Tài liệu Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cây hồ đằng rễ mành (cissus verticillata (l.) nicolson & c.e.jarvis)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY HỒ ĐẰNG RỄ MÀNH (Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis) Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS. TRẦN CÔNG LUẬN DS. TRÌ KIM NGỌC Cần Thơ, năm 2017 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN LÝ THẢO MSSV: 12D720401163 LỚP: ĐH DƯỢC 7B LỜI CẢM ƠN Từ xưa đến nay, không có sự thành công nào mà không gắn liền với sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều từ mọi người. Trong thời gian 5 năm học tập, gắn bó với giảng đường đại học, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Với sự biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả thầy cô ở khoa Dược – Điều dưỡng đã cùng với tri thức, tâm huyết của mình để truyền đạt tất cả vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Thầy cô không những chỉ dạy cho chúng em tri thức mà còn chỉ dạy cho chúng em cách làm người để chúng em có đủ hành trang khi bước vào đời. Đó là những điều vô cùng quý báu mà không có bất cứ thứ gì có thể so sánh được. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy Trần Công Luận và cô Trì Kim Ngọc, người đã tận tình hướng dẫn để em có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Do kiến thức còn hạn chế nên cũng không thể tránh khỏi những sai sót trong quá trình làm luận văn và báo cáo, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô để em có thể học hỏi được nhiều hơn và hoàn thiện bài báo cáo khóa luận tốt hơn. Sau cùng, em xin kính chúc thầy cô của khoa Dược – Điều dưỡng cũng như toàn bộ thầy cô giáo của trường Đại học Tây Đô thật nhiều sức khỏe và niềm tin để tiếp tực thực hiện hiện sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. Trân trọng. i LỜI CAM ĐOAN Em cam đoan đây là công trình nghiên cứu của em. Các số liệu, kết quả, hình ảnh nêu trong luận văn là trung thực và chính xác. Sinh viên thực hiện Nguyễn Lý Thảo ii TÓM TẮT Đặt vấn đề Hồ đằng rễ mành là một loại cây còn khá mới ở Việt Nam, nó được di thực từ châu Mỹ. Mọi người chỉ biết nó dùng để làm cảnh mà ít ai biết được, nó cũng đem lại rất nhiều công dụng trị bệnh như: Tăng huyết áp, đái tháo đường,…Đề tài này sẽ góp phần tìm hiểu thêm về giá trị mà cây thuốc đem lại với các nội dung: Mô tả định danh, khảo sát vi học, định tính sơ bộ thành phần hóa học và khảo sát tác dụng sinh học chống oxy hóa của cây. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Dược liệu là cây Hồ đằng rễ mành (Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis) thu hái vào tháng 10 năm 2016 tại tỉnh Bạc Liêu. Sau khi phơi khô, sử dụng bột dược liệu để mô tả định danh, khảo sát vi học, định tính sơ bộ thành phần hóa học. Từ 3 kg dược liệu HĐRM, sử dụng 1,6 lít cồn 96 % để làm ẩm dược liệu và 33 lít cồn 96 % chiết ngấm kiệt với tốc độ xả 10 – 15 giọt/ phút. Sau đó, đem toàn bộ dịch chiết thu được lắc phân bố lần lượt với các dung môi hữu cơ: PE, EtOAc để được các cao phân đoạn. Thử hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn bằng SKLM và quang phổ UV – Vis. Kết quả và kết luận Định danh chính xác tên khoa học của mẫu thực vật thu hái được dùng trong nghiên cứu là Cissus verticilla (L.) Nicolson & C.E.Jarvis, họ Nho (Vitaceae). Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học, xác định trong cây có flavonoid và một số thành phần hóa học khác: Carotenoid, tinh dầu, tannin, saponin, chất khử và hợp chất polyuronid. Chiết được cao tổng. Tiến hành lắc phân bố lần lượt thu được các cao với khối lượng như sau: 47,15 g cao PE; 19,43 g cao EtOAc; 27,53 g cao cồn nước còn lại. Kết quả thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy các cao đều có tác dụng chống oxy hóa và có thể sơ bộ kết luận cao EtOAc cho kết quả rõ nhất. Tiến hành thăm dò khả năng chống oxy hóa của các cao bằng phương pháp đo quang trên máy quang phổ UV – Vis cũng giúp khẳng định cao EtOAc chống oxy hóa mạnh nhất trong các cao. iii MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ vii DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................... ix CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................... 1 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 2 2.1. Thực vật học ...................................................................................................... 2 2.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................ 2 2.1.2. Đặc điểm họ Nho (Vitaceae)........................................................................ 3 2.1.3. Sơ lược về chi Cissus................................................................................... 3 2.1.4. Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis ............................................. 4 2.1.4.1. Mô tả hình thái.......................................................................................... 4 2.1.4.2. Phân bố, sinh thái...................................................................................... 4 2.1.4.3. Cách trồng ................................................................................................ 4 2.1.4.4. Thu hái, chế biến ...................................................................................... 5 2.2. Thành phần hóa học ........................................................................................... 5 2.3. Một số tác dụng dược lý của HĐRM.................................................................. 5 2.3.1. Tác dụng hạ đường huyết ............................................................................ 5 2.3.2. Tác dụng chống dị ứng và chống viêm ........................................................ 6 2.4. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa .................................................................. 6 2.4.1. Khái niệm về gốc tự do ................................................................................ 6 2.4.2. Chất chống oxy hóa ..................................................................................... 7 2.4.3. Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể ........................................ 7 2.4.3.1. Sự hình thành gốc tự do trong trao đổi bình thường .................................. 8 2.4.3.2. Sự hình thành gốc tự do ngẫu nhiên .......................................................... 8 2.4.4. Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại sinh đến sự hình thành gốc tự do .............. 9 2.4.4.1. Ảnh hưởng của các xenobiotic .................................................................. 9 2.4.4.2. Ảnh hưởng của các tác nhân viêm và hoại tử gan ...................................... 9 2.4.4.3. Ảnh hưởng của tác nhân tiêu máu và bầm huyết ..................................... 10 2.4.4.4. Ảnh hưởng của điều kiện sống ................................................................ 10 2.4.5. Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do ............................................... 11 iv 2.4.5.1. Hệ thống phòng vệ các gốc tự do trong cơ thể......................................... 11 2.4.5.2. Hệ thống enzym chống oxy hóa ở gan .................................................... 11 2.4.6. Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa................................... 13 2.4.6.1. Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH ..................................................... 13 2.4.6.2. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2- (Superoxyd scavenging) ......................................................................................................... 13 2.4.6.3. Phương pháp xác định hàm lượng MDA ................................................. 14 2.4.6.4. Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II ............................ 14 2.4.6.5. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2 ................. 14 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 16 3.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 16 3.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................... 16 3.1.2. Dung môi, hóa chất ................................................................................... 16 3.1.3. Trang thiết bị nghiên cứu ........................................................................... 16 3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 16 3.2.1. Mô tả định danh......................................................................................... 16 2.2.1.1. Hình thái ................................................................................................. 16 2.2.1.2. Vi học ..................................................................................................... 16 3.2.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học ............................................................ 18 3.2.3. Chiết xuất dược liệu .................................................................................. 19 3.2.4. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghệm DPPH ......................... 20 3.2.4.1. Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử ............................................................... 20 3.2.4.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao trên SKLM với TT DPPH20 3.2.4.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng cách đo độ hấp thu quang phổ UV – Vis ............................................................................................ 21 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 22 4.1. Mô tả định danh ............................................................................................... 22 4.1.1. Hình thái.................................................................................................... 22 4.1.2. Vi học........................................................................................................ 23 4.1.2.1. Vi phẫu ................................................................................................... 23 4.1.2.2. Soi bột .................................................................................................... 32 4.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học .................................................................. 36 v 4.3. Chiết xuất dược liệu......................................................................................... 39 4.4. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghệm DPPH ............................... 39 4.4.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao trên SKLM với TT DPPH .. 39 4.4.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng cách đo độ hấp thu quang phổ UV – Vis ............................................................................................ 40 4.5. Bàn luận .......................................................................................................... 43 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 44 5.1. Kết luận ........................................................................................................... 44 5.1.1. Thực vật học .............................................................................................. 44 5.1.2. Hóa học ..................................................................................................... 44 5.1.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa .............................................................. 44 5.2. Kiến nghị ......................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 45 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1. Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học ............................................................ 6 Bảng 3.1. Phản ứng thử nghiệm DPPH ........................................................................... 21 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học ..................................................... 37 Bảng 4.2. Kết quả xác định độ ẩm................................................................................... 39 Bảng 4.3. Kết quả thăm dò khả năng chống oxy hóa của 3 cao ở nồng độ 1 mg/ml ......... 40 Bảng 4.4. Kết quả đo độ hấp thu của cao EtOAc ở 5 nồng độ ......................................... 40 Bảng 4.5. Kết quả đo độ hấp thu của chất đối chứng vitamin C ở 5 nồng độ ................... 41 Bảng 4.6. Kết quả xác định giá trị IC50 của các mẫu........................................................ 42 vii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ vị trí phân loại thực vật của HĐRM .................................................... 2 Hình 2.2. Cây Hồ đằng rễ mành ................................................................................... 4 Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết ..................................................................... 18 Hình 3.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu HĐRM .............................................. 19 Hình 4.1. Các bộ phận của cây HĐRM ...................................................................... 22 Hình 4.2. Vi phẫu phiến lá HĐRM và sơ đồ kèm theo ............................................... 23 Hình 4.3. Chi tiết các bộ phận trong phiến lá ............................................................. 24 Hình 4.4. Vi phẫu cuống lá HĐRM và sơ đồ kèm theo .............................................. 25 Hình 4.5. Chi tiết các bộ phận trong cuống lá............................................................. 26 Hình 4.6. Vi phẫu thân già HĐRM và sơ đồ kèm theo ............................................... 27 Hình 4.7. Chi tiết các bộ phận trong thân già ............................................................ 28 Hình 4.8. Vi phẫu thân non HĐRM và sơ đồ kèm theo .............................................. 29 Hình 4.9. Chi tiết các bộ phận trong thân non ............................................................ 29 Hình 4.10. Vi phẫu rễ già bất định HĐRM và sơ đồ kèm theo ................................... 30 Hình 4.11. Chi tiết các bộ phận trong rễ già bất định HĐRM ..................................... 31 Hình 4.12. Vi phẫu rễ non bất định HĐRM và sơ đồ kèm theo .................................. 32 Hình 4.13. Chi tiết các bộ phận trong rễ non ............................................................. 32 Hình 4.14. Bột lá ....................................................................................................... 33 Hình 4.15. Các cấu tử trong bột lá HĐRM ................................................................. 33 Hình 4.16. Bột thân.................................................................................................... 34 Hình 4.17. Các cấu tử trong bột thân HĐRM ............................................................. 34 Hình 4.18. Bột rễ ....................................................................................................... 35 Hình 4.19. Các cấu tử trong bột rễ HĐRM ................................................................. 35 Hình 4.20. SKLM thăm dò hoạt tính chống oxy hóa .................................................. 39 Hình 4.21. Biểu đồ đường chuẩn của cao EtOAc ....................................................... 41 Hình 4.22. Biểu đồ đường chuẩn của vitamin C ......................................................... 41 Hình 4.23. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của các mẫu ................................................... 42 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic DMSO DPPH : Dimethyl sulfoxyd : 1,1 – diphenyl – 2 - picrylhydrazyl EtOAc HĐRM HTCO : Ethyl acetat : Hồ đằng rễ mành : Hoạt tính chống oxy hóa IC50 GSH : Inhibitory concentration half maximal : Glutathion GSH – Px LDL MDA : Glutathion peroxidase : Low density lipoprotein : Malonyl dialdehyd MeOH NBT RNS ROS PE SOD SKLM TT UV – Vis : Methanol : Nitroblue tetrazolium : Reactive oxygen species : Reactive nitrogen species : Petroleum ether (ether dầu hỏa) : Superoxyd dismutase : Sắc ký lớp mỏng : Thuốc thử : Ultra violet – visible ix CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một trong những đất nước có điều kiện tốt khí hậu tốt để thực vật phát triển và tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc nghiên cứu tạo ra các sản phẩm có giá trị trị bệnh cho con người. Chính vì vậy, từ ngàn xưa, ông cha ta đã khám phá sức mạnh của thiên nhiên và biết sử dụng nhiều loại thực vật nhằm mục đích chữa bệnh, đồng thời tránh được một số tác nhân có hại cho sức khỏe con người và được đặt lên hàng đầu. Xã hội ngày càng phát triển thì con người càng phải đối đầu với những loại bệnh mới, nguy hiểm hơn rất nhiều như: Đái tháo đường, tăng huyết áp, ung thư,…Từ nguyên nhân trên, nhu cầu về các loại thuốc cũng tăng cao. Do đó, việc nghiên cứu các chất mang hoạt tính sinh học cao có trong các loài cây, cỏ có tác dụng thiết thực trong đời sống hàng ngày là vấn đề quan tâm của toàn xã hội. Gần đây, có một loại cây di thực từ châu Mỹ du nhập vào Việt Nam và được sử dụng như một loại cây cảnh đẹp và lạ, đó là cây Hồ đằng rễ mành (Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis). Cây này có thể bắt gặp ở quán cà phê, nơi bán cây cảnh, nhà hàng,… Tuy nhiên, bên cạnh việc dùng để làm cảnh, cây còn đem lại một số tác dụng chữa bệnh: Đái tháo đường, hạ đường huyết (Almeida E.R., et al (2007); Pepato M.T., et al (2003); Viana G.S.B., et al (2004)), chống viêm và chống dị ứng (Quilez A.M., et al (2004)). Về hóa thực vật, trong cây có sự hiện diện của: Flavonoid, saponin, coumarin, steroid. Do cây mới xuất hiện ở Việt Nam trong khoảng thời gian gần đây nên việc theo dõi sự phát triển của cây với sinh thái, thổ nhưỡng cần được quan tam nhiều hơn. Để góp phần tìm hiểu thêm về giá trị mà cây thuốc đem lại, đề tài “Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành (Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis) được tiến hành với các nội dung sau: - Mô tả định danh, khảo sát vi học các bộ phận của cây HĐRM. - Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật của cây HĐRM. - Khảo sát tác dụng sinh học: Thử hoạt tính chống oxy hóa của cây HĐRM. 1 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Thực vật học 2.1.1. Vị trí phân loại Tên gọi: Hồ đằng rễ mành Tên gọi khác: Liêm hồ đằng, Mành mành Tên nước ngoài: Princess vine (tiếng Anh) Tên khoa học: Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis Đồng danh: Cissus sicyoides L. Họ: Nho (Vitaceae) Vị trí phân loại theo hệ thống Armen Takhtalan (Takhtalan A, 2009). Thực vật bậc cao (Cormobionta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Nho (Vitales) Họ Nho (Vitaceae) Chi Cissus Loài Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Javis Hình 2.1. Sơ đồ vị trí phân loại thực vật của HĐRM 2 2.1.2. Đặc điểm họ Nho (Vitaceae) (Trương Thị Đẹp, 2007) Thân: Cây bụi leo hay dây leo thân gỗ bằng vòi cuốn mọc đối diện với lá. Lá: Đơn, mọc cách, có khía răng hoặc có thùy hình chân vịt hoặc lá kép hình chân vịt với 3 – 5 lá chét. Lá kèm nhỏ, dễ rụng. Cụm hoa: Xim, tán, ngù, chùm, đôi khi chùm kép ở nách lá hay đối diện với lá (do sự phát triển cộng trụ của thân). Hoa: Nhỏ, đều, lưỡng tính hay đơn tính vì trụy, mẫu 4 hay 5, 4 vòng. Bao hoa: 4 – 5 lá đài, 4 – 5 cánh hoa, tiền khai van; cánh hoa có thể rời hay dính nhau ở chóp như một cái nón. Bộ nhị: Số nhị bằng số cánh hoa, rời và mọc trước cánh hoa. Đĩa mật dày nằm ở phía trong vòng nhị. Bộ nhụy: 2 lá noãn dính nhau thành bầu trên 2 ô, mỗi ô 2 noãn. Quả: Mọng, chứa 2 – 4 hạt, hạt có nội nhũ. 2.1.3. Sơ lược về chi Cissus Cây bụi leo, có tua cuốn đối diện với lá. Lá đơn, thường có răng, có khi chia thùy; lá kèm 2, nhỏ. Cụm hoa có cuống, thành tán hay ngù, đối diện với lá; hoa có cuống. Đài hình đấu. Cánh hoa 4, xếp van, tách ra ở đỉnh khi hoa nở. Nhị 4, đối diện với cánh hoa, đính xung quanh đĩa; bao phấn hướng trong. Đĩa mật nguyên, lượn sóng hay chia thùy. Bầu dính suốt chiều cao với đĩa mật; 2 ô, 2 noãn cong; vòi dạng cột; đầu nhụy ít rõ. Quả mọng hơi nạc; hạt độc nhất, có 2 hố nhỏ ở gốc (Võ Văn Chi, 2004; Phạm Hoàng Hộ, 2000). Gồm tới 350 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới và vùng nóng. Ở nước ta có một số loài được sử dụng (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 2000): - Cissus adnata Roxb. Dây nôi. - Cissus annamica Gagn. Hồ đằng trung bộ. - Cissus assamica (Laws.) Craib. Hồ đằng assam. - Cissus astrotricha Gagn. Hồ đằng lông sao. - Cissus bachmaensis Gagn. Hồ đằng bạch mã. - Cissus evrardii Gagn. Hồ đằng evrad. - Cissus hastata Pl. Hồ đằng mũi giáo. - Cissus hexangularis Thor. ex Gagn. Hồ đằng 6 cạnh. - Cissus javana DC. Hồ đằng Java, Hồ đằng hai màu. - Cissus modeccoides Pl. Chìa vôi. - Cissus quadrangulus L. Hồ đằng 4 cánh. - Cissus repens Lamk. Hồ đằng bò. - Cissus rosea Royle. Hồ đằng hường. 3 2.1.4. Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis 2.1.4.1. Mô tả hình thái - HĐRM là cây leo tua cuốn, cao 5 – 7 m hoặc hơn, phân nhiều cành mảnh, nhẵn, có hệ thống rễ bất định mọc ở các nách lá chạy dọc suốt thân cành. Những rễ này buông thòng mềm mại, màu hồng thắm khi còn non rồi chuyển qua màu vàng xám khi già dần. - Lá mọc đơn so le, phiến lá hình tim hẹp, dài 6 – 10 cm, rộng 4 – 6 cm, cuống lá dài 2 – 3 cm, đậm màu, tua cuốn mảnh đối diện với cuốn lá. - Cụm hoa là một xim ngắn dạng tán đứng đối diện với lá, mang nhiều hoa nhỏ lưỡng tính với 4 cánh hoa màu vàng lục, 4 nhị đứng đối diện cánh hoa, bầu trên. - Quả mọng, gần hình cầu, đường kính 8 – 10 cm, chứa 1 – 4 hạt, khi chín màu đen (Nguồn dẫn: Http://blogcaycanh.vn; http://chohoaonline.com). Hình 2.2. Cây Hồ đằng rễ mành 2.1.4.2. Phân bố, sinh thái - HĐRM là cây di thực phân bố tự nhiên ở nhiều vùng của châu Mỹ, từ Bắc Mỹ cho đến Trung và Nam Mỹ. - Ở nước ta, cây được trồng làm cảnh ở nhiều nơi. 2.1.4.3. Cách trồng - Cây rất dễ trồng, chọn phần thân bánh tẻ, bỏ lá, chỉ chừa một phần cuống, cắt thành từng đoạn có từ hai đến ba mắt lá để làm hom giâm, cắm trong những túi bầu (Nguồn dẫn: Http://caycanhsanvuon.vn; http://trongraulamvuon.com). 4 - Che nắng và theo dõi để tưới nước bổ sung sao cho vừa đủ ấm. Sau một thời gian, các chồi nách phát triển thành cành mới thì đem túi bầu đi trồng (Nguồn dẫn: Http://caycanhsanvuon.vn; http://trongraulamvuon.com ; http://chohoaonline.com). 2.1.4.4. Thu hái, chế biến - Lá tươi, thân hay rễ rửa sạch, đun với nước để ngâm chân (Nguồn dẫn: Http://caycanhsanvuon.vn). . - Thân, lá, rễ giã lấy nước giữ luôn bã để đắp lên vết bỏng hay vết ngứa, ngoài ra có thể phơi khô để Http://caycanhsanvuon.vn). nguyên hoặc nghiền thành bột (Nguồn dẫn: 2.2. Thành phần hóa học Các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây HĐRM không nhiều. Theo Barbosa W.L.R. et al (2002); Beltrame F.L. et al (2001), trong cây HĐRM có flavonoid với 2 cấu trúc chính là: Kaemferol – 3 – O – rhamnosid và quercetin – 3 – O – rhamnosid. Luteolin, kaempferol, luteonin – 3 – sulfat được chiết từ dung dịch nước sau khi thủy phân. Quercetin – 3 – O – rhamnosid CTPT: C21H21O11 Kaempferol – 3 – O – rhamnosid CTPT: C21H20O10 2.3. Một số tác dụng dược lý của HĐRM 2.3.1. Tác dụng hạ đường huyết Theo Almeida E.R., et al (2007), dịch chiết lá tươi của cây HĐRM làm giảm đáng kể lượng đường trong máu ở chuột mắc bệnh tiểu đường. Theo Pepato M.T., et al (2003), việc sử dụng lâu dài dịch của lá cây HĐRM ảnh hưởng đến các biến đổi sinh lý và trao đổi chất của carbohydrat, lipid, protein của chuột bị bệnh tiểu đường. 5 Theo Viana G.S.B., et al (2004), chỉ ra lợi ích tiềm năng của dịch chiết nước từ cây HĐRM trong việc làm giảm đường huyết trong máu trên chuột bị bệnh tiểu đường type 2. 2.3.2. Tác dụng chống dị ứng và chống viêm Theo Quilez A.M., et al (2004), cho thấy tác dụng chống dị ứng và chống viêm thông qua thử nghiệm in vitro phóng thích histamin từ tế bào mast của dịch chiết methanol trong cây HĐRM. 2.4. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa 2.4.1. Khái niệm về gốc tự do Các gốc tự do hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (ROS và RNS), là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử. Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải gốc tự do. Bảng 2.1. Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học O2•– OH• ROO• H2O2 1 Gốc superoxyd Gốc hydroxyl Gốc peroxyd Hydrogenperoxyd O2 NO• ONOOHOCl Oxy đơn Oxyd nitrid Peroxynitrid Acid hypochlorique Các gốc tự do là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện tử độc thân. Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxyd, nitroperoxyd là tiền chất của các gốc tự do. Các ROS và RNS phản ứng rất nhanh với các phân tử quanh nó do đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học như ADN, protein, lipid (Proctor P.H., 1989; Favier A., 2003; Pincemail J., et al, 1998). Các ROS và RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu đến cơ thể. Ở nồng độ thấp, các ROS và RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ: Điều hòa phân ly tế bào, kích hoạt các yếu tố phiên mã cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm và điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa. Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: Đột biến ở ADN, biến tính protein, oxy hóa lipid (Favier A., 2003; Pincemail J., et al, 1998). Sự phá hủy các đại phân tử sinh học bởi ROS và RNS là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm. Sự oxy hóa của các LDL dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu, giai đoạn đầu tiên của bệnh tăng huyết áp và nhiều bệnh tim mạch. Các ROS và RNS tấn công phospholipid màng tế bào làm thay đổi tính mềm dẻo của màng, thay đổi chức năng của nhiều thụ thể trên màng do đó ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của màng cũng như việc trao đổi thông tin giữa tế bào và môi trường. Sự oxy hóa 6 các ADN bởi các ROS và RNS gây nên biến dị di truyền là một trong những nguy cơ phát triển ung thư. Nhiều enzym và protein vận chuyển cũng bị oxy hóa và vô hoạt bởi ROS và RNS (Favier A., 2003; Gardès – Albert M., et al, 2003; Pincemail J., et al, 1998). Sự tích lũy các sản phẩm của sự oxy hóa các cấu tử tế bào gây nên hiện tượng lão hóa sớm. Các ROS và RNS cũng tham gia vào quá trình gây các bệnh suy giảm hệ thần kinh như Alzheimer, trong đó hiện tượng chết của các tế bào thần kinh gắn liền với hiện tương phân ly tế bào gây nên bởi các ROS và RNS (Gardès – Albert M., et al, 2003). Để bảo vệ cơ thể khỏi tác động xấu của các ROS và RNS, tế bào được trang bị một hệ thống bảo vệ gồm các chất chống oxy hóa. 2.4.2. Chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic S.V., et al 2000; Lachman J., et al, 2000; Singh N., et al, 2004). Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại: Các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai. Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo thành gốc tự do như đồng, sắt; vô hoạt oxy đơn). Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người được cung cấp bởi hai nguồn: Bên trong và bên ngoài. Các chất chống oxy hóa bên trong bao gồm các protein (ferritin, transferrin, albumin, protein sốc nhiệt) và các enzym chống oxy hóa (superoxyd dismutase, glutathion peroxidase, catalase). Các chống oxy hóa bên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường thức ăn bao gồm vitamin E, vitamin C, các carotenoid và các hợp chất phenolic (Niki E., et al, 1995; Lachman J., et al, 2000; Pincemail J., et al, 1998; Vansant G., et al, 2004). Các chất này có nhiều trong rau và quả. Chúng được coi là các chất chống oxy hóa tự nhiên. Việc sử dụng nhiều rau quả là con đường đơn giản và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa. 2.4.3. Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể Trong tế bào, gốc tự do được sinh ra do các phản ứng chuyển nhường điện tử. Những phản ứng này có thể được thực hiện bởi enzym hoặc không enzym, thông qua sự oxy hóa khử của các ion kim loại chuyển tiếp (Viện Dược liệu, 2006). 7 2.4.3.1. Sự hình thành gốc tự do trong trao đổi bình thường Trong sinh học, nguồn quan trọng sinh ra gốc tự do là sự cung cấp điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào trong ty lạp thể cho oxy. Trong ty lạp thể có một hệ thống enzym và các chất trung gian làm nhiệm vụ vận chuyển hydro và điện tử từ cơ chất tới oxy. Những hợp chất này tạo ra một loại các phản ứng dây chuyền nối tiếp nhau gọi là chuỗi hô hấp tế bào (Viện Dược liệu, 2006). Cơ chất Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế phải xảy ra qua nhiều giai đoạn. Mỗi giai đoạn oxy chỉ nhận được một điện tử. Oxy nhận điện tử đầu tiên tạo ra gốc superoxyd (O2•–). Oxy nhận điện tử chủ yếu ở màng ty lạp thể. Khoảng 80 % lượng O2•– hình thành chuyển vào trong ty lạp thể, còn 20 % thoát ra bào tương. O2•– có các chức năng như sau: Là nguồn sinh ra H2O2; cùng với NO2 và các chất phóng thải từ tế bào thành tham gia chi phối trạng thái tĩnh hay hoạt động của tiểu cầu, quyết định sự bám dính hay kết tụ của tiểu cầu vào thành mạch (Viện Dược liệu, 2006). Các gốc O2•– hình thành nhanh chóng được enzym SOD chuyển thành H2O2 theo cơ chế tự oxy hóa khử: H2O2 là tác nhân oxy hóa và dễ dàng bị phân hủy theo phản ứng: Như vậy, ở cơ thể bình thường, oxy qua các chuyển hóa trong cơ thể tạo ra O2•–, H2O2 để thực hiện các chức năng sinh lý. Chúng chỉ tồn tại với một nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể (Viện Dược liệu, 2006). 2.4.3.2. Sự hình thành gốc tự do ngẫu nhiên Rất có thể do chuyển động nhiệt hoàn toàn ngẫu nhiên mà các gốc O2•– và H2O2 va đập với nhau, không có men đặc hiệu xúc tác tạo ra một số phản ứng phụ sau (Viện Dược liệu, 2006):  Sự hình thành gốc tự do không có enzym SOD xúc tác Các gốc O2•– có khả năng phản ứng với nhau trong điều kiện không có enzym SOD xúc tác theo phản ứng sau: O2•– + O2•– + 2H+ → H2O2 + O2 8 Oxy đơn bội (1O2) có tính oxy hóa rất mạnh. Nó có thể phản ứng với bất kỳ một chất hữu cơ nào khi nó gặp tạo ra các peroxyd.  Phản ứng Harber – Weiss Các gốc O2 •– va đập với H2O2: O2•– + H2O2 → 1O2 + OH• + OHPhản ứng này xảy ra chậm, nhưng có mặt Fe2+, Cu2+ xúc tác thì tốc độ phản ứng xảy ra rất nhanh (phản ứng Fenton). Hai tiểu phân O2•– và H2O2 không độc có thể tạo ra 1O2, OH• là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm có hại cho cơ thể.  Sự hình thành gốc tự do từ các ion kim loại chuyển tiếp Ion kim loại chuyển tiếp (Fe2+, Cu2+) dễ dàng phân tách H2O2 thành gốc OH•. H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH• + OHBình thường phản ứng này trong sinh học ít xảy ra, vì H2O2 ở nồng độ thấp còn Fe2+, Cu2+ thường bị khóa ở dạng phức, ít ở trạng thái tự do. Các ion kim loại chuyển tiếp có thể phản ứng với oxy tạo ra gốc O2•–. Phản ứng này đặc biệt quan trọng vì nó khơi mào cho các phản ứng gốc tự do xảy ra. Fe2+ + O2 → Fe3+ + O2•– Cu+1 + O2 → Cu2+ + O2•– Như vậy, từ 4 tiểu phân O2•–, H2O2, O2 và kim loại chuyển tiếp cùng hợp biến sinh ra gốc OH• và 1O2 những tác nhân có khả năng phản ứng mạnh. Gốc OH• phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học ở tốc độ khuếch tán, có khả năng gây tổn thương lớn trong phạm vi bán kính nhỏ mà nó sinh ra. 2.4.4. Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại sinh đến sự hình thành gốc tự do 2.4.4.1. Ảnh hưởng của các xenobiotic Đây là các chất hóa học, cơ thể không tổng hợp sẵn ra được, ví dụ như các thuốc trừ sâu, diệt cỏ, các hợp chất nitro hữu cơ, các phẩm nhuộm. Khi xâm nhập vào cơ thể, các hóa chất này có giai đoạn trung gian tạo ra các gốc tự do (Viện Dược liệu, 2006). 2.4.4.2. Ảnh hưởng của các tác nhân viêm và hoại tử gan Các hợp chất halogen hữu cơ, điển hình là CCl4 là chất gây viêm hoại tử gan. Khi vào gan được chuyển hóa như sau: Chính các dạng gốc trung gian này làm tăng quá trình peroxy hóa lipid. Quá trình peroxy hóa lipid mãnh liệt sẽ gây phá vỡ màng tế bào, gây viêm và có khả năng gây hoại tử gan (Viện Dược liệu, 2006). 9 2.4.4.3. Ảnh hưởng của tác nhân tiêu máu và bầm huyết Điển hình là các diazonaphtol, diphenylhydrazin…, các chất này phản ứng với oxyhemoglobin tạo ra methemoglobin và gốc phenylhydrazin. Gốc này nhường điện tử cho oxy tạo ra O2•– (Viện Dược liệu, 2006). 2.4.4.4. Ảnh hưởng của điều kiện sống  Ảnh hưởng của sự ô nhiễm môi trường Khí thải của các động cơ dùng xăng, dầu có nhiều chất độc như: CO, NO, carbuahydro tetraethyl chì. Những chất này phân hủy tạo gốc tự do như sau (Viện Dược liệu, 2006):  Ảnh hưởng của stress Cơ thể hoạt động một cách bình thường là do cân bằng nội môi đã được thiết lập. Nếu có một yếu tố nào phá vỡ cân bằng nội môi thì được gọi là tác động của stress. Khi cơ thể bị các stress như sự di chuyển và thay đổi môi trường sống, sự thay đổi nhiệt độ quá nóng hay quá lạnh, môi trường quá ồn hay bị ô nhiễm, áp lực và sự căng thẳng – lo lắng trong công việc,…thì hàm lượng gốc tự do của oxy thường cao hơn 1,5 đến 2 lần so với đối chứng. Thông qua các dây thần kinh hướng tâm và vùng dưới đồi, cơ thể có những đáp ứng với các stress. Sự giải phóng ra adrenalin và noradrenalin, khi cơ thể bị stress tác động sẽ dẫn tới khả năng chuyển hóa tương tác với oxy tạo ra các gốc O2•. Đồng thời nhiều acid béo chưa no được giải phóng ra từ các lipid. Những yếu tố đó (gốc O2• tăng, acid béo chưa no tăng,…) thúc đẩy quá trình peroxy hóa tăng khi bị stress (Viện Dược liệu, 2006).  Ảnh hưởng của khu vực địa lý Các bức xạ mặt trời, bức xạ nền ở một miền nào đó có phát ra những tia ảnh hưởng tới sự hình thành các gốc tự do của oxy theo cơ chế như sau: 10