Tài liệu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết củ cải trắng (raphanus sativus l)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN B A R IA V U N G T A U UNIVERSITY CAP Sa in t ia c q u e s ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT CỦ CẢI TRẮNG (Raphanus sativus L.) Giáo viên hướng dẫn : Th.s Phạm Thị Kim Ngọc Sinh viên thực hiện : Bùi Thị Hồng Loan Lớp : DH13TP Ngành : Công Nghệ Thực Phẩm Vũng Tàu, 06/2017 Độc lập - Tự do - Hạnh phúc VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và Tên: Bùi Thị Hồng Loan MSSV: 13030375 Ngành: Công nghệ Thực phẩm Lớp: DH13TP Trình Độ Đào Tạo : Đại Học Hệ Đào Tạo: Đại học chính quy 1. Tên đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng (Raphanus sativus L.) 2. Ngày giao nhiệm vụ: 06/02/2016 3. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 10/06/2017 4. Họ và tên người hướng dẫn: Th.S Phạm Thị Kim Ngọc Bà Rịa-Vũng Tàu, ngày 26 tháng 6 năm 2017 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN (Ký và ghi rõ họ tên) TRƯỞNG BỘ MÔN (Ký và ghi rõ họ tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký và ghi rõ họ tên) TRƯỞNG KHOA (Ký và ghi rõ họ tên) Tôi cam đoan rằng tất cả những kết quả nghiên cứu được nêu trong đồ án này là do tôi thực hiện, các ý tưởng tham khảo và những kết quả trích dẫn từ các công trình khác đều được nêu rõ trong đồ án. Vũng Tàu, năm 2017 Sinh viên thực hiện Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học cho đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu, gia đình và bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu, quý thầy cô trong ngành Công nghệ Thực phẩm - những người đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là những hành trang vô cùng quý giá để em có thể bước vào sự nghiệp trong tương lai. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Phạm Thị Kim Ngọc. Cảm ơn cô đã tận tình quan tâm, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án, đã giải đáp những thắc mắc trong quá trình nghiên cứu. Trong quá trình thực hiện đồ án này vì kiến thức thực tế em còn hạn chế và thời gian thực hiện không nhiều nên sẽ không tránh khỏi sai sót. Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến và nhận xét của quý thầy cô, các bạn để em có thể rút kinh nghiệm và hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! LỜI CAM ĐOAN............................................................................................................. LỜI CẢM ƠN................................................................................................................... MỤC LỤC..................................................................................................................... I DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG....................................................................................................iv DANH MỤC H ÌN H.....................................................................................................v BẢNG PHỤ LỤC......................................................................................................... vi ĐẶT VẤN Đ Ề...............................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 2 1.1. Tổng quan về củ cải trắng ..................................................................................... 2 1.1.1. Đặc điểm của cây và củ cải trắng....................................................................2 1.1.2. Thành phần hóa học của củ cải trắng.............................................................3 1.1.2.1. Thành phần hóa học cơ bản.....................................................................3 1.1.2.2. Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng...................................................5 1.2.2.3. Tác dụng sinh học của củ cải trắng..........................................................6 1.2. Giới thiệu chung về khuẩn...................................................................................... 8 1.2.1. Bacillus cereus.................................................................................................8 1.2.2. Pseudomonas aeruginosa...............................................................................10 1.2.3. Salmonella typhi............................................................................................11 1.2.4. Staphylococcus aureus..................................................................................13 1.3. Giới thiệu chung về nấm mốc.............................................................................. 14 1.3.1. Nấm mốc Aspergillus flavus..........................................................................14 1.3.1.1. Phân loại [47].........................................................................................14 1.3. L2. Đặc điểm của nấm Aspergillus flavus [43].....................................15 1.3.1.3. Hình thức sinh sản [43].........................................................................16 1.3.1.4. Một số bệnh lý do nấm mốc Aspergillus flavus gây ra [43]....................16 1.3.2. Nấm mốc Fusarium solani [8 ]......................................................................17 1.3.2.1. Phân loại.................................................................................................17 1.3.2.2. Đặc điểm của nấm Fusarium solani [41]...............................................17 1.3.2.3. Hình thức sinh sản..................................................................................18 Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT 1.3.2.4. Một số bệnh lý do nấm mốc F. solani..................................................19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................20 2.1 Phương tiện nghiên cứu........................................................................................20 2.1.1. Thời gian và địa điểm...................................................................................20 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................20 2.1.3. Phạm vi nghiên cứu......................................................................................20 2.1.4. Hóa chất sử dụng..........................................................................................20 2.1.5. Thiết bị - Dụng cụ.........................................................................................20 2.2.Nội dung và phương pháp nghiên cứ u................................................................. 21 2.2.1. Nội dung nghiên cứ u.....................................................................................21 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................21 2.2.2.1. Phương pháp định tính các thành phần trong cao chiết..........................21 2.2.2.2. Chuẩn bị giống.......................................................................................23 2.2.2.3. Chuẩn bị pha cao củ cải ở các nồng độ khác nhau.................................24 2.2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng..................................................24 2.2.2.5. Xử lý số liệ u...........................................................................................26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 27 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao củ cải trắng.................................27 3.2. Kết quả kháng khuẩn và nấm mốc của cao củ cải trắng....................................... 30 3.3.1. Kết quả kháng khuẩn....................................................................................30 3.3.2. Kết quả kháng nấm m ốc...............................................................................33 3.4. Bàn luận.............................................................................................................. 35 KẾT LUẬN ................................................................................................................. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 40 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 45 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide - Hợp chất hữu cơ lưu huỳnh với công thức (CH3)2SO Rs-AFP1, Rs-AFP2 (Raphanus sativus antifungal peptide 1): peptide giàu cysteine có khả năng ức chế sự phát triển của nấm. MR: Methyl Red - Thử nghiệm Methyl Red VP: Voges Proskauer - Thử nghiệm Voges Proskauer MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton MIC: Minimal Inhibitory Concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB SDA: Sabouraud Dextrose Agar Môi trường dinh dương SDA PDA: Potato Dextrose Agar Môi trường dinh dưỡng PDA DNA: Acid deoxyribonucleic - Phân tử mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức năng và sinh sản của các sinh vật và nhiều loài virus RNA: Acid ribonucleic rpm: tốc độ vòng/ phút Am: thuốc kháng sinh Amipicillin Ge: thuốc kháng sinh Gentamycin Te: thuốc kháng sinh Tetracycline Ter: thuốc kháng sinh Terbinafine Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong 100g củ cải trắng tư ơ i........................................4 Bảng 3.1. Kết quả định tính các hợp chất có trong mẫu cao củ cải trắng...................27 Bảng 3.2. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao củ cải trắng (mm)........................30 Bảng 3.3. Đường kính vòng kháng nấm của cao củ cải trắng (mm)...........................34 Hình 1.1. Cây và củ cải trắng.......................................................................................2 Hình 1.2. Hoa, lá và quả của cây cải c ủ........................................................................3 Hình 1.3. Vi khuẩn B. cereus sau khi nhuộm Gram và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB................................................................................................................................ 9 Hình 1.4. Vi khuẩn P. aeruginosa khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB.................................................................................................11 Hình 1.5. Vi khuẩn S. typhi khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch T SB........................................................................................................12 Hình 1.6. Vi khuẩn S. aureus khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch T SB........................................................................................................14 Hình 1.7. Aspergillus fla vu s.......................................................................................15 Hình 1.8. Fusarium solani...........................................................................................17 Hình 1.9. Loài F. solani: A-B: đại bào tử; C-D: tiểu bào tử; E-G: bào tử đính trên môi trường (Dương Minh,2010).........................................................................................18 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu........................................................................................21 Hình 2.2. Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009).............................25 Hình 3.1. Khả năng kháng B. cereus của cao củ cải trắng..........................................32 Hình 3.2. Khả năng kháng P. aeruginosa của cao củ cải trắng...................................33 Hình 3.3. Khả năng kháng S. aureus của cao củ cải trắng..........................................33 Hình 3.4. Khả năng kháng S. typhi của cao củ cải trắng.............................................33 Hình 3.5. Khả năng kháng A. flavus của cao củ cải trắng...........................................34 Hình 3.6. Khả năng kháng F. solani của cao củ cải trắng............................................34 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng từ 4 chủng vi khuẩn và nấm mốc khác nhau.....................................................................................35 BẢNG PHỤ LỤC Phụ lục A. Môi trường và kháng sinh.....................................................................45 Phụ lục B. Kết quả nhuộm Gram của 4 chủng vi khuẩn khảosát 46 Phụ lục C. Đếm bào tử nấm mốc trên kính hiển v i.................................................46 Phụ lục D. Cao thành phẩm 47 Phụ lục E. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồngđộ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Bacillus cereus.......................................47 Phụ lục F. Phụ lục F. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Pseudomonas aeruginosa........49 Phụ lục G. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Staphylcoccus aureus .................................................................................................................................... 51 Phụ lục H. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Salmonella Typhi ĐẶT VẤN ĐỀ Củ cải trắng có tên khoa học là Raphanus sativus L., thuộc họ cải Brassicaceae, là cây trồng hàng năm, dùng như một loại rau ăn củ ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Theo các tài liệu y học cổ truyền, củ cải trắng có vị ngọt hơi cay, đắng, tính bình, không độc, có tác dụng long đờm, trừ viêm... được dùng trong chữa trị khá nhiều bệnh đường hô hấp, ung thư, bệnh đường tiêu hóa. Ở nước ta, củ cải trắng là một loại rau củ phổ biến, rẻ tiền, được trồng và sử dụng nhiều. Một số nghiên cứu khoa học công bố gần đây ở nước ngoài cho thấy dịch chiết từ củ cải trắng trồng ở 1 số nước khác nhau có khả năng khử các gốc tự do, làm giảm các quá trình oxi hóa, vốn là nguyên nhân sâu xa gây ra nhiều loại bệnh tật ở người. Hoạt tính kháng khuẩn của củ cải trắng cũng được đánh giá cao. Nước ép và dịch trích ly từ củ cải trắng bằng các dung môi khác nhau (nước, methanol, etahnol, ethyl acetate, este dầu hỏa) đã được xác định là có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc khác nhau. Tuy nhiên, hoạt tính của dịch chiết phụ thuộc vào giống và đặc điểm nguồn gốc, điều kiện địa lý của vùng trồng. Đó là lý do chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng (Raphanus sativus L.). Trong nghiên cứu này của chúng tôi đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết thô của củ cải trắng (Raphanus sativus L.) thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về củ cải trắng 1.1.1. Đặc điểm của cây và củ cải trắng Củ cải trắng (white radish) là củ của cây cải củ, có tên khoa học là Raphanus sativus L. thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Brassicales, họ Brassicaceae, chi Raphanus, loài sativus [22]. Củ cải trắng là tên gọi phổ biến ở Việt Nam. Ngoài ra , Raphanus sativus L.còn có các tên gọi khác như Rettich (Đức), Daikon (Nhật), Hua piahs (Thái Lan), Lai fu (Trung Quốc), Lobak beurem (Indonesia), Mu (Hàn Quốc), Muli (Ấn Độ) [22]. Củ cải được thuần hóa ở Châu Âu trong thời kì tiền La Mã. Những cư dân cổ đại của Hy Lạp cho rằng các loại củ cải có giá trị nhất trong tất cả các loại cây trồng lấy củ. Loại củ này được xem là một thực phẩm thông dụng ở Ai Cập trước khi các kim tự tháp được xây dựng và củ cải cũng rất phổ biến ở thời Ý cổ đại. Chính Columbus và những người đầu tiên khai hoang Châu Âu đã đem củ cải vào trồng trọt [16]. Củ cải được sử dụng như một loại thực phẩm trong bữa ăn của người Ai Cập cổ vào khoảng 2700 - 2200 trước công nguyên, sau đó được trồng ở châu Âu vào thế kỉ 16 - 17 và châu Mỹ vào thế kỉ 20. Ở khu vực Đông Á, nhiều loại củ cải khác nhau đã được phát hiện trồng ở Trung Quốc khoảng 2450 năm trước và ở Nhật Bản khoảng 1300 năm trước [20]. Cây củ cải là một loại cây cho củ hàng năm hoặc hai năm một lần. Loại cây này được trồng chủ yếu để lấy củ do rễ củ chứa nhiều chất dinh dưỡng. Cây củ cải cao khoảng 30 - 120 cm, có loại bề mặt láng nhẵn nhưng cũng có loại bề mặt sần sùi hoặc có loại có lông cứng, mọc thẳng đứng vàcuống lá phân thành nhánh. Củ cải có nhiều thịt, phình ra, có nhiều màu sắc như trắng, hồng, đỏ hoặc đen. Ngoài ra, hình dạng củ cải có thể thuôn dài hoặc có dạng hình cầu [21]. Hình 1.1. Cây và củ cải trắng Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Lá to có dạng hình đàn lia xẻ lá, có cuống, có lớp lông tơ mỏng láng bề mặt, rìa lá có răng cưa. Lá non thường không phân nhánh và có răng cưa [21]. Hoa của cây củ cải có màu hơi đỏ tía hay màu hồng tới gần trắng với gân hoa màu tím dài từ 1,5- 2 cm, đường gân nhỏ dần về phía cuống lá. Bên trong hoa còn có chỉ nhị mảnh, bao phấn hình mũi tên nằm trong vòi nhụy và đầu nhụy. Quả cải thuộc loại quả không nẻ, có dạng hình thoi phình to ở giữa và nhọn dần về hai đầu, khi bóp nhẹ quả cải sẽ thấy một đường nứt xuất hiện và bên trong đó là các hạt cải. Một quả cải cho được từ 2 đến 4 hạt cải. Hạt cải có dạng hình cầu hoặc hình trứng, kích thước hạt khoảng 2,5 - 4 mm [21]. Củ cải có thể trồng quanh năm nhưng để thu được củ cải chất lượng tốt thì thường trồng vào mùa xuân và đầu mùa thu. Thời gian nuôi trồng của củ cải từ khoảng 50 đến 90 ngày, phụ thuộc vào từng loại khác nhau và chất lượng sản phẩm khi thu hoạch. Để thu hoạch một loại củ cải nặng 500 g thì thời gian thu hoạch khoảng 50 đến 60 ngày vào mùa hè và khoảng 70 đến 80 ngày vào mùa đông. Củ cải phát triển tốt ở điều kiện nhiệt độ khoảng 20 - 250C, pH đất trồng tối ưu từ 6,0 - 6,5 cũng như cần ánh sáng và nước với liều lượng thích hợp để tăng trưởng [22]. Hình 1.2. Hoa, lá và quả của cây cải củ 1.1.2. Thành phần hóa học của củ cải trắng 1.1.2.1. Thành phần hóa học cơ bản Các thành phần hóa học cơ bản của 100 g củ cải trắng được nêu ở bảng 1.1. Trong củ cải trắng, ngoài thành phần nước chiếm tỉ lệ cao thì protein chiếm tới 1,5% khối lượng. Củ cải có chứa nhiều acid amin thiết yếu như lysine, methionine, tryptophan, phenylalanine, threonine, valine,leucine, isoleucine, histidine,... cũng như các acid béo như acid palmitic, acid oleic, acid linoleic, acid linolenic [40]. Củ cải trắng có hàm lượng lipid thấp. Lipid trong củ cải giúp tạo vị ngon cho củ. Trong củ cải, glucid chiếm hàm lượng cao. Sucrose là một loại carbohydrate dự trữ Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT quan trọng trong thực vật, đặc biệt trong các cơ quan lưu trữ như củ, rễ và hạt. Kích thước củ cải càng lớn thì hàm lượng sucrose và glucose càng cao. Glucid trong củ cải trắng bao gồm đường, tinh bột, pectin và xơ. Đường trong củ cải trắng chủ yếu là glucose, một lượng nhỏ fructose, sucrose và pentosan. Tinh bột thay đổi tùy theo giống, chiếm từ 0,2 - 0,5%. Xơ chiếm một lượng khoảng 1,5 % gồm chủ yếu là cellulose và hemicellulose có trong phần vỏ, mô nâng đỡ và thành tế bào của củ cải trắng, đóng vai trò tạo cấu trúc, chống lại các va chạm cơ học. Pectin chiếm khoảng 0,3%, chủ yếu tham gia vào cấu tạo của thành tế bào, tồn tại chủ yếu dưới dạng calcium pectate. Ngoài ra, củ cải trắng còn nổi bật với hàm lượng lipid thấp, hàm lượng vitamin và khoáng cao. Một số khoáng vi lượng cũng được tìm thấy trong củ cải trắng như nhôm, bari, liti, mangan, silic, titan, flo và iod với hàm lượng tổng lên đến 18 pg/100 g [28, 30, 17]. Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong 100g củ cải trắng tươi STT Thành phần Đơn vị Hàm lượng G 92,1 Kcal 21 1 Nước 2 Năng lượng 3 Protein G 1,5 4 Lipid G 0,1 5 Glucid G 3,6 6 Chất xơ G 1,5 7 Tro g 1,2 8 Đường tổng g 2,5 9 Canxi mg 40 10 Sắt mg 1,1 11 Magie mg 15 12 Phospho mg 41 13 Kali mg 242 14 Natri mg 10 15 Đồng pg 150 16 Vitamin C mg 30 17 Vitamin B 1 mg 0,06 18 Vitamin B2 mg 0,06 19 Vitamin PP mg 0,5 20 Vitamin B5 mg 0,138 21 Vitamin B6 mg 0,046 (Nguồn: National Nutrient Database for Standard). 1.1.2.2. Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng Trong củ cải trắng có nhiều enzyme được tìm thấy như enzyme amylase, invertase, ß-galactosidase, protease, cellulase, peroxidase. Enzyme invertase đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân đường sucrose thành glucose và fructose ở thực vật bậc cao, đặc biệt là ở các mô dự trữ. Sucrose là một sản phẩm ban đầu của phản ứng quang hợp, chúng cũng được xem là cacbohydrate vận chuyển tự do trong các cơ quan ở thực vật. Protease còn là enzyme quan trọng trong việc điều chỉnh lại sự lão hóa ở cây [28]. Ngoài ra còn có các acid hữu cơ có lợi cho sức khỏe như acid malic, acid oxalic, acid erythorbic có trong củ cải và acid erucic, acid linoleic, acid oleic có trong hạt củ cải. Bên cạnh đó, trong củ cải còn có acid palmitic, acid stearic trong dịch trích ly ether dầu hỏa từ hạt củ cải, acid glutamic trong củ cải muối chua [12]. Ở củ cải có nhiều acid phenolic như acid caffeic, acid p-coumaric, acid ferulic, acid hydroxycinnamic, acid p-hydroxybenzoic, acid vanillic, acid salicylic, acid gentisic, anthocyanin, pelargonidin, cyanidin. Trong củ cải trắng có các hợp chất flavonoid như quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin và luteolin. Ngoài ra, trong củ cải còn có polysaccharides, proteoglycans, sắc tố, hợp chất có chứa lưu huỳnh,các chất kháng khuẩn (saphanin và sulphoraphene), ß-carotene. Hàm lượng raphanusol A và B trong củ cải trắng tăng khi có ánh sáng và giảm khi thiếu ánh sáng. Raphanusol A và raphanusol B là chất ức chế sự tăng tưởng của cây trồng để cây củ cải không bị úa vàng và hạt củ cải bị hư [12]. Ngành Công nghệ Thực phẩm Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Mùi hăng của củ cải được tìm thấy bởi hợp chất glucosinolate. Ở củ cải tồn tại 4 loại glucosinolate là glucoraphenin, dehydroerucin, glucobrassicin và glucoerucin. Glucosinolate trong củ cải giúp tăng lượng enzyme tham gia vào việc giải độc các chất gây ung thư. Chất này có tiềm năng được sử dụng như một chất ngăn chặn sự lão hóa [21]. I.2.2.3. Tác dụng sinh học của củ cải trắng Rosa M.P. Gutierrez và Rosalinda L.Perez (2004) đã nghiên cứu về thành phần các hợp chất có mặt trong củ cải trắng gồm: alkaloid và các hợp chất có nitơ, coumarin, enzyme, glucosinolate, các acid hữu cơ, các hợp chất phenol... Nghiên cứu cũng đã khẳng định nước ép từ củ cải trắng có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn G+, G" và nhiều loại nấm (E. Coli, Pseudomonas pyocyaneus, Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae và Fusarium culmorum...) do sự tồn tại của các peptide giàu cystein Rs-AFP1 và Rs-AFP2, các protein RAP-1 (6,1 kDa) và RAP-2 (6,2 kDa), acid cafeic, acid ferulic, phydroxybenzoic acid. Ngoài ra, cũng theo công bố này, củ cải còn có hoạt tính miễn dịch, chống oxi hóa, chống ung thư, kháng virus,... [12]. Hirotaka Katsuzaki và cộng sự (2004) đã có nghiên cứu so sánh hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết củ cải trắng bằng nước nóng và nước ở nhiệt độ bình thường. Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết củ cải trắng bằng nước nóng cao hơn dịch chiết bằng nước ở nhiệt độ bình thường. Hợp chất chống oxi hóa được phân lập và xác định là L-tryptophan. Khi tiến hành nghiên cứu trên gan chuột thì L-tryptophan chuyển hóa thành 5-hydroxyl tryptophan [14]. Narisa Kamkaen và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme tyrosinase của 16 loại rau khác nhau ở Thái Lan, bao gồm củ cải trắng. Mẫu rau được rửa sạch, cắt nhỏ, xay nhuyễn. Quá trình trích ly được thực hiện với các dung môi hexan, ethyl acetate, methanol và propylen glycol 50% với tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 1: 4, trích ly bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Dịch sau trích ly được lọc loại bỏ bã. Pha loãng 5 lần dịch sau lọc để có dung dịch mẫu phân tích. Khả năng ức chế Tyrosinase từ nấm được xác định bằng cách cho vào ống nghiệm 20 pl tyrosinase 1000 U/ml, 20 pl dung dịch đệm phosphate 0,1 M (pH 6,8), 100 pl dịch mẫu và 20 pl dung dịch L-DOPA 0,85 mM. Ủ ở 250C trong 10 phút rồi đo Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT methanol và propylen glycol 50% của củ cải trắng ức chế tyrosinase từ nấm ở các mức lần lượt là 38,43; 68,73; 53,51 và 88,50 % [23]. R. Jakmatakul và cộng sự (2009) đã so sánh khả năng ức chế tyrosinase và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết methanol và nước ép từ củ cải trắng Thái Lan lạnh đông chậm nhằm xác định tiềm năng làm trắng da và chống lão hóa trong các ứng dụng mỹ phẩm. Kết quả nghiên cứu công bố cho thấy nước ép từ củ cải lạnh đông chậm có hàm lượng các hợp chất phenolic, flavonoid và acis ascorbic cao hơn trong dịch chiết methanol, khả năng khử các gốc tự do (DPPH, superoxide, oxi đơn) và ức chế tyrosinase của nước ép cũng cao hơn so với dịch chiết methanol. Nghiên cứu cũng đã xác định được giá trị IC50 cho khả năng ức chế tyrosinase của dịch chiết methanol là 9,62 mg/ml và và của nước ép là 3,09 mg/ml. Do đó, tác giả cũng đề nghị về việc xem xét hướng nghiên cứu sử dụng R.sativus vào công nghệ mỹ phẩm dưỡng da [25]. Syed Sultan Beevi và cộng sự (2010) khảo sát thành phần các hợp chất polyphenol, khả năng chống oxi hóa và khử gốc tự do của lá và củ cải trắng Raphanus sativus L. Lá và củ được tách riêng, rửa sạch, sấy khô và xay thành bột mịn, bảo quản ở -200C đến khi phân tích. Bột sau đó được trích ly với các dung môi tinh khiết (methanol, chloroform, acetone, ethyl acetate và hexan) 3 lần, mỗi lần 24 giờ ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1: 40 (g/ml). Dịch trích ly sau đó được gom lại, cô giảm áp ở 400C thu cắn, cắn hòa tan lại vào methanol để dùng làm mẫu phân tích xác định thành phần polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa. Kết quả cho thấy trong lá và củ cải có các chất chống oxy hóa và có khả năng khử gốc tự do. Dịch chiết methanol và acetone của lá củ cải trắng có tổng hàm lượng polyphenol lần lượt là 86,16 và 78,77 mg/g chất khô, có thể so sánh với trà xanh và trà đen. Phân tích HPLCDAD cho thấy sự hiện diện của catechin, acid syringic, acid vanillic, axit ferulic, acid sinapic, o-coumaric acid, myricetin, và quercetin trong dịch chiết tất cả các dung môi trên cả lá và củ, hàm lượng các chất trong lá cao hơn trong củ. Dịch chiết methanol từ lá và củ cho thấy khả năng ức chế đáng kể acid linoleic peroxy và biểu thị hoạt động khử ion kim loại. Cụ thể, IC50khi khử gốc tự do DPPH lần lượt là 31 và 42 mg/ml, khi khử superoxide là 23 và 52 mg/ml cho, khi khử hydrogen peroxide là 67 và 197 mg/ml, khi khử gốc NO'. 56 và 62 pg/ml, tương ứng [34]. S. Shukla và cộng sự (2011) đã khảo sát khả năng kháng khuẩn của nước ép từ củ cải trắng Ân Độ. Củ cải tươi, rửa sạch, ép lấy nước, lọc loại bã và cô giảm áp ở 35 ± Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017________________________________ ĐHBRVT 50C để thu cao. Cao này sau đó hòa tan lại vào nước ở các nồng độ xác định dùng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn. Các chủng vi sinh được khảo sát gồm S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis. Mẫu đối chứng là kháng sinh ampicillin. Kết quả cho thấy nước ép từ củ cải trắng Ân Độ có khả năng ức chế sự phát triển của cả 5 chủng vi sinh khảo sát, giá trị MIC xác định được dao động trong khoảng 0,078 - 0,625 mg/ml, trong đó hiệu quả tác động lên 2 chủng E. coli và Enterococcus faecalis là tương đương với ampicillin, và cao hơn ampicillin khi tác động lên Klebsiella pneumoniae (MIC là 0,078 mg/ml so với 0,312 mg/ml của ampicillin) [31]. K. Agarwal, R. Varma (2014) đã nghiên cứu về thành phần sinh hóa và khả năng khử gốc tự do DPPH của củ cải trắng. Kết quả công bố cho thấy dịch chiết trong nước nóng của củ cải trắng có khả năng khử gốc tự do DPPH ở mức 58,38% với nồng độ 200 ^g/ml, giá trị IC50 là 166,79 ^g/ml. Kết quả phân tích cho thấy trong dịch chiết có sự tồn tại của alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, triterpenoid và steroid [19]. H. Caglar Kaymak và cộng sự (2015) đã so sánh hoạt tính kháng khuẩn in vitro của củ cải trắng và củ cải đen ở Thổ Nhĩ Kì. Hai loại củ cải trắng và đen được trồng và chăm sóc như nhau, thu hoạch sau 80 ngày gieo hạt được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô, xay thành bột. Bột củ cải sau đó trích ly bằng phương pháp Soxhlet bằng dung môi methanol trong 72 giờ, nhiệt độ không vượt quá nhiệt độ sôi của dung môi. Dịch chiết sau đó đem lọc qua giấy Whatman No.1 rồi cô giảm áp thu cao. Cao này dùng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn. Hơn 100 giống vi sinh vật thuộc 52 loài khác nhau đã được dùng nghiên cứu. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol của củ cải trắng và củ cải đen có khả năng hạn chế sự phát triển của Arthrobacter atrocyaneus, Corynebacterium ammoniagenes, Enterobacter hormaechei, Kocuria rosea, Neisseria subflava, Pantoea agglomerans, Proteus vulgaris, Psychrobacter immobilis và Shigella dysenteriae. Ngoài ra, dịch chiết methanol của củ cải trắng còn tác động lên Bacillus sphaericus và Corynebacterium flavescen. Nhìn chung, củ cải trắng có phạm vi kháng khuẩn rộng và mạnh hơn củ cải đen [13]. 1.2. Giới thiệu chung về khuẩn 1.2.1. Bacillus cereus Bacillus cereus (B. cereus) thuộc: - Giới: Bacteria, - Ngành: Firmicutes, - Lớp: Bacilli, - Bộ: Bacillales, - Họ: Bacillaceae, - Chi: Bacillus, - Loài: cereus, - Tên khoa học là Bacillus cereus. B. cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5 - 500C, tối ưu ở 35 - 400C, pH dao động từ 4,5 - 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô, .. ,)[44]. Nồng độ muối tối đa cho sự sinh trưởng của B. cereus là 7,5% (Rajkowski và Bennett, 2003). Khi có oxy, B. cereus phát triển tối ưu nhưng chúng cũng có thể sống ở điều kiện kỵ khí. Các tế bào B. cereus được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ít chịu được nhiệt và acid hơn các tế bào B. cereus nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí hoặc nửa kỵ khí (Mols và cộng sự, 2009). Bào tử của B. cereus có khả năng chịu nhiệt khô hơn nhiệt ẩm và thường chịu nhiệt lâu hơn trong các thực phẩm có chứa hoạt độ nước thấp (Jenson và Moir, 2003). B. cereus cho phản ứng dương tính với oxidase, catalase, lecithinase. Chúng lên men glucose sinh acid trong điều kiện kỵ khí, khử nitrate tạo thành nitrite, dương tính với thử nghiệm VP (Voges Proskauer), thủy phân được L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0,001% lysozyme. B. cereus không lên men được mannitol cũng như arabinose [44]. Hình 1.3. Vi khuẩn B. cereus sau khi nhuộm Gram và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB. Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B. cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng. Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ trên 106CFU/g đủ gây ngộ độc. Triệu chứng ngộ độc phổ biến gây ra bởi B. cereus là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 4 - 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12 - 24 giờ. Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1 - 5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ [44]. 1.2.2. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) thuộc: - Giới: Bacteria, - Ngành: Proteobacteria, - Lớp: GammaProteobacteria, - Bộ: Pseudomonadales, - Họ: Pseudomonadaceae, - Chi: Pseudomonas, - Loài: aeruginosa, - Tên khoa học là Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn cực. P. aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu có NO3- làm chất nhận điện tử, phát triển tối ưu ở 370C [44]. P. aeruginosa cho phản ứng dương tính với catalase, citrate, oxidase, urease nhưng lại cho kết quả âm tính với các thử nghiệm MR (Methyl Red), VP (Voges Proskauer) và indole. Ngoài ra, P. aeruginosa có khả năng khử nitrate thành nitrite, hóa lỏng dung dịch có chứa gelatin. Chúng có khả năng thủy phân casein và tạo enzyme lipase nhưng lại không thủy phân được tinh bột. P. aeruginosa cũng không có khả năng lên men glucose và lactose để tạo acid [24].