Tài liệu Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG LÊ THẢO NGUYÊN KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MỐC Aspergillus oryzae ĐỂ SẢN XUẤT ACID KOJIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG LÊ THẢO NGUYÊN MÃ SINH VIÊN: 1501360 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MỐC Aspergillus oryzae ĐỂ SẢN XUẤT ACID KOJIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới ThS. Lê Ngọc Khánh – người thầy đã truyền dạy cho tôi những bài học quý báu cũng như lòng yêu khoa học từ những ngày đầu nghiên cứu tới nay, đã hết lòng hướng dẫn, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đàm Thanh Xuân đã cho tôi những lời khuyên bổ ích, nhiệt tình hướng dẫn, giải đáp thắc mắc và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các anh, chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược, đặc biệt là tổ Công nghệ Sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tôi giải quyết khó khăn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các phòng ban cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, tạo môi trường tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu tại trường trong suốt 5 năm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên, tiếp cho tôi động lực, giúp đỡ tôi trên quãng đường học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Hoàng Lê Thảo Nguyên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2 1.1. Acid kojic ................................................................................................................. 2 Đặc điểm ................................................................................................................2 Ứng dụng ...............................................................................................................2 Phương pháp sản xuất acid kojic ..........................................................................4 1.2. Aspergillus oryzae .................................................................................................... 6 Chi Aspergillus ......................................................................................................6 Loài Aspergillus oryzae .........................................................................................7 1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae ........................................................................................................... 9 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men ...................................................9 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy ......................................................................10 1.4. Một số nghiên cứu về khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae ....................................................... 11 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 13 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ....................................................................................... 13 Nguyên vật liệu ....................................................................................................13 Thiết bị sử dụng ...................................................................................................14 2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 14 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae. .........................................................................14 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae ..........................................................................................14 2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 14 Phương pháp giữ giống .......................................................................................14 Phương pháp nhân giống ....................................................................................14 Phương pháp lên men thu acid kojic ...................................................................15 Phương pháp kết tinh ..........................................................................................15 Phương pháp định tính bằng thuốc thử FeCl3 5% ..............................................15 Phương pháp Schoorl - Regenbogen định lượng đường khử ..............................15 Phương pháp định lượng đường saccarose và tinh bột ......................................16 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 17 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae. .............................................................. 17 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae ..........................................................................17 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae ..................................................................................23 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae ................................................................................. 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A. oryzae Aspergillus oryzae A. albus Aspergillus albus A. candidus Aspergillus candidus A. nidulans Aspergillus nidulans A. flavus Aspergillus flavus A. niger Aspergillus niger A. fumigatus Aspergillus fumigatus A. paraticus Aspergillus paraticus DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các thành phần cơ bản trong môi trường lên men để sản xuất acid kojic từ Aspergillus oryzae ...........................................................................................................9 Bảng 3.1. Môi trường lên men thu acid kojic từ quá trình lên men A. oryzae với các nguồn carbon khác nhau ................................................................................................18 Bảng 3.2. Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn carbon trong môi trường lên men ..............................................................................................20 Bảng 3.3. Môi trường lên men thu acid kojic từ quá trình lên men A. oryzae với các nguồn nitơ khác nhau ....................................................................................................24 Bảng 3.4. Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn nitơ trong môi trường lên men .......................................................................................................26 Bảng 3.5. Môi trường lên men thu acid kojic từ quá trình lên men A. oryzae với các điều kiện pH khác nhau .........................................................................................................29 Bảng 3.6. Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi điều kiện pH môi trường lên men .......................................................................................................31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Quá trình hình thành acid kojic từ glucose ......................................................5 Hình 1.2. Quá trình hình thành di-O-acetylkojic acid từ tetra-O-acetyl-α-Dglucopyranosyl bromid bằng phương pháp tổng hợp hóa học ........................................6 Hình 1.3. Bào tử Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi quang học (a), (b) (môi trường Czapek) và dưới kính hiển vi điện tử (c) .........................................................................8 Hình 3.1. Hình ảnh sinh khối của Aspergillus oryzae với các môi trường nuôi cấy AG, AS, AM, AT sau 12 ngày lên men ................................................................................19 Hình 3.2. Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men của A. oryzae trong môi trường nuôi cấy AG (a) và AS (b) .............................................................................................19 Hình 3.3. Hình ảnh phản ứng của acid kojic (hòa tan trong ethanol) với sắt (III) clorid 3% ..................................................................................................................................20 Hình 3.4. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn carbon trong môi trường .....................................................................................21 Hình 3.5. Biểu đồ so sánh tỉ lệ đường tiêu thụ của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn carbon trong môi trường lên men ..................................................................................22 Hình 3.6. Hình ảnh sinh khối của Aspergillus oryzae với các môi trường nuôi cấy GP, GC, GN, GNC sau 12 ngày lên men .............................................................................25 Hình 3.7. Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men A. oryzae trong môi trường nuôi cấy GC (a) và GP (b) .....................................................................................................25 Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn nitơ trong môi trường .........................................................................................27 Hình 3.9. Biểu đồ so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn nitơ trong môi trường lên men ............................................................................28 Hình 3.10. Hình ảnh sinh khối của Aspergillus oryzae với các môi trường nuôi cấy GP1, GP2, GP3 sau 12 ngày lên men .....................................................................................30 Hình 3.11. Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men A. oryzae trong môi trường nuôi cấy GP1 (a) và GP2 (b) .................................................................................................31 Hình 3.12. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi điều kiện pH môi trường................................................................................................32 Hình 3.13. Biểu đồ so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ của Aspergillus oryzae trong các môi trường lên men có điều kiện pH khác nhau............................................................33 ĐẶT VẤN ĐỀ Acid kojic là một acid hữu cơ và là chất chuyển hóa thứ cấp, được tiết ra từ các chủng vi nấm thuộc chi Penicilium, Mucor, Aspergillus… hoặc vi khuẩn nhóm Gluconoacetobacter [17], [22]. Trong đó, qua nhiều nghiên cứu Aspergillus oryzae đã cho thấy được tiềm năng lớn trong sản xuất sinh tổng hợp acid kojic, đồng thời không sinh ra độc tố aflatoxin [32], [35], [46]. Acid kojic được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: y học, công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp, công nghiệp hóa chất và đặc biệt là trong công nghiệp mỹ phẩm [14], [16], [18], [36]. Thị trường của acid kojic phát triển từ năm 1955 với nỗ lực sản xuất đầu tiên thuộc về công ty Pfizer (Mỹ) [36]. Mặc dù đã được sản xuất và ứng dụng trên quy mô công nghiệp nhưng nỗ lực cải thiện quá trình sản xuất acid kojic vẫn tiếp tục được nghiên cứu một cách rộng rãi. Hai hướng nghiên cứu chính để nâng cao hiệu suất quá trình sản xuất acid kojic là cải thiện chủng giống và tối ưu quá trình lên men [18], [36]. Hiện nay, ở Việt Nam, nghiên cứu về những vấn đề trên chưa được công bố rộng rãi. Với những lý do đó đồng thời mong muốn được góp phần vào các nghiên cứu về cải thiện khả năng sinh acid kojic, đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic” được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae. 2. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Acid kojic Đặc điểm Công thức tổng quát: C6H6O4 Tên khoa học: 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)pyran-4-on Thành phần: C 50,70%; H 4,23%; O 45,07% Khối lượng phân tử: 142,11 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: dao động từ 150 – 160℃ [10], [30]. Công thức cấu tạo: OH O HO O Acid kojic ở điều kiện thường là chất rắn, kết tinh dưới dạng tinh thể hình que, lăng trụ không màu, không mùi, tan trong nước (43,85 g/L), tan tốt trong ethanol, aceton, ethyl ether, hầu như không tan trong benzen, chloroform [16], [18], [36]. Acid kojic là một ℽ-pyron đa chức năng và có tính acid yếu. Nó phản ứng ở mọi vị trí trên vòng và có thể tạo ra một số sản phẩm có giá trị trong công nghiệp hóa học, ví dụ như chelat kim loại, pyridon, pyridin, ether, azodyes, mannich base, các sản phẩm cyanoethyl hóa [27], [47]. Ở vị trí cacbon số 5, nhóm hydroxyl hoạt động như một acid yếu, có khả năng tạo thành muối với một số ít kim loại như natri, kẽm, đồng, canxi, niken và cadimi [18], [36]. Một phản ứng đặc trưng của acid kojic là tạo thành phức màu đỏ sáng với ion Fe3+ [13]. Ứng dụng  Trong y học Acid kojic và các dẫn xuất của nó có tính chất kháng sinh, chống lại các vi khuẩn Gram âm cũng như các vi khuẩn Gram dương. Tại nồng độ lớn hơn 0,5%, acid kojic có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, chống lại trực khuẩn lao trong điều kiện in 2 vitro dưới nhiều điều kiện khác nhau và tại nồng độ 0,045%, acid kojic ức chế hoàn toàn sự phát triển bề mặt của trực khuẩn [33]. Dẫn xuất 7-iodo của acid kojic có hoạt tính mạnh chống lại tụ cầu khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus [31]. Dưới dạng muối azidometalkojat, acid kojic cho thấy tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm trên một số loài Bacillus, Staphylococcus. Azidometalkojat dạng dẫn xuất kẽm thể hiện tác động gây độc nhất định lên tế bào HeLa [26], [36].  Trong mỹ phẩm: Hiện nay acid kojic được ứng dụng rất nhiều trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và đây cũng là lợi ích nổi bật nhất của nó. Acid kojic chủ yếu được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất kem làm trắng da, kem dưỡng da, xà phòng làm trắng và các sản phẩm chăm sóc răng miệng. Tác dụng làm trắng da của nó được giải thích dựa trên cơ chế ức chế sự hình thành tyrosinase – enzym xúc tác quá trình chuyển hóa tyrosin thành melamin, từ đó ức chế hình thành melamin, dẫn đến ngăn cản sự gia tăng sắc tố trong da người. Tác dụng này đã được chứng minh trên in vitro và in vivo [19], [36], [42]. Nhiều nghiên cứu đã báo cáo về phương pháp tổng hợp dẫn xuất của acid kojic: acid kojic dipalmitat, acid kojic laureat, acid kojic ester nhằm cải thiện độ tan và độ ổn định của acid kojic trong các sản phẩm mỹ phẩm. Mặt khác, các dẫn xuất của acid kojic được tổng hợp thông qua liên kết ethylen của nhóm phosphonat với aldehyd có hoạt tính ức chế enzym tyrosinase mạnh gấp 8 lần acid kojic. Phản ứng liên hợp acid kojic với các acid amin cũng tạo ra các liên hợp có hoạt tính ức chế tyrosinase cao hơn và ổn định hơn so với acid kojic đơn thuần [34], [37]. Ngoài tác dụng ức chế hình thành tyrosinase, acid kojic còn có khả năng bảo vệ da khỏi ảnh hưởng của tia cực tím [36].  Trong công nghiệp thực phẩm Acid kojic có nguồn gốc tự nhiên trong các món ăn truyền thống của Nhật Bản như miso, nước tương và sake [14], [36]. Trong sản xuất, acid kojic còn đóng vai trò là tiền chất cho các chất điều hương vị điển hình như maltol và ethyl maltol (hợp chất có công dụng cải thiện mùi vị thực phẩm, đồng thời cũng là một thành phần trong nước hoa) [14], [27]. Một công dụng khác của acid kojic là ngăn ngừa sự hình thành các vết nâu (do các phản ứng hóa học xảy ra bên trong thực phẩm) trong quá trình bảo quản và chế biến mì 3 thô. Nó có tác dụng ức chế polyphenol oxidase trong nấm, táo, khoai tây, một số loại tôm dựa trên khả năng ngăn cản hấp thu oxy cần thiết cho quá trình hóa nâu (là quá trình hình thành các sắc tố màu nâu ảnh hưởng đến mùi vị, màu sắc và giá trị của thực phẩm) [19], [36], [43]. Do vậy, đây cũng là một ứng dụng phổ biến của acid kojic: dùng trong bảo quản thực phẩm.  Trong công nghiệp hóa học Là thuốc thử để xác định sắt: Acid kojic là dẫn xuất pyron đầu tiên được sử dụng để phân tích sắt trong quặng dựa trên phản ứng hóa học. Cơ sở của phương pháp này là khả năng tạo phức hợp bền màu đỏ với lượng nhỏ ion sắt nồng độ 0,1 ppm của acid kojic. Phức hợp chelat của acid kojic với kim loại được coi như cơ sở cho sự kiểm soát giải phóng của ion kim loại trong các chất có tác dụng làm thuốc hoặc các chất xúc tác [36], [47]. Acid kojic có thể dễ dàng kết hợp với chitosan để sản xuất các hợp chất acid kojic – chitosan (hoạt chất sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp và môi trường) [44].  Trong nông nghiệp Acid kojic có tác dụng nhất định chống lại côn trùng Heliothis zea và Spodoptera frugiperda (loài sâu bướm gây hại cho cây trồng). Đồng thời nó được sử dụng như một chất tạo phức chelat để sản xuất thuốc trừ sâu. Acid kojic có tác dụng ức chế sự phát triển của ấu trùng Trogoderma (một loài bọ cánh cứng), làm mất khả năng sinh sản của cả con đực và con cái thuộc chi này. Các dẫn xuất của acid kojic có tác dụng chống nấm Phythium graminicola, Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, gây bệnh thối hạt, héo lá cho cây trồng [12], [21], [36]. Phương pháp sản xuất acid kojic a. Phương pháp sinh tổng hợp Acid kojic được sản xuất bằng phương pháp vi sinh vật với các chủng có khả năng sinh acid kojic. Có 58 chi khác nhau được sử dụng để sản xuất acid kojic là Penicilium, Mucor, Aspergillus... [22]. Năm 1907, tiến sĩ Saito lần đầu tiên phát hiện ra sự xuất hiện của acid kojic từ sợi nấm Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên nguồn cơ chất là tinh bột [41]. Yabuta cũng phân lập được acid kojic từ các môi trường dinh dưỡng của A. albus, A. candidus và A. nidulans. Tiếp sau đó, nhiều vi sinh vật khác đã được chứng minh là có khả năng sản xuất acid kojic. Đặc biệt, hầu hết các chủng thuộc nhóm A. 4 flavus – oryzae – tamarii đều có khả năng sinh acid kojic với sản lượng cao và A. oryzae, A. flavus là hai chủng được sử dụng rộng rãi nhất cho mục đích này. Acid kojic còn có thể được sản xuất từ quá trình lên men của Penicillium daleae, từ nhóm vi khuẩn Gluconoacetobacter [9], [15]. Ngoài ra, acid kojic còn có thể được sản xuất bằng cách sử dụng một số loài thực vật như Kigella africana [23]. Rất nhiều loại cơ chất có thể được sử dụng để tổng hợp acid kojic, đó là các hợp chất có hai nguyên tử carbon (ethanol, acid glycolic), ba (glycerol, dihydroxyaceton), bốn (acid tartric), năm (ribitol, arabinose), sáu (glucose, manitol, sorbitol) hoặc bảy (acid quinic, acid shikimic). Ngoài ra còn có thể sử dụng các di-, tri- và polysaccharid như gạo, khoai lang, lúa mì, lúa mạch đen, yến mạch [9], [14]. Kinoshita và Haworth đã nhận ra mối quan hệ chặt chẽ về cấu trúc của acid kojic và glucose. Glucose (I) thông qua quá trình oxy hóa tạo thành chất trung gian ketonic (II), sau đó mất hai phân tử nước để tạo thành acid kojic (III) [15]. Trong quá trình lên men, glucose trong môi trường chuyển đổi thành acid kojic thông qua hoạt động của hệ thống enzym liên kết với tế bào bao gồm glucose-6-phosphat dehydrogenase, hexokinase và gluconat dehydrogenase [10], [11]. Glucose hoạt động như một tiền chất trong tổng hợp acid kojic và quá trình tổng hợp chấm dứt khi tất cả lượng đường trong môi trường cạn kiệt [38]. Hình 1.1. Quá trình hình thành acid kojic từ glucose b. Phương pháp tổng hợp hóa học Cơ chất ban đầu cho quá trình sản xuất acid kojic bằng phương pháp tổng hợp hóa học cũng là carbonhydrat, nhưng chỉ có hexose và những dẫn chất của chúng mới được sử dụng cho quá trình này. Maurer và cộng sự đã nghiên cứu để tìm ra phương thức hình thành cấu trúc ℽ-pyron từ tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl bromid (IV). Đầu tiên HBr được loại ra khỏi (IV) bằng diethylamin trong benzen, tetra-O-acetyl-(2-hydroxy-D5 glucal) (V) tạo thành được clo hóa trong ether khô, hỗn hợp đồng phân diclorid (VI) tạo ra bị thủy phân bởi Ag2CO3 hoặc nước thành 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucoson hydrat (VII) và cuối cùng tạo thành di-O-acetylkojic acid (VIII) bằng anhydrid acetic và pyridin ở 0oC hoặc bằng cách đun nóng với anhydrid acetic và natri acetat khan. Stacey và Turton đã đơn giản hóa quá trình tổng hợp acid kojic bằng cách chuyển trực tiếp từ (V) thành (VII) bằng acid perbenzoic, giản lược đi bước clo hóa [15]. Hình 1.2. Quá trình hình thành di-O-acetylkojic acid từ tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl bromid bằng phương pháp tổng hợp hóa học 1.2. Aspergillus oryzae Chi Aspergillus Aspergillus là một trong những chi nấm được nghiên cứu nhiều nhất với khoảng 200 loài và phát tán khắp mọi nơi trong tự nhiên [1]. Aspergillus có dạng hình sợi, phân nhánh, khuẩn ty có vách ngăn, không màu, màu nhạt hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định trên khuẩn lạc. Sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm sinh sản phình to ra tạo thành các tế bào hình chai, phía trên mọc các cuống sinh bào tử đính. Các bào tử đính xòe ra như những bông hoa cúc [2]. Các loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm công nông nghiệp, ở nhiều vùng địa lý khác nhau nên chúng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực. Một số loài, đặc biệt là loài A. oryzae đã được sử dụng nhiều trong công nghiệp lên men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản. Một số loài thuộc chi Aspergillus như: A. niger, A. oryzae đã và đang được sử dụng trong công nghệ sinh học để sản xuất enzym như amylase, chitinase, protease, cellulase, pectinase; trong công nghiệp sản xuất chế 6 biến thực phẩm như: tương chao, nước mắm, nước tương; trong công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như: acid citric, acid gluconic [2]. Một số loài thuộc chi Aspergillus khác có khả năng tạo chất kháng sinh, như A. fumigatus tạo thành fumagilin có tác dụng lên Entamoabae histolyca; A. humicola, A. nidulans tạo thành humicolin, nidulin có tác dụng ức chế đối với với các loại vi khuẩn... Trong số các chất này thực sự dùng trong công nghiệp dược phẩm hiện nay chỉ có loài A. fumigatus sản xuất fumagilin làm thuốc chữa lị amip. Nhiều loài thuộc chi Aspergillus có khả năng biến đổi sinh học, một số khác tạo ra các loại độc tố, đặc biệt chú ý tới loại độc tố gây ung thư gan như loài A. flavus, A. paraciticus tạo thành aflatoxin. Chủng A. niger GM156 (ĐB106) là một chủng đột biến của chủng hoang dại A. niger GM56, có khả năng sinh tổng hợp xylanase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp. Xylanase là một loại enzym quan trọng được dùng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp và gần đây được sử dụng nhiều để tăng trọng trong chăn nuôi [2]. Loài Aspergillus oryzae Một số chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus được sử dụng trong công nghệ lên men, sản xuất enzym (amylase, protease, pectinase…) và các acid hữu cơ (acid citric, acid gluconic…) trong đó có Aspergillus oryzae. Apergillus oryzae thuộc chi Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm [4]. Nấm Aspergillus oryzae có cấu tạo đa bào, sinh sản bằng bào tử, không sinh độc tố aflatoxin và tạo hương tốt. Khi mới phát triển hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển sang màu vàng, khi già thì chuyển hẳn sang màu xanh lục, phân nhánh có vách ngang chia sợi thành nhiều tế bào sợi mảnh, chiều ngang sợi khoảng 5 – 7 µm. Từ những sợi nằm ngang hình thành những sợi thẳng đứng gọi là cuống đính bào tử, ở đầu có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus oryzae thường dài 1,0 – 2,0 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử dính vào nhau, gọi là đính bào tử, có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau (dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia). Đây chính là đặc trưng ở nấm mốc Aspergillus oryzae [4]. 7 (a) (b) (c) Hình 1.3. Bào tử Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi quang học (a), (b) (môi trường Czapek) và dưới kính hiển vi điện tử (c) [25]. Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử của Aspergillus oryzae là 45%, nhiệt độ thích hợp trong khoảng 28℃ – 32℃, độ ẩm không khí 85-95%, pH môi trường từ 5,5 đến 6,0, hoàn toàn hiếu khí. Nấm mốc phải trực tiếp sử dụng các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để phát triển và đảm bảo hoạt động bình thường [4]. Aspergillus oryzae có các enzym thủy phân nội bào và ngoại bào như amylase, glucoamylase, protease, pectinase, xylanase, hemicellulase... Trong đó hệ enzym amylase tổng hợp từ Aspergillus oryzae có hoạt lực cao hơn so với một số chủng nấm mốc và vi khuẩn khác. Ngoài ra Aspergillus oryzae có khả năng tổng hợp cả ba loại enzym protease (acid, kiềm và trung tính). Chủng Aspergillus oryzae là loại nấm sợi quan trọng trong công nghiệp, cách đây hàng trăm năm nó được dùng để lên men rượu sake, pate đậu phộng, nước tương ở Nhật. Người ta nhận ra rằng Aspergillus oryzae lên men tương ngon hơn so với một số chủng khác vì chúng có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm tương có vị ngọt. Aspergillus oryzae đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ lên men truyền thống ở nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin, Indonesia và Việt Nam. Cho đến thời điểm này thì chủng nấm mốc Aspergillus oryzae đã được đưa vào sử dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất enzym (α-amylase, glucoamylase) và trong các ngành chế biến thực phẩm. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nấm mốc phải trực tiếp sử dụng các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để tổng hợp các chất cần thiết và chịu tác động từ các yếu tố bên ngoài. Để nghiên cứu và ứng dụng Aspergillus oryzae vào sản xuất, cần hiểu được ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng cũng như các điều kiện nuôi cấy khác lên sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh sản phẩm của chúng. 8 1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men Mỗi một quá trình lên men vi sinh vật đều cần các môi trường lên men khác nhau, tuy nhiên có một số thành phần cơ bản nhất định phải có trong tất cả các môi trường lên men. Để vi sinh vật phát triển, thành phần môi trường lên men phải có: nước, nguồn carbon, nguồn nitơ, chất khoáng, nguyên tố vi lượng và oxy (nếu quá trình lên men là hiếu khí). Đối với quá trình lên men Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic, các thành phần cơ bản sử dụng được mô tả trong bảng sau: Bảng 1.1. Các thành phần cơ bản trong môi trường lên men để sản xuất acid kojic từ Aspergillus oryzae [18], [36]. Thành phần Nguồn Carbon Glucose, sucrose, fructose, mannose, galactose, xyloza, arabinose, sorbitol, acetat, ethanol, maltose, tinh bột … Nitơ Cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4, NH4NO3… Chất khoáng KH2PO4, MgSO4.7H2O, ZnSO4, CuSO4.5H2O… Oxy Không khí vô trùng (thông qua sục khí) Nguồn carbon không chỉ đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng và duy trì sự sống cho vi sinh vật trong quá trình lên men, mà còn là cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp acid kojic. Việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau trong môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae. Nồng độ nguồn carbon ban đầu trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh acid kojic: nồng độ quá thấp sẽ không đáp ứng đủ nhu cầu của vi sinh vật còn nồng độ quá cao sẽ làm cho môi trường trở nên ưu trương, cản trở hoạt động sinh lý của tế bào [36]. Việc sử dụng các nguồn nitơ khác nhau trong môi trường nuôi cấy ban đầu ảnh hưởng đáng kể đến lượng acid kojic thu được. Sự thay đổi tỉ lệ C/N trong môi trường nuôi cấy có thể dẫn đến sự ức chế hoặc tăng cường khả năng tổng hợp acid kojic. Nhiều báo cáo cho rằng tỉ lệ C/N cao hơn 100 là điều cần thiết cho việc nâng cao sản lượng acid kojic [20], [30], [32], [36]. Bởi vì nếu sử dụng cao nấm men hoặc pepton với nồng độ cao trong môi trường lên men ban đầu thì glucose sẽ không thể chuyển hóa thành 9 acid kojic được, mà thay vào đó nó sẽ tập trung cho sự tăng trưởng của tế bào vi sinh vật. [36], [39]. Ngoài các hợp chất carbon và nitơ, cần cung cấp một lượng cần thiết các chất khoáng và nguyên tố vi lượng vào môi trường lên men ban đầu để vi sinh vật tăng trưởng tốt và sản xuất ra các chất chuyển hóa mong muốn. Tuy nhiên các chất này không được bổ sung trực tiếp mà được bổ sung vào môi trường lên men dưới dạng muối. Môi trường Czapek-Dox chứa KH2PO4, KCl, NaNO3, MgSO4 và FeSO4.7H2O là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật (A. oryzae và A. flavus) và sản xuất acid kojic. Một trong những chất dinh dưỡng quan trọng cho sự phát triển của hầu hết các loại nấm là phospho. Phospho có trong các phân tử như acid nucleic, phospholipid, đường phosphat và đóng một vai trò thiết yếu trong chuyển hóa năng lượng [36]. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy Ngoài ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng thì điều kiện nuôi cấy cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành acid kojic trong quá trình lên men nấm mốc Aspergillus oryzae. Nhiệt độ là một trong những thông số ảnh hưởng đến quá trình lên men nấm mốc Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic. Mỗi vi sinh vật phát triển trong một khoảng nhiệt độ thích hợp, nếu nằm ngoài khoảng nhiệt độ đó thì vi sinh vật sẽ bị hạn chế sự phát triển. Nếu nhiệt độ quá thấp, nó sẽ tác động lên khả năng chuyển hoá các hợp chất, làm ức chế hoạt động của các hệ enzym, thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì thế làm vi sinh vật mất khả năng phát triển và ảnh hưởng đến quá trình sản xuất acid kojic. Mặt khác nhiệt độ quá cao gây biến tính protein, làm hệ enzym lập tức không hoạt động được, do đó vi sinh vật sẽ bị chết một cách nhanh chóng. Ngoài nhiệt độ, pH môi trường cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và hình thành sản phẩm trong quá trình lên men nấm mốc A. oryzae. Sự lên men acid kojic có thể chia làm hai giai đoạn: giai đoạn tăng trưởng và giai đoạn sản xuất. Trong giai đoạn tăng trưởng, các enzym liên quan đến con đường chuyển hóa acid kojic được tạo ra, sau đó acid kojic được tổng hợp bằng cách chuyển đổi trực tiếp từ glucose thông qua các phản ứng đa pha của các enzym này mà không bị phân cắt thành từng mảnh nhỏ [40]. pH môi trường lên men sẽ làm ảnh hưởng đến tính thấm qua màng, hoạt động chuyển hóa vật chất trong tế bào vi sinh vật, ảnh hưởng tới hoạt tính enzym, do đó làm ảnh 10 hưởng đến sự phát triển của A. oryzae cũng như quá trình sản xuất acid kojic. Do đó cần một điều kiện pH thích hợp trong suốt giai đoạn tăng trưởng và sản xuất. 1.4. Một số nghiên cứu về khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae  Nghiên cứu ở nước ngoài Kitada và cộng sự (1967) đã khảo sát việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau như tinh bột, saccarose, fructose, glucose, xyloza trong quá trình lên men nấm mốc Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic. Kết quả thu được đều cho thấy rằng: vi sinh vật có khả năng phát triển tốt trong những môi trường trên, tuy nhiên trong quá trình lên men bằng tinh bột, fructose và xyloza thì không sinh ra acid kojic. Ngoài ra, trong quá trình lên men sử dụng glucose làm nguồn carbon, sản lượng acid kojic thu được là cao nhất [29], [36]. Nhóm tác giả cũng đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose dao động từ 25 - 150 g/L khi sản xuất acid kojic từ nấm mốc Aspergillus oryzae. Mặc dù lượng tế bào vi sinh vật tối đa không thay đổi đáng kể ở mức trên 50 g/L nhưng lượng acid kojic cao nhất thu được tại nồng độ 100 g/L glucose, cho hiệu suất 0,24 g acid kojic / 1g glucose [30], [36]. Rosfarizan và cộng sự đã chỉ ra rằng nguồn nitơ hữu cơ thường tốt hơn các nguồn nitơ vô cơ cho quá trình lên men sản xuất acid kojic [36], [39]. Kitada và cộng sự nhận định pepton là nguồn nitơ hữu cơ thuận lợi nhất để sản xuất acid kojic từ quá trình lên men Aspergillus oryzae [30]. Kwak và Rhee (1992) đã báo cáo rằng nhiệt độ tối ưu cho quá trình sản xuất acid kojic trong hầu hết các trường hợp là từ 25oC-30oC [32]. Hassan và cộng sự đã xác định 30oC là nhiệt độ tối ưu cho quá trình sản xuất acid kojic từ lên men chủng Aspergillus oryzae var. effusus NRC14 [24]. Kitada và cộng sự (1967) cũng chỉ ra pH tối ưu để sản xuất acid kojic còn phụ thuộc vào loại carbon hoặc nitơ sử dụng; các nhà nghiên cứu này đã xác định khi sử dụng amoni nitrat làm nguồn nitơ thì lượng acid kojic tối đa đạt được ở pH=3,08 [30], [36]. Ngoài ra, Arnstein và Bentley đã báo cáo rằng nồng độ phosphat trong môi trường nuôi cấy ban đầu cũng ảnh hưởng đáng kể đến việc sản xuất acid kojic của Aspergillus oryzae. Các tác giả chứng minh rằng khi sử dụng phosphat với nồng độ cao (0,55 – 13,72 mM) trong môi trường nuôi cấy sẽ thu được tỉ lệ acid kojic cao hơn so với khi sử dụng phosphat với nồng độ thấp (0,0055 – 0,055 mM) [9]. 11  Nghiên cứu ở trong nước Ở Việt Nam, các nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae còn khá ít hoặc chưa được công bố nhiều. Nhóm tác giả Trương Phương (tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh) đã công bố đề tài điều chế kojic dipalmitat gồm hai phần: “Sàng lọc chủng Aspergillus oryzae và nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận acid kojic” và “Tổng hợp ester – kojic dipalmitat” đăng tải trên Tạp chí Dược học (2013). Trong báo cáo “Sàng lọc chủng Aspergillus oryzae và nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận acid kojic”, với phương pháp lên men trong môi trường lỏng được lắc với tốc độ 200 vòng/ phút, nhóm tác giả này đã ghi nhận chủng Aspergillus oryzae 4F được phân lập từ mẫu cơm, bánh mì tại quận Bình Thạnh, Thành phố Hồ Chí Minh cho nồng độ acid kojic cao nhất (36,25 g/l) và lựa chọn điều kiện lên men thích hợp với chủng 4F: nuôi cấy tại nhiệt độ 30℃, sử dụng glucose làm nguồn carbon với nồng độ 100 g/l, sử dụng pepton casein làm nguồn nitơ với nồng độ 2,5 g/l trong thời gian 15 ngày [7]. Ngoài ra, trong đề tài “Khảo sát khả năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae”, dược sĩ Nguyễn Thị Huyền cũng đã tiến hành chiết tách, định tính acid kojic từ dịch nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae và lựa chọn nồng độ glucose thích hợp cho quá trình lên men sinh acid kojic là 10%, thời gian nuôi cấy là 12 ngày [3]. 12