cá, vài mụn mủ (pustule) - Cấp 3: mụn mủ, nốt sần (nodules), áp xe (abscess) - Cấp 4: các u nang (cyst), áp xe, sẹo (scar) 3 2.1.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá Những yếu tố chính gây bệnh trứng cá là nội tiết tố kích thích tiết bã nhờn, sự sừng hoá (Keratin hoá) bất thường của phễu nang lông, tăng số lượng vi sinh vật trên da và phản ứng viêm của tế bào chủ. Trong đó sự tăng tiết bã nhờn được coi là điều kiện cần, phản ứng viêm được xem là yếu tố then chốt, còn vi khuẩn P. acnes đóng vai trò quan trọng gây ra bệnh trứng cá (Loveckova el al., 2002). Ngoài ra còn các yếu tố khác như yếu tố di truyền, chế độ dinh dưỡng, môi trường làm việc, khí hậu, lạm dụng mỹ phẩm cũng có liên qua đến tình trạng bệnh trứng cá (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013) 2.1.2.1. Sự tăng sinh tiết bã nhờn Bã nhờn được sản xuất bởi tuyến nhờn, chúng có ở mọi nơi trên cơ thể đặc biệt ở trán, cằm và lưng, có rất ít ở tay hoặc chân, không có ở lòng bàn tay và lòng bàn chân. Có hai quá trình liên quan đến sự tổng hợp chất béo của bã nhờn: quá trình tổng hợp triglycerid, acid béo tự do, wax ester, sterol ester và quá trình tổng hợp squalen và cholesterol (Downie et al., 2004). Hầu hết các tuyến bã nhờn đổ vào nang lông trên bề mặt da để giữ ẩm cho làn da. Những người bị bệnh trứng cá thường có tuyến bã nhờn tiết nhiều chất nhờn trên mức cần thiết. Chất nhờn sẽ tích tụ trong lỗ chân lông dẫn đến tắc lỗ chân lông hình thành nhân trứng cá. Thành phần chất nhờn trên da bệnh nhân bệnh trứng cá thường có squalen và wax ester cao hơn bình thường và các acid béo tự do (như linoleic) thấp hơn bình thường. Sự thiếu hụt acid linileic là yếu tố quan trọng gây mụn trứng cá (Downie et al., 2004). Acid linoleic điều khiển quá trình tiết của interleukin (IL-8), gây ra phản ứng viêm (Zouboulis, 2001) 2.1.2.2. Rối loạn bong sừng (sự sừng hoá bất thường ở lỗ chân lông) Rối loạn bong sừng là hiện tượng lớp tế bào chết ngoài cùng khu vực gần miệng lỗ chân lông kết chặt với nhau và không bong ra, dần dần tạo thành nhiều lớp tế bào chết xếp chồng lên nhau. Lớp tế bào chết này sẽ gây hẹp lỗ chân lông dẫn đến bít tắc lỗ chân lông tạo nên môi trường kỵ khí với nhiều chất nhờn thuận lợi cho vi khuẩn phát triển gây ra mụn (Thiboutot et al., 2009) 2.1.2.3. Vi khuẩn gây bệnh trứng cá: Các chủng vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum, Propionibacterium acnes đã được chứng minh hệ vi sinh vật tham gia vào sự phát triển của bệnh trứng cá, trong đó P. acnes được xem là tác nhân gây bệnh trứng cá chính (Hamnerius, 1996). Propionibacterium acnes thuộc chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, khuẩn lạc màu vàng nhạt hoặc vàng đậm (do khả năng sinh acid propionic) trên môi trường TYEG agar (có bổ sung bromocresol purple), tế bào hình que, dương tính với catalase. Trong 4 dòng vi khuẩn thuộc giống Propionibacterium thì P. granulosum và P. avidum không có khả năng sinh tryptophan, trong khi P. acnes cho kết quả dương tính. Đây là một trong những đặc điểm quan trọng giúp phân lập được các dòng P. acnes (Kishishita et al., 1980). 2.1.2.4. Phản ứng viêm Tại các tuyến bã nhờn P. acnes tiết ra lipase phân giải triglyceride thành các acid béo tự do và glycerol. Các acid béo tự do khuyếch tán qua thành nang lông, thu hút bạch cầu trung tính đa nhân, chúng có khả năng phá vỡ các nang lông bởi các enzym thuỷ phân lysosom, gây ra phản ứng viêm ở lớp hạ bì (Weeks et al., 1977; Pawin et al., 1998) Hình 2.1. Nang tuyến bã nhờn (Degitiz et al., 2007) A. Nang tuyến bã nhờn bình thường B. Nhân mụn C. Nang bị vỡ do viêm 2.1.3. Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay Bệnh trứng cá liên quan đến nhiều yếu tố gây bệnh nên điều trị phức tạp việc điều trị phải dựa trên từng cá thể bệnh mức độ trầm trọng của bệnh, nguyên nhân gây bệnh mà sử dụng thuốc tại chổ hay toàn thân hoặc kết hợp cả hai để đạt hiệu quả cao. Hiện nay có rất nhiều phương pháp điều trị bệnh trứng cá mang lại kết quả đáng kể nhưng thời gian điều trị kéo dài và kèm theo tác dụng phụ không mong muốn. 2.1.3.1. Sử dụng kháng sinh Theo một số phác đồ điều trị kháng sinh thường sử dụng là clindamycin, erythromycin, tetracylin. - Dung dịch clindamycin 1 % có hiệu quả trong việc làm giảm vi khuẩn P.acnes (thường gặp ở vùng da nhờn), có tác dụng tốt đối với mụn mủ, sẩn mủ, nhưng với nang mụn và nhân mụn thì thuốc ít có hiệu quả. - Dung dịch erythromycin 4 % có tác dụng giống clindamycin. Sau khi dùng khoảng 12 tuần, khoảng 2/3 bệnh nhân có kết quả tốt. 5 - Khi điều trị kháng sinh tại chỗ thất bại (6 - 8 tuần), nên phối hợp kháng sinh toàn thân cùng với kháng sinh tại chỗ như: tetracyclin: 500mg x 2 lần/ngày; erythromycin 500 mg x 2 lần/ngày; roxithromycin 150 mg x 2 lần/ngày; levofloxacin 500 mg x 2 lần/ngày. Các loại kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn P. acnes làm giảm viêm nhưng tác dụng trong điều trị bị giảm do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn (Shimonart và Dramaix, 2005). Kháng sinh trong điều trị vi khuẩn mụn trứng cá P. acnes đã có nhiều tác giả nghiên cứu. Năm 1976, Leyden chưa phát hiện sự kháng kháng sinh của vi khuẩn P. acnes (Leyden, 1976). Năm 1979, Crawford cùng cộng sự đã công bố kháng sinh kháng vi khuẩn P. acnes là erythromycin và clindamycin với tỷ lệ mức 20 % .Tỷ lệ kháng kháng sinh 20 % năm 1978 và lên 68 % năm 1996. Theo một số điều tra gần đây, các nước Địa Trung Hải có tỷ lệ đề kháng của P. acnes cao nhất với erythromycin và clindamycin. Ở Tây Ban Nha tỷ lệ kháng với hai loại kháng sinh này lần lượt là 91 % và 92,4 %. Ở Hy Lạp, tỷ lệ P. acnes đề kháng cả hai loại erythromycin và clindamycin là 75,3 % và ở Italia là 59,5 % (Ross et al., 2002). Theo Dreno et al., 2001 công bố tỷ lệ dòng vi khuẩn P. acnes phân lập từ bệnh nhân chủ yếu là bị tổn thương kèm theo viêm, kháng lại erthromycin 52 %. Những loại kháng sinh điều trị bệnh trứng như ampicilin, erythromycin, roxithromycin, clindamycin được khuyến cáo không sử dụng điều trị dài hạn (quá 3 tháng) (Nishijima, 2000). Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn không chỉ lây lan giữa các dòng vi khuẩn trên da người bệnh mà còn lây truyền qua người thân và những người mà họ tiếp xúc (Sheafer et al., 2001). Khả năng đề kháng thuốc kháng sinh của P.acnes có liên quan đến đột biến gen trên 16S và 23S-rRNA, được phân lập ở các nước Nhật Bản, Úc, Hoa Kỳ và Châu Âu (Ross et al., 2002). Đột biến gen 23-rRNA kháng lại kháng sinh thuộc nhóm macrolid- lincosamidestreptogramin B, đặc biệt là erythromycin và clindamycin (Ross et al,. 2002). Tại Việt Nam, khảo sát 87 bệnh nhân tham gia nghiên cứu tạo phòng khám bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ đề kháng kháng sinh như sau lindamycin 88,1 %; azthromycin 16,7 %; tetracyclin 0 %, doxycylin 0 %; minocyclin 0 %; trimethroprim/sulfamethoxazol 95,2 % (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013). Bên cạnh khả năng kháng kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá, các loại kháng sinh thường gây một số tác dụng không mong muốn như kích ứng da, mẫn ngứa, khô da, da mẫn cảm với ánh sáng (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). Vì vậy việc lựa chọn thuốc phải phù hợp với từng bệnh nhân, từng thể bệnh và tuân thủ theo điều trị của thầy thuốc mới đạt kết quả mong muốn. 6 2.1.3.2. Các Peroxid Là loại thuốc sát khuẩn có tác dụng chống vi khuẩn gây mụn, kháng viêm, benzoyl peroxid làm giảm nhanh số lượng P. acnes tại vùng thương tổn đồng thời thuốc làm giảm lượng acid béo trên bề mặt da và ức chế tạo nhân trứng cá. Benzoyl peroxid có tác dụng tốt đối với trứng cá có viêm ở mức độ nhẹ hay trung bình. Nên dùng thuốc có nồng độ từ 2,5 - 5 % bôi vùng mặt, vùng lưng có thể dùng thuốc với nồng độ cao hơn từ 5 - 10 %, khởi đầu có thể bôi ngày 2 lần, khi bệnh giảm tuần bôi 1 - 2 lần. Nên sử dụng công thức có chất nền là nước (water-basedformulation) vì ít kích ứng da hơn loại cồn. Thuốc này thường gây kích thích da và lột da. Cần tránh nắng trong thời gian sử dụng thuốc vì ánh nắng làm cho da cháy đỏ, đen sạm (Simonart và Dramaix, 2005). Nếu dùng đồng thời với kem chống nắng có chứa acid paraaminobenzoic sẽ làm da sậm màu một thời gian (Lê Kim Duệ, 2000). 2.1.3.3. Dẫn chất vitamin A acid (tretionid, isoteinoin) Trước đây vitamin A được xem là yếu tố dinh dưỡng thuần tuý. Ngày nay được dùng như một liệu pháp điều trị các trường hợp bệnh trứng cá nặng hoặc trứng cá đề kháng trị liệu thông thường. Thuốc bôi retinoid: tretionin, adapalene và isotretinoin là loại thuốc có hiệu quả. Thuốc có tác dụng mềm da, ức chế sự phát triển vi khuẩn P. acnes và tạo điều kiện cho các thuốc kháng khuẩn tại chỗ phát huy tác dụng tốt hơn. Một số tác dụng không mong muốn của thuốc: - Khả năng gây quái thai là tác dụng không mong muốn cần lưu ý nhất. Thuốc có thể gây dị dạng trên hệ thống thần kinh trung ương, cơ quan thính giác, tuyến ức và hệ thống tim mạch thai nhi (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). Các thuốc retinoid chống chỉ định cho phụ nữ mang thai và phụ nữ trong độ tuổi sinh sản (Yentzer et al., 2009). - Khô da và niêm mạc, làm da và niêm mạc dễ bị tổn thương và kích ứng, bệnh nhân cảm giác bỏng rát da trở nên đỏ, bong vẩy - Mụn mủ có thể xuất hiện sau khi bôi thuốc 1 đến 2 tuần do thuốc làm tăng sự thẩm thấu các chất trung gian hoá học gây viêm do P. acnes tiết ra và tạo điều kiện cho tụ cầu phát triển (Nguyễn Hữu Sáu, 2010). 2.1.3.4. Các phương pháp khác - Acid azelic có tác dụng giống benzyol peroxid gây ức chế sự tổng hợp tế bào sừng, có hoạt tính chống lại bệnh trứng cá. Tác dụng không mong muốn là gia tăng sắc tố da sau viêm (Roebuck, 2006), dễ gây kích ứng da ngứa và có cảm giác bỏng tại chỗ (Layton, 2006). 7 - Điều trị bằng công nghệ ánh sáng tia laser: sử dụng liệu pháp quang, ánh sáng phổ rộng. Tia laser cho thấy kết quả giảm mụn trong thời gian ngắn nhưng cần có thêm nhiều nghiên cứu lâu dài và so sánh liệu pháp cũ (Sakamoto et al., 2010) - Bên cạnh đó thảo dược được dùng điều trị mụn trứng cá không chỉ có khả năng như một chất tiêu diệt vi sinh vật mà còn là những chất có khả năng ức chế sản sinh sản phẩm ngoại bào của P. acnes. Thảo dược dùng điều trị mụn trứng cá cho thấy tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hoá và ức chế hormon androgen (Sasiing et al., 2012). Một số nghiên cứu về hoạt chất từ thảo dược có tác dụng ức chế vi khuẩn P. acnes: + Nghiên cứu kem trị bệnh trứng cá có chứa 2 % flavonoid chiết từ vỏ cây Terminalia arjuna (họ Trâm Bầu) thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn P. acnes (đường đính vòng kháng > 17 mm) (Vijaylakshmi et al., 2011) + Theo Luangnarcumitchai (2007) khảo sát 19 loại tinh dầu cho kết quả có khả năng ức chế vi khuẩn P. acnes, trong đó tinh dầu xả có hoạt chất kháng khuẩn cao nhất, nồng độ ức chế tối thiểu 0,125 % v/v + Dịch chiết ethanol của lá sầu đâu Neem, trái nutmeg (họ Nhục Đậu Khấu), và hạt tiêu đen (Black pepper) bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch, mỗi giếng cho 0,5 ml dịch chiết. Đường kính vòng kháng vi khuẩn P. acnes lần lượt là 20 mm, 18 mm, 16 mm ở nồng độ 20 mg/ml (Charde et al., 2012) + Bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, dịch chiết ethanol của lá cây Liễu đỏ Excoecaria cochinchinensis Lour và lá cây Xô thơm Salvia officinalis Lour (Họ hoa môi) nồng độ 5 % ức chế P. acnes với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là 20,5 mm và 20,83 mm MIC lần lượt là 1,56 mg/ml và 6,25 mg/ml (Brovelli et al., 2005) 8 Tác dụng của các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá được trình bày ở bảng 2.1 như sau: Bảng 2.1. Tác dụng các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá Phản ứng viêm Bài tiết Sừng hoá phễu Vi khuẩn chấtnhờn nang lông P. acnes Benzoyl peroxid - + +++ + Retinoid - ++ + + Clindamycin - + ++ - Antiandrogen ++ + - - Azelic acid - ++ ++ + Tetracycline - - ++ + Erythromycin - - ++ - +++ ++ ++ ++ Isotretinoin Ghi chú: (+++) tác dụng rất mạnh, (++) tác dụng mạnh, (++) tác dụng vừa, (+) tác dụng yếu, (-) không tác dụng (Hywel et al., 2011) 2.2. VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES 2.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes Theo Douglas và Gunter (1946) vi khuẩn Propionibacterium acnes gây bệnh trứng cá phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Họ: Propionibacteriaceae Chi: Propionibacterium Loài: P. acnes P. acnes là một trong những vi khuẩn thuộc hệ vi sinh vật tự nhiên của da, chiếm khoảng 105 - 106 tế bào/cm2 ở những vùng có nhiều bã nhờn như: mặt, đầu, lưng và khoảng 102 tế bào/cm2 ở các vùng khác trên cơ thể (Leyden et al., 1998). Chúng sinh trưởng sâu bên dưới da, nhiều nhất trong các nang lông, nơi có nồng độ oxy thấp. Vi khuẩn P. acnes phát triển chậm, khuẩn lạc xuất hiện sau 5 - 7 ngày trên môi trường nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp 37 oC, pH từ 5 - 8, trong điều kiện kỵ khí. Khuẩn lạc P. acnes mô cao màu vàng đục trên môi trường TYEG agar có bổ sung bromocresol purple. Khuẩn lạc có kích thước khoảng 0,5 - 4 mm tuỳ thuộc vào thời gian và môi trường nuôi cấy (Kishishita, 1980) 9 P. acnes thuộc vi khuẩn Gram dương, hình que, không sinh bào tử, các tế bào có đường kính 0,5 - 0,8 m và dài 3 - 4 m, có khả năng sản xuất acid propionic, nitrat, catalase và indol dương tính, dịch hoá gelatin. P. acnes được trữ trong môi trường BHI có bổ sung 20 % glycerol, ở nhiệt độ -40 oC (Jappe et al., 2002) Hình 2.2. Vi khuẩn P. acnes ( Jappe et al., 2002) (a) Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử; (b) Hình chụp dưới kính hiển vi quang học P. acnes có nhiều dạng khác nhau. Dựa vào quá trình lên men, sử dụng đường ribose, erythritol và sorbitol, quan sát được 5 type P. acnes khác nhau. Dựa trên xét nghiệm huyết thanh và phân tích thành phần đường trên thành tế bào, chia P. acnes thành hai dạng: type I (đường glactose tham gia cấu tạo thành tế bào) và type II (chỉ có đường manose trong cấu tạo thành tế bào) (Johnson và Cummins, 1972). Theo McDowel (2005) P. acnes được chia thành hai type I và II dựa vào khác biệt về kiểu gen dựa trên biến thể về kiểu gen (reca, hly). Gần đây, một dạng mới được mô tả là type III trên da người dị ứng. 2.2.2. Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes P. acnes là một trong những thành phần của hệ vi sinh vật bình thường trên da (Holdeman et al., 1977). Ở những người bệnh trứng cá, vi khuẩn này phát triển rất mạnh do sự bít tắc lỗ chân lông tạo môi trường yếm khí, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật này tăng nhanh mật số. Vi khuẩn P. acnes sản xuất các enzym ngoại bào và các sản phẩm có hoạt tính sinh học khác được xem là yếu tố quyết định độc lực và tương tác với hệ miễn dịch gây ra phản ứng viêm tạo nhân mụn (Webster, 1995). Theo Funke (1997) và Leyden (1998) P. acnes là nhân tố quan trọng gây bệnh trứng cá đây là chủng vi khuẩn phổ biến nhất trên da bệnh nhân trứng cá. Tại các tuyến bã nhờn P. acnes tiết ra lipase để tiêu hoá chất nhờn trong các nang lông sản sinh ra các acid béo tự do và acid propionic. Vi khuẩn P. acnes tồn tại trên mô và có 10